KUNCI AWAL IDENTIFIKASI BAKTERI (morfologi koloni, morfologi sel dan pewarnaan gram).Pada saat kita mendapatkan tugas untuk mencari tahu jenis suatu isolat bakteri, maka hal pertama yang dilakukan adalah mengamati ciri-ciri morfologi koloni, morfologi sel dan sifat gramnya. Pastikan isolat yang akan diuji adalah kultur murni, benar-benar murni dan telah yakin tentang kemurniannya. Jadi jika diperoleh suatu kultur murni dari suatu lingkungan dan diyakini belum murni maka haruslah diisolasi ulang, maksudnya dimurnikan lagi sampai benar-benar pasti. Lihat gambar berikut :

1 jika tidak yakin benar ini kultur murni atau tidak. 2 lakukan streak kuadran, minimal ke dua cawan (karena kalau salah satu gagal membentuk koloni tunggal, maka masih ada cadangannya). 3 lihat hasil streak kuadran, apakah tampak koloni tunggal?, koloni tunggal adalah koloni yang timbul/tumbuh dari satu sel atau beberapa kumpulan sel (untuk staphylococcus misalnya), bukan dari beberapa ratus sel. Istilah yang paling mendekati adalah CFUs. Jadi dipastikan satu koloni itu adalah satu jenis bahkan satu strain. Umumnya koloni tunggal itu kecilkecil(misalnya E.coli,1-2mm), ada juga yang besar. Faktor-faktornya mungkin adalah kecepatan pertumbuhannya dan stuktur sel itu sendiri (bayangkan sel E.coli yang sendiri-sendiri akan mudah terpisah saat digoreskan ke permukaan agar dibanding sel streptococcus. 4 jika didapatkan koloni tunggal, segera diamankan dengan menumbuhkan pada media baru (minimal 5). Kenapa harus banyak?, karena untuk menanggulangi cawan yang kontaminan, membuat stok kultur dan mencegah kejadian yang tidak diinginkan (kehilangan cawan misalnya). 5 setiap menumbuhkan ke medium baru, sebaiknya harus dicek koloninya, apakah sama dengan cawan induknya atau tidak. Jika perlu cek juga morfologi selnya. 6 sekarang kita telah memiliki beberapa kultur murni dan siap untuk diidentifikasi. Salah satu cawan dari kultur murni tersebut lalu dikarakterisasi morfologi koloninya. Ciri-ciri koloni yang perlu diperhatikan dan dicatat yaitu bentuk koloni, tepian koloni, elevasi dll. dapat dilihat disini. Tapi perlu diingat jika hanya mencatat karakteristik berdasarkan ciri di atas, kita

tidak terlalu hafal oleh karena itu perlu untuk digambar. Menggambar koloni itu tidak mudah. Yang perlu digambar adalahkoloni tunggal, bukan koloni yang besar.jika menginginkan hasil lebih bagus sebaiknya memakai kamera dijital. Umumnya koloni tunggal itu kecil-kecil dengan satuan mm. Jadi beberapa saran untuk menggambar koloni yaitu:

1. cari koloni tunggal lalu gambar hati-hati dengan pensil (sebaiknya dengan skala 1:1) tanpa perbesaran. Gambar dengan mata telanjang. 2. gambar koloni lebih detail dengan mikroskop stereo atau mikroskop cahaya. Saya sarankan untuk menggunakan mikroskop cahaya. Mula-mula dengan perbesaran 4X10. jika menggunakan mikroskop cahaya penempatan cawan di meja benda harus hati-hati. Perlu digambar tampak atas dan bawah cawan. Jika menginginkan perbesaran yang lebih tinggi dapat digunakan perbesaran 10X10, tapi jangan sampai lensa mengenai media atau biakan. (bacaan lebih lanjut tentang morfologi koloni ada di sini)

Saya yakin setelah melakukan hal di atas Anda akan merasa lebih dekat, lebih memiliki, lebih intim terhadap bakteri yang diteliti. Sering saya melihat mahasiswa mengkarakterisasi koloni hanya dengan mencatat cirinya dan menggambar seadanya. Setelah koloni dikarakterisasi, dilanjutkan dengan memperhatikan bentuk sel. Ini merupakan tahap dimana menuntut mata untuk berlelah-lelah di mikroskop.Untuk melihat sel maka hal yang harus dilakukan : o Membuat preparat ulas. Saya sarankan jangan membuat preparat ulas dari biakan cair, karena dikhawatirkan yang tumbuh bukan yang kita harapkan. Buatlah preparat ulas dari biakan padat (koloni tunggal) sehingga milyaran bakteri dalam preparat ulas tersebut adalah satu jenis. Fiksasi di atas api sebaiknya jangan dilakukan terlalu lama. Intinya fiksasi adalah menguapkan air di atas slide, bukan membakar slide dengan api. Dikhawatirkan panas akan mempengaruhi struktur sel.

o Melihat dengan mikroskop. Apakah Anda menginginkan melihat sel tersebut dalam keadaan hidup atau mati? Jika hidup keuntungannya adalah dapat mengecek motilitasnya. Namun sel bersifat transparan dan sulit terlihat bagi mata yang tidak terlatih. Jika mati (hasil fiksasi) maka sel dapat diwarnai dengan zat pewarna dan akan terkonsentrasi untuk melihat morfologinya saja. Untuk melihat sel gunakan 100X10. Catatan : ada beberapa catatan pentingyang terkait dengan keahlian mencari lapang pandang yang relevan, bagus dan jelas. =Kadang-kadang waktu membuat preparat ulas, kita seringkali menyebarkan suspensi tidak merata (seperti gambar). Kita harus tahu kira-kira dimana tempat/letak lapang pandang yang menampakkan sel-sel terpisah satu sama lain.untuk mendapatkan gambar yang bagus, harus dicari dimana kira-kira bagian slide yang memiliki jumlah sel yang tepat. Pada saat perbesaran 4X10, geser-geser dan cari daerah pinggiran, maksudnya jika pemfiksasian tidak rata pasti terdapat penumpukan sel di suatu tempat atau pengonsentrasian sel, jadi kalau memilih di pinggir, kita dapat melihat sel-sel yang jelas. =Seingkali ditemukan pada preparat ulas basah (hidup) sel dari bakteri bacilli yang berbentuk coccus.. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan object glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacilli yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar 2D. Lihat gambar

=Gunakan kontrol. Kontrol sangat penting, meskipun sulit untuk mendapatkannya. Akan lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Data yang dihasilkan sampai tahap ini berupa karakteristik morfologi koloni dan sel yang dapat dipercaya. Tahap selanjutnya berupa pewarnaan gram. Pewarnaan gram menurut saya tidak hanya menambahkan semua pewarna dan reagen secara berurutan tetapi kita harus dapat membayangkan apa yang terjadi dengan bakteri tersebut.

Sebelum melakukannya, hal yang harus diperhatikan adalah: Cek tanggal pembuatan zat warna dan reagen, umumnya zat warna lebih tahan lama. Namun lebih baik menggunakan yang baru. Paling tidak tidak lebih dari setengah tahun. Persiapkan kontrol, kontrol yang ampuh adalah E. coli dan B. Subtilis. Kontrol juga harus dalam keadaan murni. Kontrol juga dapat diperoleh dengan mengambil lapisan film langit-langit mulut atau gigi. Di dalamnya mengandung bakteri gram positif dan negatif. Namun sering kali sulit membedakan antara kotoran dan bakteri. Pastikan semua kultur berumur tidak lebih dari 24 jam. Kultur muda lebih baik dari kultur tua karena seringkali gram positif kehilangan kemampuan membentuk dinding selnya pada kultur tua. CV-----------;Kalium Iodida-----------Alkohol 95%--------Safranin Inti dari pewarnaan gram adalah membedakan sifat kulit sel dalam mempertahankan kompleks CV-KI dari pelunturan (dekolorisasi) oleh etanol/alkohol 95%. Jadi dengan menganalisa dan membuat tahapan ini menjadi meyakinkan sebenarnya sudah cukup untuk mengambil kesimpulan tentang sifat gram bakteri uji. Pengontras hanya untuk memperkuat perbedaan saja. Saran1

Hasil tiap perlakuan dilihat dengan mikroskop sehingga dapat benar-benar tahu apa yang terjadi pada sel. Warna CV sebelum ditambah KI berwarna ungu cerah, tapi setelah ditambah KI menjadi biru kehitaman. Saran 2

. Benar-benar diperhatikan tahapan paling krusial dalam pewarnaan gram yaitu dekolorisasi. Alkohol dapat diteteskan pada sela-sela cover glass dan object glass sehingga dapat diamati detik-detik terjadinya pelunturan. Disarankan dari berbagai sumber pelunturan dilakukan selama 5 detik dan ada yang menyebutkan 10 detik. Bakteri gram+ tidak selalu dapat mempertahankan kompleks CV-KI, namun hanya mempertahankannya lebih lama dibanding gram-. Jadi

diperlukan stopwatch untuk menghitung waktu pelunturan dari bakteri uji dan kontrol. Untuk menekan kesalahan lakukan hal ini beberapa kali. Saran 3 Buatlah preparat ulas dari ketiga bakteri (kontrol +&- dan uji) dalam satu slide. Usahakan jangan sampai tercampur dan dalam satu luasan cover glass melingkupi ulasan 3 bakteri ini. Tujuannya supaya memudahkan dalam membandingkan bakteri uji dengan kontrol dan juga memperkecil kesalahan saat pelunturan karena semua bakteri diberi perlakuan yang sama. Saran 4. kroscek hasil pewarnaan gram konvensional dengan metode lain yaitu dengan KOH 3%. untuk bacaan metode KOH lebih lanjut ada di sini. Setelah tahapan ini selesai maka didapatkan data yang diyakini benar, kemudian dapat dilanjutkan ke pengerucutan identifikasi berikutnya dengan melihat BERGEYS, kitabnya para bacteriologist. Bagi yang membaca tips ini diharapkan memberikan saran, terutama yang lebih ahli.. E. Indra Pradhika, 2008

RANGKUMAN METODE IDENTIFIKASI BAKTERIby Yumna 1. 1.1. GRAM POSITIVE COCCI Staphylococcus aureus

Staphylococci yang bersifat patogenik umumnya menyebabkan infeksi akut baik pada manusia maupun hewan. Spesies yang menyebabkan infeksi akut pada manusia antara lain Staphyloccus aureus. Salah satu cara yang paling umum digunakan untuk mengidentifikasi organisme ini adalah berdasarkan kemampouan bakteri untuk menggumpalkan plasma Beberapa metode identifikasi : Pengecatan Gram Kokus (coccus) Gram positif dengan susunan bergerombol seperti anggur (clumps) Tes katalase positif. Jika katalase negatif, lihat pada bab Streptococcus danEnterococcus Staphylococcal latex agglutination test positif. S. Ludgunensis dan S. Schleiferi juga dapat memberikan hasil positif pada tes aglutinasi lateks ini. Jika hasil meragukan, lakukan tube coagulase test. Tube coagulase test Lakukan tube coagulase test jika ada keraguan pada hasil test aglutinasi lateks Staphylococcus (Staphylococcal latex agglutination test) 1.2. Coagulase negative Staphylococci

Strain ini dapat menyebabkan infeksi yang berkaitan dengan pemakaian kateter vaskuler dan peralatan prostesis implan lainnya (implanted prosthetic devices). Beberapa metode identifikasi : Pengecatan Gram Kokus (coccus) Gram positif dengan susunan bergerombol seperti anggur (clumps) Tes katalase positif. Jika katalase negatif, lihat pada bab Streptococcus danEnterococcus Staphylococcal latex agglutination test negatif Tube coagulase test Lakukan tube coagulase test jika ada keraguan pada hasil test aglutinasi lateks Staphylococcus (Staphylococcal latex agglutination test) Tes lanjutan untuk identifikasi isolat yang signifikan secara klinis Identifikasi dengan mesin VITEK 1.3. Staphylococcus saprophyticus

S. saprophyticus adalah bakteri patogen di saluran kemih (traktus urinarius) terutama pada wanita muda. Biasanya bakteri ini resisten terhadap antibiotik novobiocin, namun pada spesies klinik lainnya, resistensi tersebut jarang ditemukan.

Beberapa metode identifikasi : Pengecatan Gram Kokus (coccus) Gram positif dengan susunan bergerombol seperti anggur (clumps) Tes katalase positif. Jika katalase negatif, lihat pada bab Streptococcus danEnterococcus Staphylococcal latex agglutination test negatif. Isolat dapat mengalami ko-aglutinasi Tube coagulase test Lakukan tube coagulase test jika ada keraguan pada hasil test aglutinasi lateks Staphylococcus (Staphylococcal latex agglutination test) Untuk isolat yang berasal dari saluran kemih, lakukan novobiocin resistance test, dengan menggunakan metode CLSI Disc Diffusion Test. Resisten terhadap novobiocin ditunjukkan dengan terjadinya zona hambatan dengan diameter < 16 mm Tes lanjutan untuk identifikasi isolat yang signifikan secara klinis Identifikasi dengan mesin VITEK

1.4.

Streptococcus sp

Streptococci dapat diisolasi dari saluran pencernaan, pernafasan dan saluran genital sebagai bagian dari bakteri komensal atau flora normal. Beberapa spesies dapat bersifat patogen, antara lain adalahStreptococcus pyogenes (Streptococcus grup A) yang merupakan patogen utama pada manusia dan Streptococcus agalactiae(Streptococcus grup B) dapat menyebabkan infeksi pada neonatus. Beberapa metode identifikasi : Pengecatan Gram Kokus (coccus) Gram positif dengan susunan berpasangan seperti rantai (chains). Tes katalase negatif. Jika katalase positif, lihat pada bab Staphylococcus aureusdan Staphylococcus sp Sifat hemolisis. Tentukan sifat hemolisis bakteri berdasarkan reaksi terhadap sel eritrosit pada media agar darah. - Hemolisis alfa : terbentuk zona hambatan di sekeliling koloni berwarna kehijauan sampai kecoklatan. Diskolorisasi medium ini terjadi akibat destruksi eritrosit parsial. - Hemolisis beta : terbentuk zona hambatan yang jelas, tidak berwarna (colourless) di sekitar koloni akibat destruksi eritrosit secara sempurna. Beberapa strain dapat melakukan hemolisis sempurna (maksimal) dalam keadaan anaerob, karena hemolisin yang diproduksi oleh beberapa strain tersebut bersifat labil jika ada oksigen. - Hemolisis gamma atau non hemolitik : tidak terjadi hemolisis eritrosit atau tidak terjadi diskolorisasi media agar darah -- to be continued Tes lanjutan untuk identifikasi isolat yang signifikan secara klinis Identifikasi dengan mesin VITEK

1.5.

Streptococcus pneumoniae

MEDIA Teori dasar : Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangbiakan pada suatu substrat yang dinamakan medium. Medium untuk pertumbuhan mikroba ini memenuhi persyaratan nutrien yang dibutuhkan mikroba tersebut. Kebutuhan dasar mikroba antara lain : air, karbon, energi, mineral, dan faktor tumbuh. Penggolongan media : Secara garis besar dibedakan menjadi 2 yaitu : Media hidup Media buatan, yaitu media yang dibuat dari kumpulan zat-zat tertentu. Media buatan di bagi menjadi 3, 1. Berdasarkan susunan kimia Media anorganik Media organic Media sintetik Media non sintetic 2. Berdasarkan konsistensi Media cair / liquid Media padat / solid Media setengah padat / semi solid 3. Berdasarkan fungsinya Media diperkaya Media selektif Media penyubur Media exclusive Media identifikasi Media terdiri dari 3 macam bentuknya, yaitu : medium cairan, padatan, dan semisolid. Perbedaan ini disebabkan oleh ada tidaknya bahan pemadatan. Bahan pemadatan dapat berupa amilum, gelatin, selulosa, dan agar-agar. Agar-agar adalah media yang paling umum digunakan. Medium cairan tidak menggunakan bahan pemadat sedangkan medium padatan dan semisolid menggunakan bahan pemadat. Pengertian Media Media adalah pembenihan substrat atau dasar makanan untuk menumbuhkan dan membiakkan suatu mikroorganisme. Media yang baik bagi pemeliharaan mikroorganisme ialah yang mengandung unsure-unsur makanan yang diperlukan, dapat berupa garam-garam anorganik seperti protein, peptone, asam-asam amino dan vitamin-vitamin. Bahan-bahan makanan yang disediakan untuk menumbuhkan mikroorganisme disebut kultur media. Sedangkan mikroorganisme yang tumbuh dan berkembang biak pada suatu kultur media disebut kultur. Fungsi Media Media dapat berfungsi untuk membiakkan, mengasingkan dan meyimpan mikroorganisme dalam waktu yang lama di laboratorium. Media juga dapat berfungsi untuk mempelajari sifat-sifat koloni/pertumbuhan, sifat-sifat biokimiawi mikroorganisme. Selain itu dalam laboratorium mikrobiologi kedokteran dapat berfungsi untuk pembuatan antigen, toksin dan untuk pasasi kuman dengan tujuan perubahan virulensi dan lain-lain.

Syarat-syarat membuat media Syarat-syarat yang perlu diperhatikan dalam membuat media adalah : 1. Media harus mengandung semua unsur makanan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroorganisme. 2. Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan, dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme. 3. Media harus dalam keadaan steril sebelum ditanami mikroorganisme yang dimaksud, jadi tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang lain yang tidak diharapkan 4. Tidak mengandung zat penghambat. 5. Temperature / suhu sesuai. Komposisi Media Di Laboratorium mikrobiologi, untuk pekerjaan rutin biasanya dibuatkan media standar yang terdiri dari : kaldu, pepton, karbohidrat. Jika diperlukan media padat, dapat ditambahkan agar. Media standar ini disediakan untuk mempermudah macam-macam media yang dikehendaki sesuai dengan tujuannya. Misalnya membuat media agar miring, untuk membiakkan mikroorganisme, media agar darah untuk membiakkan kuman yang memerlukan darah, media agar dam lempeng, untuk melihat hemolisis dan lain-lain. Pada hakekatnya komposisi media yang baik adalah sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme seperti pada habitat aslinya (kondisi alamiah). Oleh karena itu, jika ingin membiakkan mikroorganisme yang dapat hidup di usus manusia misalnya, maka harus menggunakan media tertentu yang dapat hidup diusus manusia misalnya, maka harus menggunakan media tertentu yang dilakukan dengan bermacam-macam media diperkaya, media selektif , dan media differensial. Sedangkan pengereman (inkubasi) media harus dilakukan pada suhu 370 C, yaitu suhu yang sesuai dengan tubuh manusia. Dewasa ini untuk keperluan penelitian maupun pekerjaan di laboratorium banyak dipermudah dengan adanya bermacam-macam media yang tersedia dalam bentuk serbuk kering. Serbuk kering ini sudah siap dipakai.artinya tidak perlu lagi menentukan pH nya, sebab hal ini sudah dilakukan terlebih dahulu pada pembuatan serbuk. Sehingga untuk menyiapkan media cukup mengikuti aturan pakai yang dituliskan pada tabel. Misalnya sekian gram serbuk kering dilarutkan dalam sekian liter mililiter air suling, kemudian disterilkan. MEDIA UNTUK NEISSERIA GONORRHOE 1. MEDIA SELEKTIF Media selektif (selective medium) adalah media yang ditambah zat kimia tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain sehingga dapat mengisolasi mikroba tertentu, misalnya media yang mengandung kristal violet pada kadar tertentu, dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi bakteri gram negatif. Media ini selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Media selektif yang digunakan untuk kuman Neisseria gonorrhoe adalah THAYER MARTIN. Komposisi Thayer martin : Vankomisin , media yang mampu menghambat pertumbuhan kuman bentuk coccus gram (+), meskipun beberapa organisme Gram-positif seperti Lactobacillus dan Pediococcus secara intrinsik tahan; Colistin , yang ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan kuman bentuk batan gram (-) , kecuali organisme

Neisseria, meskipun beberapa organisme Gram-negatif lainnya seperti Legionella juga tahan; Nistatin , yang dapat membunuh sebagian jamur . Kotri , yang menghambat organisme Gram-negatif, terutama mengerumuni proteus 2. MEDIA TRANSPORT Media transport adalah perbenihan yang digunakan untuk mengirim specimen dari satu tempat ke laboratorium. Media transport yang digunakan untuk kuman Neisseria gonorrhoe adalah Carry and Blair Komposisi Carry and Blair : Sodium thioglycollate 1,5 gr Disodium phosphate 1,1 gr Sodium chloride 5,0 gr Agar 5,0 gr Calcium chloride 1% 9,0 ml Distilled water 1000 ml Cara pembuatan media : Larutkan dengan pemanasan 1,5 gr disodium phosphatase, 5 gram sodium chloride dan 5 gr agar-agar dalam 990 ml air suling. Dinginkan sampai 50C dan tambahkan 9 ml calcium chloride 1% sampai ph mencapai 8,4. Uapkan selama 15 menit dalam waterbath. Sterilkan di autoclave 121C selama 15 menit. .biarkan agak dingin, tuang secara aseptis dengan pembakar 3. MEDIA PENYUBUR Adalah perbenihan yang digunakan untuk memperbanyak bakteri baik yang ada didalam spesimen. Media penyubur yang digunakan untuk kuman Neisseria gonorrhoe adalah KPD Komposisi KPD : Air pepton : Pepton 10 gram Nacl 5 gram Aquadezt 1 liter Darah 5% Cara pembuatan : Larut pepton dan natrium klorida dalam air aquades dengan pemanasan. menyesuaikan pH sampai 7,2. Pindahkan dalam tabung tes , sterilkan dengan autoklaf pada 121C selama 15 menit.Tambahkan darah 5% dan 4. MEDIA IDENTIFIKASI Adalah perbenihan yang hanya dapat ditumbuhi segolongan bakteri saja, sedangkan bakteri lain nya tidak tumbuh dan dapat dibedakan koloni spesies satu dengan yang lainnya. Media identifikasi yang digunakan untuk kuman Neisseria gonorrhoe adalah BAP Komposisi media BAP: Nutrient agar 100 ml Darah domba 10 ml Cara pembuatan media BAP : Sterilkan petri sesuai kebutuhan (oven 175C selama 90 menit).

Lakukan penimbangan sesuai perhitungan, masukkan becker glass. Tambahkan aquadest yang sudah diukur. Tutup Erlenmeyer dengan kapas. Masukkan ke dalam waterbath. Ukur ph dengan kertas ph, sesuaikan dengan ph media. Tutup mulut Erlenmeyer dengan kertas dan karet. Sterilkan di autoclave 121C selama 15 menit. Biarkan agak dingin, tambahkan secara aseptis darah 5% (dalam 100 ml media mengandung 5 ml darah) campur. Tuang secara aseptis ke petri steril. Biarkan memadat, bungkus dengan kertas dengan posisi terbalik, simpan dalam almari es.