Sel / jaringan tdri dr molekul2 kimiaMolekul kimia bereaksi dgn zat warna pengendapan (menghasilkan warna yang spesifik)Tujuan: menetapkan karakteristik (lokasi/aktivitas) molekul kimia tertentu dalam sel/jaringanBerbeda dgn uji biokimia, karakteristik molekuler dpt diamati scr in situ

Uji histokimia terhadap karbohidratUji histokimia terhadap lipidUji histokimia terhadap asam nukleatUji histokimia terhadap protein/enzimUji histokimia terhadap ion

Karbohidrat tersebar di dlm jar tubuh: permukaan sel, dlm sitoplasma & matriks ekstraselKarbohidrat adalah senyawa yang penting dalam jaringan sebagai penanda/pengenal yang penting di permukaan selKeadaan jaringan yang patologis terjadi perubahan jml karbohidrat yang tertimbun di jaringan tsb

Contoh Karbohidrat Penyusun Sel/JaringanGlukosa: darah & cairan tubuh lainnya.Glukosamin (derivat gula amino): penyusun utama cangkang Crustacea (kitin)Galaktosamin (derivat gula amino): komponen tulang rawanGlikogen: hepar, otot dan fetusGlikoprotein: penyusun tendo & ligamentumCerebrosida (golongan senyawa glikolipid): otak (di substansia alba) & serabut-serabut myelin.

Selulosa: sebagian besar terdapat dalam sel tumbuhan. Pada beberapa spesies hewan: tractus digestivus siput (Helix pomatia)Asam Hyaluronat (golongan senyawa mukopolisakarida): substansi dasar jaringan pengikat, cairan pleura dan dalam Whartons Jelly dari funiculus umbilicalis (tali pusat fetus)Asam heksuronat (golongan senyawa mukopolisakarida): gastric mucin pada babi, heparin & mucoid pada kornea mataMukoprotein: gastric mucin babi, mukoid kelenjar submaksilaris & gonadotropin

FiksasiHanya karbohidrat gol polisakarida yang dpt difiksasiFiksatif yang dpt digunakan:Larutan campuran formalin & asam pikrat (lart. Bouin)Formalin dinginLarutan campuran formalin netral & alkohol 95% (1:9)Fiksasi dilakukan pd suhu rendah (40C)

Periodic Acid Schiff (PAS)Mrp metode yang plg umum dilakukan utk deteksi karbohidrat netral (glikogen, glikoprotein & proteoglikan)Prinsip reaksi: asam perjodat (HJO4) bereaksi dgn ikatan C karbohidrat ikatan C pecah aldehid yang bereaksi dgn reagen Schiff (asam sulfat fuchsin) warna merah (merah magenta/ungu) yang stabilContoh reaksi yang positif: musin dlm tractus digestivus, glikogen dlm hepar, membrana basalis ren & kulit

Prosedur PASSetelah deparafinasi, irisan jaringan dibawa ke alkohol bertingkat sampai akhirnya ke akuades. Masukkan dalam asam periodat 0,5%: 5 Celup dalam air ledeng dan akuades.Masukkan dalam reagen Schiff (campuran Basic fuchsin, akuades, asam hidroklorit, dan sodium bisulfat anhidrosa): 15. Untuk irisan dari metode beku cukup hanya 10 menit.Letakkan selama 2 menit dalam larutan asam sulfurosa (campuran sodium metabisulfit, asam hidroklorit dan akuades): 3xMasukkan dalam air mengalirDehidrasi dengan alkohol bertingkat, clearing dalam xilol atau toluol akhirnya mounting.

Karbohidrat (merah magenta)

Nukleus (biru)

Reaksi PAS yg PositifMembrana basalisSelulosaKitinFibrinFungiGlikogenMucin netralGranula sel Paneth

Granula zymogen pancreasBasofil hipofisisReticulinRussel bodiesKoloid tiroidKoloid hipofisis

GlikogenMetode Best Carmine: campuran hematoxylin Harris & carmineMetode Bauer: campuran chromic acid (sebagai oksidator) & reagen SchiffMetode Lead Tetra-Acetat: + reagen SchiffMetode Iodine: larutan lugol iodine, iodine & minyak origanum

Mukopolisakarida AsamMetode Alcian Blue (fiksatif lart Bouin)Metode Thionin & Toluidin Blue: campuran thionin, ammonium molibdat, & toluidin blue (fiksatif lart Zenker/formalin 10%)Metode Hale: larutan besi (Fe2O3), AAG, safranin (fiksatif Lart Carnoy/formalin 10%)Metode Muller-Mowry: larutan besi koloid (ferric chloride)Metode Alcian Blue-PAS

Amiloid Substansi homogen yang menyerupai amilumBiasanya tertimbun dlm jar. pengikat dlm keadaan patologisMetode pewarnaan:Congo redDahliaCrystal violetIodinMetil violet

Amyloid, eosinophils, elastin (brick red)Nuclei (blue)Background (clear)

Metode Pewarnaan yg LainMetode Leach Bismarck brown substansi mukoidTdr dr: lart Bismarck brown & hematoxylin WeigertMetode pewarnaan mucicarmin mucinJarang dilakukanTdr dr: carmin, aluminium hydroxide, aluminium chloride Fiksatif: Zenker-formol/HellyMetode Alcian Blue-Chlorantine Fast Red mukopolisakarida (asam hyaluronat, heparin, gastric mucin, mucoid cornea)Tdr dr: hematoxylin Ehrlich, alcian blue, chlorantine fast redFiksatif: lart BouinMetode Giroud & Leblond asam ascorbatTdr dr: perak nitrat & sodium thiosulfat

Sifat lipid: tdk larut dlm air, tp larut dl pelarut lemak (benzen, toluol, xilol, alkohol, eter, aseton, & kloroform)Penggunaan zat pelarut lipid dalam uji histokimia thd lipid perlu mendapat perhatianSebaiknya menggunakan metode kering beku (freeze-dried fixation)Pewarna yang digunakan sebaiknya larut lemak

Contoh Lipid Penyusun Sel/JaringanPlasmalogen: fraksi fosfolipid yang tdp pd otak, hati, otot, dan telur.Sfingomyelin: byk tdp pd otak, saraf dan sedikit di dlm darah & bbrp organ tubuh.Serebrosid: byk tdp dlm otak (selubung myelin saraf & substansia alba). Kolesterol: byk tdp dlm otak & sistem sarafAsam empeduHormon seksHormon-hormon dr korteks kelenjar suprarenalisVitamin D

Metode Histokimia utk LipidMetode Mann-Kopsch-Weigl Larutan yang digunakan:Lart Flemming (as chromat, osmium tetroxide, sodium chloride) Fiksatif Mann (osmium tetroxide, sodium chloride, mercuric chloride) Lart osmic acidTanpa deparafinasiMetode lipid crimsonReagen: michrom lipid crimson dlm alkohol 50% & hematoxylin ehrlichMetode oil red O

Metode Sudan BlackFiksatif: campuran sodium chlorid & formalinPewarna: lart sudan black dlm propilen/etilen glikol & lart carmalum (asam carminat dlm potasium alum)Stl fiksasi lgs diiris dgn metode bekuHasil: lemak netral & myelin biru gelap, nuklei merah Metode Sudan BlueReagen: sudan jenuh dlm alkohol 50% & carmalumSectioning: metode bekuMetode Sudan IV/Scarlet R (Sudan IV dlm aseton & alkohol 70%)Metode Sudan Brown (Sudan brown jenuh dlm isopropil alkohol)

Metode sudan III gelatin (bubuk gelatin dlm aquades hangat & Sudan brown dlm aseton)Metode Performic Acid-Schiff (PFAS) Utk lipid yang mengandung ikatan rangkap (tdk jenuh)Reagen: Performic acid (campuran asam format 98% & hidrogen peroksida) & reagen SchiffMetode FischlerUtk melihat asam2 lemakReagen: cupriasetat, hematoxylin, lithium carbonat, borax ferricyanida, kloroform, buffer citratFiksasi: formalin metode beku

Deteksi Kolesterol & EsternyaReaksi digitoninReagen: Fiksatif: digitonin jenuh dlm alkohol 70%, embeding agent: parafin wax-gliseril monostearatFiksatif: formalin, pewarna: hematoxylin-sudan IV metode bekuReaksi: digitonin bereaksi dgn sterol bebas membentuk kristal2 spt jarum/roset jk diamati di bawah sinar polarisasi (birefrigent)Spesifik utk sterol yang mpy ikatan 3-cis-OH (kolesterol, vit D, isoandrosteron)Metode Schultz-Smith campuran hidrogen peroksida 3% & AAGMetode modifikasi Schultz reagen alum besi & campuran asam asetat dgn sulfatMetode modifikasi Romieu reagen asam sulfat pekat & asetat anhidrid

Metode Landing, Uzman & Ann WippleUtk melihat cholin yang mgd lipidReagen: campuran aseton-eter, campuran kloroform-alkohol absolut, asam fosfomolibdat, eosinJarang digunakan, skrg lebih baik dgn kromatografiMetode Borax FerrcyanideUtk melihat lesitinReagen: potasium dichromat, hematoxylin Ehrlich, borax, potasium ferricyanida

PhospholipidMetode acid haematinFiksatif: formol calsiumReagen lain: lart calcium dichromat, acid haematin & borax-ferricyanidaMetode nile blue sulphatReagen: safranin, nile blue, asam asetat, HClMetode PearseJar dpt diiris dgn metode parafinFiksatif: calsium cadmium formolReagen lain: metanol fast blue, lithium carbonat, neutral redSelain dpt melihat fosfolipid misal pd selubung myelin & membran eritrosit jg dpt melihat granula eosinophil, jar elastic, & keratin

Scr spesifik DNA dpt ditunjukkan dgn reaksi FeulgenHidrolisis asam (pemberian HCl) utk menghilangkan basa purin dr DNA terbentuk aldehid (cincin deoksiribosa terbuka)Aldehid bebas bereaksi dgn reagen Schiff warna merah pd nukleus (elemen jar yang lain tdk terwarnai). Metode lain: pewarna fluoresens, misal acridin orange (DNA kuning-hijau, RNA, orange)Struktur yang mgd RNA (RER) dpt terwarnai dgn pewarna basa (metilen blue & toluidin blue) tdk spesifik karena struktur basofil lain jg bereaksi positif

Prosedur Reaksi FeulgenStl deparafinasi bawalah sediaan irisan jaringan ke lingkungan akuosa.Selanjutnya irisan dibawa ke dalam HCl 1 N panas (600C) selama 10-15 menit (lamanya tergantung dr jenis fiksatifnya).Celupkan dalam akuades, kemudian dimasukkan ke dalam reagen Schiff (campuran Basic Fuchsin, akuades, asam hidroklorat pekat murni, potasium metabisulfit, dan bubuk norit untuk decolorisasi) selama 45 menit dalam suhu kamar.

Pindahkan ke asam sulfurosa (campuran sodium metabisulfit, asam hidroklorat dan akuades) selama 2 menit. Perlakuan ini dilakukan 2 x.Cuci dalam air mengalir selama 1 menit.Bila diinginkan, dapat digunakan pewarna pembanding Light Green FCF 1%.Cucilah dengan akuades, kemudian berturut-turut dehidrasi dengan alkohol, clearing dengan xilol dan toluol, serta akhirnya ditutup dengan Canada Balsam.

Pewarnaan Methyl Green/Pyronin utk RNA & DNA Dewax sections, rinse in alcohol, rinse in water. Rinse in pH4.8 buffer. Stain in methyl green/pyronin solution - 25 minutes. Rinse in pH 4.8 buffer. Rinse in a mixture of equal parts acetone and xylene (or Histoclear). Dehydrate in 100% alcohol. Rinse in xylene (or Histoclear). View microscopically without mounting and repeat the last three steps if necessary. Mount in DPX.

Scr histokimia tdk semua jenis protein dpt dideteksiLarut (hancur/rusak) selama proses mikroteknikPerubahan struktur molekul (denaturasi)Sebaiknya dgn metode beku (suhu yang tinggi tdk baik bagi protein)Metode Pewarnaan utk protein:Metode Sakaguchi Utk melihat arginin, keratin, kolagen, dan koloid thyroid. Irisan jaringan untuk metode Sakaguchi bisa diperoleh dengan metode beku dan metode parafin. Fiksatif: formalin atau campuran alkohol-formalin.Metode Millon tyrosinPewarnaan Michrome MF 4 & Papanicoloau keratin pd jar yang mengalami kornifikasi (esophagus, ventriculus dan epitel dinding vagina)Metode Romieu triptofan

Metode Dunn/Thompson utk HaemoglobinDewax sections, rinse in alcohol, rinse in water. Stain in a mixture of equal parts 1% alcoholic haematoxylin (ripened, not fresh) and 10% potassium alum - 15 minutes. This solution may crystallise but is still usable. Rinse briefly in tap water. Mordant in 5% iron alum - 1 minute. Rinse briefly in tap water. Restain in the solution used at the second step - 10 minutes. Rinse briefly in tap water. Stain in van Giesons stain - 15 minutes. Differentiate in 95% alcohol - 3 minutes. Dehydrate, clear and mount. Red blood cells (greenish black)Haemoglobin (lighter shades of green)Collagen (red)

Metode Masson/Fontana utk Melanin Dewax sections, rinse in alcohol, rinse in water. Treat in ammoniacal silver solution for 12-18 hours in a coplin jar in the dark, or at 37oC for 45 minutes if urgent. Wash well in several changes of distilled water. Tone in 0.2% gold chloride (sodium tetrachloroaurate) - 2 minutes. Wash briefly in distilled water. Fix in 5% sodium thiosulphate - 2 minutes. Wash well in tap water. Rinse in distilled water. Counterstain with nuclear fast red - 5 minutes. Wash in distilled water. Dehydrate, clear and mount.

Melanin, also argentaffin, chromaffin and some lipofuscins (black)Nuclei (red)

EnzimTiap sel dlm wkt bersamaan tjd berbagai reaksi kimiaReaksi tsb membutuhkan enzim sebagai biokatalisatorDeteksi enzim secara histokimia dpt menunjukkan struktur sel tertentu karena bbrp organel sel mengikat enzim spesifik (marker enzyme)ContohSuccinat-dehydrogenase utk mitokondriaAcid phosphatase utk lisosomGlucose-6-phosphatase utk RE

Enzim Alkalin PhosphataseLokasi: sepanjang brush border tubulus contortus uriniferus pars proximalis atau endothel kapilerMetode pewarnaan:Metode alkalin phosphatase-cobalt dr GomoriMetode alkalin phosphatase-Azo

Fe3+ (ferri) Tdp pd jar yang mengandung HbDitunjukkan dgn reaksi ammonium sulfit 10% Fe3+ diikat menjadi ferrisulfitFerrisulfit bereaksi dgn campuran ferosianida & NaCl warna biru cerahIon fosfatDitunjukkan dengan metode Perak nitrat dr Von KossaPerak nitrak (AgNO3) bereaksi dgn fosfat membentuk perak fosfatMelalui hidrochinon, perak fosfat yang terbentuk direduksi menjadi endapan perak berwarna hitam metalik (preparat diletakkan di tempat yg terang)Dpt utk mempelajari proses osifikasi tulang karena jar tulang mgd ion fosfat dlm jml besar (kalsium fosfat)

Endapan Ca2+/fosfat (hitam)Nukleus (merah)