Penyakit Infeksi

USULANHIBAH PENELITIAN DOSEN

PROGRAM HIBAH KOMPETISIPENINGKATAN KUALITAS PENDIDIKAN DOKTER

POLIMORFISME GEN MEROZOITE SURFACE PROTEIN-1 DAN MEROZOITE SURFACE PROTEIN-2 Plasmodium falciparum

DI SUMATERA SELATAN

OlehKetua : dr. Dwi Handayani, MKes

Anggota : dr. Rini Nindela

FAKULTAS KEDOKTERANUNIVERSITAS SRIWIJAYA

MARET 2013

b. Halaman Pengesahan

1. Judul Penelitian

2. Ketua Penelitia. Nama lengkap dan gelarb. Jenis Kelaminc. Bidang Keahliand. NIPe. Jabatan Fungsionalf. Jabatan Strukturalg. Bidang Keahlianh. Fakultas/Jurusani. Perguruan Tinggij. Alamat

3. Waktu Penelitian4. Pembiayaan

:

::::::::::

::

Polimorfisme Gen Merozoite Surface Protein-1 dan Merozoite Surface Protein-2 Plasmodium falciparum di Sumatera Selatan.

dr. Dwi Handayani, MKesPerempuanParasitologi Kedokteran19811004 2009122 001Staf Pengajar Bagian Parasitologi FK Unsri-ParasitologiKedokteran/UmumUniversitas SriwijayaJl. Dr. Mohammad Ali Palembang 30126Telp. (0711) 311750 HP. 08127824209Faks. (0711) 373438 Email: wie_dr@yahoo.com7 (tujuh) bulanRp. 49.741.800,-

Palembang, Maret 2013

Mengetahui,Kepala Bagian Ketua PenelitiParasitologi FK Unsri

Drh. Muhaimin ramdja, MSc dr. Dwi Handayani, MKes

NIP. 19610227 199003 1 002 NIP 19811004 200912 2 001

Menyetujui Ketua Unit Penelitian Kedokteran Kesehatan

Dr. dr. H. Zen Hafy, MBiomed NIP 19721229 199803 1001

c. Sistematika Usulan Penelitian

I. Identitas Penelitian1. Judul Usulan : Polimorfisme Gen Merozoite Surface Protein-1 dan

Merozoite Surface Protein-2 Plasmodium falciparum di Sumatera Selatan

2. Ketua Penelitia. Nama lengkap : dr. Dwi Handayani, MKesb. Bidang keahlian : Parasitologi Kedokteran

3. Anggota Peneliti :No Nama dan Gelar Keahlian Institusi Alokasi

waktu(jam/minggu)

1. dr. Dwi Handayani, MKes

Parasitologi FK Unsri 15 jam

2. dr. Rini Nindela Mahasiswa S2 Biomedik

FK Unsri 12 jam

4. Objek penelitian :a. Pengumpulan sampel darah penderita malaria yang dibuktikan dengan

pemeriksaan mikroskopik darah tipis P. falciparum (+) di Palembang, Sekayu, Lahat, Muara Enim dan Baturaja

b. Isolasi DNA dari sampel.c. Amplifikasi gen MSP-1 dan MSP-2 P. falciparum dari DNA yang telah

diisolasi dengan teknik PCR.d. Visualisasi hasil amplifikasi gen MSP-1 dan MSP-2 P. falciparum dengan

sinar ultraviolet (Gel Doc).e. Menentukan kelompok wild type dan varian gen MSP-1 dan MSP-2.

5. Anggaran yang diusulkan : Rp 49.741.800,-6. Lokasi penelitian :

1. Laboratorium Parasitologi FK UNSRI2. Laboratorium Biologi Molekuler BBLK Palembang3. Unit Rawat Jalan/Rawat Inap RSUD Sekayu4. Unit Rawat Jalan/Rawat Inap RSUD Lahat5. Unit Rawat Jalan/Rawat Inap RSUD Baturaja6. Unit Rawat Jalan/Rawat Inap RSUD Muara Enim

7. Hasil yang ditargetkan : Pada tahun 2013 ditargetkan1. Terkumpulnya seluruh sampel yang memenuhi kriteria penerimaan.2. Berhasil di isolasi DNA genom dari seluruh sampel.3. Berhasil diamplifikasi semua sampel dengan teknik PCR.4. Berhasil divisualisasi semua produk amplifikasi. 5. Berhasil ditentukan adanya polimorfisme sehingga tersedia data

kelompok individu dengan alel wild-type (normal) dan varian gen MSP-1 dan MSP-2.

6. Publikasi pada jurnal ilmiah nasional terakreditasi.8. Institusi lain yang terlibat : Tidak ada9. Keterangan lain yang perlu : Tidak ada10. Pembiayaan : Rp 49.741.800,-11. Sumber Pembiayaan Lain : Tidak ada

II. Substansi Penelitian

ABSTRAK

P. falciparum merupakan spesies penyebab malaria yang paling mematikan karena berpotensi menyebabkan komplikasi serebral. Malaria merupakan penyakit endemis di 105 negara di dunia termasuk Indonesia dan WHO mencatat pada tahun 2010 terdapat 149-274 juta kasus dan 537-907 ribu kematian akibat malaria. Penyebaran dan peningkatan jumlah kasus parasit yang resisten terhadap obat antimalaria dan vektor yang resisten terhadap insektisida terus merintangi upaya pengendalian malaria yang sedang dilakukan. Oleh karena itu, kebutuhan akan adanya vaksin malaria menjadi semakin mendesak. Salah satu tantangan dalam pengembangan vaksin malaria adalah keragaman genetik dari spesies Plasmodium itu sendiri. Untuk mendukung pengembangan vaksin malaria ini, diperlukan informasi dasar mengenai keragaman genetik P. falciparum khususnya gen yang mengkode antigen yang menjadi target imunitas. Penelitian ini bertujuan untuk a) mengidentifikasi alel-alel K1, MAD20 dan RO33 gen MSP-1 P. falciparum, b) mengidentifikasi alel-alel FC27 dan 3D7 gen MSP-2 P. falciparum, c) menentukan besarnya multiple infeksi atau Multiplicity of Infection (MOI), dan d) mendapatkan data keragaman genetika P. falciparum di Sumatera Selatan. Hasil penelitian ini sangat nyata kontribusinya terhadap ilmu pengetahuan dan masyarakat. Tersedianya informasi mengenai keragaman genetika P. falciparum ini akan berpengaruh positif terhadap kebijakan strategi pengendalian malaria di Sumatera Selatan. Selain itu, data mengenai keragaman genetika ini, khususnya keragaman pada antigen yang menjadi target imunitas merupakan basis dalam pengembangan vaksin malaria di Indonesia. Pada saatnya nanti akan terjadi penurunan morbiditas dan mortalitas akibat malaria dan peningkatan status kesehatan masyarakat, yang pada akhirnya akan mempengaruhi tingkat kesejahteraan masyarakat itu sendiri.

BAB I. PENDAHULUAN

Latar Belakang

Malaria merupakan penyakit yang disebabkan oleh parasit Plasmodium dengan

nyamuk Anopheles betina sebagai vektor. Plasmodium menyerang manusia dan hewan,

namun terdapat beberapa spesies yang menyebabkan penyakit pada manusia yaitu

Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae dan P. ovale. Di Indonesia, keempat

spesies ini dapat ditemukan. Di antara keempat spesies tersebut, P. falciparum

merupakan spesies yang paling mematikan karena berpotensi menyebabkan komplikasi

serebral (Sutanto dan Pribadi, 2008).

Malaria masih menjadi masalah kesehatan global, terutama di negara-negara

tropis. Dalam World Malaria Report 2011 oleh World Health Organization (WHO)

tercatat 149-274 juta kasus malaria dan 537.000-907.000 kematian akibat malaria pada

tahun 2010. Malaria merupakan penyakit endemis di 105 negara di dunia dan Indonesia

termasuk di dalamnya dengan 60% penduduk yang tinggal di daerah endemis (WHO,

2005). Dari 484 kabupaten/kota yang ada di Indonesia, 338 kabupaten/kota merupakan

wilayah endemis malaria (Kemenkes RI, 2011).

Angka kejadian malaria klinis per tahun diukur dengan Annual Malaria

Incidence (AMI). AMI di pulau Jawa-Bali terus meningkat yaitu 16 per 1000 penduduk

pada tahun 1997, 31 per 1000 penduduk pada tahun 2001, dan menjadi 46,5 per 1000

penduduk pada tahun 2003 (Depkes RI, 2006). Di provinsi Sumatera Selatan sendiri

pada tahun 2009 tercatat AMI sebesar 8,45 per 1000 penduduk. Tiga kabupaten/kota di

Sumatera Selatan yang memiliki angka AMI tertinggi yaitu Ogan Komering Ulu 27,07

per 1000 penduduk, Lahat 22,08 per 1000 penduduk dan Musi Banyuasin 15,42 per

1000 penduduk (Dinkes Provinsi Sumsel, 2010).

Serangkaian upaya pengendalian terhadap penyebaran malaria telah dilakukan,

mulai dari pencegahan, diagnosis hingga pengobatan malaria. Pengendalian vektor

malaria dilakukan dengan larviciding, biological control, dan indoor residual spraying

(IRS). Pembagian kelambu berinsektisida dilakukan untuk mencegah terjadinya infeksi

malaria, sedangkan untuk pengobatan dilakukan dengan ACT (Artemisinin-based

Combination Therapy) sesuai dengan rekomendasi WHO (Kemenkes RI, 2011).

Upaya-upaya tersebut bukanlah tanpa hambatan. Penyebaran dan peningkatan

jumlah kasus parasit yang resisten terhadap obat antimalaria dan vektor yang resisten

terhadap insektisida terus merintangi upaya pengendalian malaria yang sedang

dilakukan. Oleh karena itu, kebutuhan akan adanya vaksin malaria menjadi semakin

mendesak (Kang et al., 2010; Irawati, 2011). Vaksin malaria telah dikembangkan sejak

beberapa dekade lalu tapi hasilnya belum memuaskan. Salah satu vaksin malaria, RTA,

S/AS01 saat ini sedang dalam fase III uji klinik (Moss et al., 2012) namun tidak dapat

dipastikan kapan vaksin ini siap untuk digunakan oleh masyarakat.

Salah satu tantangan dalam pengembangan vaksin malaria adalah keragaman

genetik dari spesies Plasmodium itu sendiri. Proses migrasi manusia dan vektor antar

daerah dengan endemisitas berbeda diduga menyebabkan terjadinya koeksistensi yaitu

ditemukannya dua atau lebih tipe gen Plasmodium dalam satu host manusia yang dapat

memicu terjadinya fertilisasi silang dan rekombinasi meiotik selama masa

perkembangan dalam tubuh vektor sehingga terbentuk polimorfisme yang tinggi pada

setiap gen (Heidari et al., 2007). Keragaman ini pada akhirnya akan berakibat pada

perubahan protein antigen yang dikode oleh gen tersebut.

Merozoite Surface Protein-1 (MSP-1) dan Merozoit Surface Protein-2 (MSP-2)

merupakan antigen yang terdapat pada permukaan merozoit. Kedua antigen ini

merupakan target utama dari respon imun manusia sehingga keduanya menjadi kandidat

utama pengembangan vaksin malaria (Moss et al., 2012; Mayengue et al., 2011; Kang

et al., 2010, Heidari et al., 2007). Polimorfisme pada gen MSP-1 dan MSP-2 telah

dilaporkan di berbagai belahan dunia (Mayengue et al., 2011; Kang et al., 2010, Heidari

et al., 2007). Di Indonesia sendiri penelitian terhadap polimorfisme MSP-1 dan MSP-2

telah dilakukan di beberapa daerah seperti di Sumatera Barat oleh Irawati (2011) dan di

Pacitan oleh Arwati et al (2011). Di Sumatera Selatan belum tersedia data mengenai

polimorfisme MSP-1 dan MSP-2 P. falciparum. Informasi mengenai keragaman

genetika dalam suatu populasi alami P. falciparum sangat diperlukan sebagai dasar bagi

pengambilan kebijakan strategi pengendalian malaria di suatu daerah.

Tujuan Penelitian

1. Mengidentifikasi alel-alel K1, MAD20 dan RO33 gen MSP-1 P. falciparum

pada sampel yang diambil dari pasien yang didiagnosis sebagai penderita

malaria di Sumatera Selatan.

2. Mengidentifikasi alel-alel FC27 dan 3D7 gen MSP-2 P. falciparum pada

sampel yang diambil dari pasien yang didiagnosis sebagai penderita malaria

di Sumatera Selatan.

3. Menentukan besarnya multiple infeksi atau Multiplicity of Infection (MOI).

4. Mendapatkan data keragaman genetika P. falciparum di Sumatera Selatan.

Urgensi Penelitian

Malaria merupakan salah satu penyakit yang menjadi bagian dari komitmen

global Millenium Development Goals (MDG’s), selain Tuberkulosis dan HIV/AIDS.

Dalam MDG’s ditargetkan untuk menghentikan penyebaran dan mengurangi insiden

malaria pada tahun 2015 dengan indikator penurunan prevalensi dan mortalitas akibat

malaria.

P. falciparum menyebabkan malaria yang berat dan bertanggungjawab terhadap

hampir seluruh kasus kematian akibat malaria dimana sebagian besar adalah ibu hamil

dan anak-anak. Berbagai faktor seperti resistensi vektor terhadap insektisida, belum

tersedianya vaksin, serta resistensi obat-obat antimalaria yang menyebar secara cepat

berkontribusi terhadap memburuknya situasi global malaria saat ini. Oleh sebab itu,

pengembangan vaksin malaria merupakan kebutuhan yang mendesak. Tetapi adanya

keragaman genetik yang luas pada populasi alami parasit P. falciparum merupakan

tantangan utama bagi pengembangan vaksin ini, karena keragaman genetik pada antigen

target dapat menyebabkan menurunnya efikasi vaksin malaria tersebut (Kang et al.,

2010).

Hasil penelitian ini sangat nyata kontribusinya terhadap ilmu pengetahuan dan

masyarakat. Tersedianya informasi mengenai keragaman genetika P. falciparum ini

akan berpengaruh positif terhadap kebijakan strategi pengendalian malaria di Sumatera

Selatan. Selain itu, data mengenai keragaman genetika ini, khususnya keragaman pada

antigen yang menjadi target imunitas merupakan basis dalam pengembangan vaksin

malaria di Indonesia. Pada saatnya nanti akan terjadi penurunan morbiditas dan

mortalitas akibat malaria dan peningkatan status kesehatan masyarakat, yang pada

akhirnya akan mempengaruhi tingkat kesejahteraan masyarakat itu sendiri.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

P. falciparum merupakan penyebab malaria tropika atau malaria falciparum.

Pada malaria jenis ini angka infeksi eritrosit (derajat parasitemia) sangat tinggi karena

P. falciparum menyerang setiap eritrosit tanpa memandang umur. Akibatnya sering

terjadi komplikasi berat pada penderita antara lain syok, malaria serebral, gagal ginjal

akut, hemolisis intravaskular, dan edema paru (Gardner et al., 2002).

(a) (b) (c)

Gambar 1. Apusan darah tipis P. falciparum, tampak RBC tidak membesar (a) tampak cincin yang halus dan tipis dengan double kromatin dots; (b) tampak dua ring form dalam satu eritrosit (multiple infections); (c) Maurer’s dot pada trofozoit tua. (www.dpd.cdc.gov)

Sejumlah antigen yang diekspresikan pada berbagai fase dalam siklus hidup P.

falciparum telah diidentifikasi untuk digunakan dalam pengembangan vaksin malaria,

antara lain merozoite surface protein (MSP), apical merozoite antigen (AMA), dan

circumsporozoite protein (CSP) (Moss et al, 2012). Antigen P. falciparum yang sedang

diteliti secara luas sebagai kandidat vaksin yang paling menjanjikan adalah merozoite

surface protein 1 (MSP-1). Orang yang secara alamiah terinfeksi P. falciparum akan

membentuk antibodi untuk melawan MSP-1. Adanya hubungan antara respon imun

terhadap MSP-1 yang didapat secara alamiah dengan menurunnya tingkat morbiditas

malaria juga telah diteliti. Dalam beberapa studi independen, baik MSP-1 yang

dipurifikasi maupun fragmen protein rekombinan juga telah terbukti menginduksi

respon pertahanan terhadap parasit malaria (Irawati, 2011).

MSP-1 adalah protein yang berperan penting dalam proses invasi eritrosit

dengan membentuk ikatan awal dari merozoit ke eritrosit berupa serabut fibril

(Barnwell and Galinski, 1998). Protein ini merupakan kelompok dari protein-protein

yang serupa secara struktur, dengan mobilitas relatif pada elektroforesis 185-215 kDa.

MSP-1 disintesis di dalam skizon. Pada akhir fase skizogoni protein ini dibelah oleh P.

falciparum subtisilin-1 (PfSUB1) menjadi 4 polipeptida dengan ukuran 83 kDa

(terminal N), 30 dan 38 kDa (regio sentral) dan 42 kDa (terminal C). Meskipun terbelah

melalui proteolisis, fragmen-fragmen ini tetap terhubung bersama-sama melalui ikatan

nonkovalen dan terikat ke plasma membran melalui C-terminal glycosyl phosphatidyl

inositol (GPI) yang berlokasi di fragmen 42-kDa (MSP-142).

Pada tahap terakhir invasi eritrosit MSP-142 mengalami peristiwa pembelahan

kedua yang diperantarai oleh P. falciparum subtisilin-2 (PfSUB2) dan menghasilkan

MSP-119 dan MSP-133. Setelah pembelahan ini sebagian besar kompleks fragmen MSP-

1 tercerai berai. Proses ini sering dikaitkan dengan lepasnya lapisan permukaan (coat)

merozoit selama invasi eritrosit. Meskipun demikian, MSP-119 tetap terikat ke merozoit

karena ikatan GPI dan dibawa masuk ke dalam eritrosit. Peran MSP-119 dalam

perkembangan parasit intraeritrosit masih belum jelas, meskipun MSP-119 adalah

penanda untuk pembentukan vakuola makanan yang bertahan hingga akhir siklus

eritrositer (Moss et al, 2012; Barnwell and Galinski, 1998).

Analisis oleh Tanabe et al (2000) menunjukkan bahwa struktur primer gen

MSP-1 dapat dibagi menjadi 17 blok berdasarkan perbandingan sekuens nukleotidanya.

Di antara 17 blok ini, lima di antaranya termasuk dalam blok konservatif (1, 3, 5, 12,

dan 17), lima blok lainnya termasuk dalam blok semikonservatif (7, 9, 11, 13, dan 15),

sedangkan tujuh blok sisa yaitu 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16 termasuk dalam blok yang sangat

variatif. Gen-gen ini bersifat dimorfis, artinya mempunyai dua macam alel yaitu K1 dan

MAD 20, di setiap blok, kecuali pada blok 3 yang bersifat polimorfik karena terdapat

tiga alel di dalamnya yaitu K1, MAD20 dan RO33 (Silveira et al, 1999).

Gambar 2. Blok dan Alel MSP-1 pada nested-PCR. (www.ars.els-cdn.com)

Merozoite surface protein-2 (MSP-2) adalah kandidat lain yang juga menjadi

target pengembangan vaksin malaria. MSP-2 merupakan sebuah protein kecil (45-

hingga 56-kDa) dan bersifat sangat polimorfik yang ditandai dengan regio sentral yang

luas. Regio ini mengandung berbagai versi alel dari motif-motif nukleotida yang

berulang. Daerah sentral yang sangat variatif ini disisipi oleh domain terminal kecil

yang konservatif (Barnwell and Galinski, 1998). Alel dari MSP-2 terbagi menjadi dua

tipe, FC27 dan 3D7, yang terdapat pada regio sentral yang bersifat dimorfik yaitu blok 3

(Kang et al, 2010). Peran spesifik dari MSP-2 masih diteliti hingga kini namun antibodi

terhadap molekul MSP-2 terbukti menghambat invasi merozoit ke eritrosit pada

percobaan in vitro (Barnwell and Galinski, 1998). BAB III METODE

PENELITIANPenelitian ini merupakan studi deskriptif dengan uji molekuler di

laboratorium untuk mengidentifikasi adanya polimorfisme gen MSP-1 dan MSP-2 pada

isolat P. falciparum di Sumatera Selatan. Dalam penelitian ini sampel darah diambil

dari darah pasien yang diterima laboratorium melalui poliklinik dan bangsal rawat inap

di RSUD Baturaja, Sekayu, Muara Enim dan Lahat dan Laboratorium Parasitologi FK

Unsri dari bulan Mei 2013 sampai dengan Juli 2013. Pemeriksaan Polymerase Chain

Reaction (PCR) dilakukan di Balai Besar Laboratorium Kesehatan Palembang dan

pemeriksaan mikroskopis dengan pengecatan Giemsa dilakukan di Laboratorium

Parasitologi FK Unsri Palembang. Jumlah sampel minimal adalah sebanyak 70 orang.

Prosedur KerjaSediaan Apusan Darah Giemsa

1.1. Pengambilan Darah Kapiler:

a. Bersihkan ujung jari tangan bagian tengah dengan kapas alkohol

70%.

b. Biarkan mengering, tusuk jari menggunakan lanset.

c. Tetes darah pertama dibuang.

d. Tetes darah selanjutnya diteteskan di atas objek glas, di buat sediaan

darah tebal dan tipis.

e. Tutup bagian bekas tusukan dengan kapas kering.

1.3. Pembuatan Apusan Darah Giemsa

Cara Pembuatan Apusan Darah Giemsa (Ngurah, 1984)

a. Bersihkan objek glas dengan tisu untuk menghilangkan debu/kotoran.

b. Lewatkan di atas nyala api untuk menghilangkan lemak.

c. Pada sudut kanan objek glas diberi kode/ label.

d. Tetesan darah pertama di buang.

e. Tetes selanjutnya diteteskan pada gelas objek, buat sediaan apusan darah

tipis.

f. Biarkan mengering, hindari gangguan serangga.

1.4. Cara Pewarnaan Giemsa Sediaan Darah Tipis

a. Sediaan yang sudah kering dihemolisis dengan Metanol ± 15 menit.

b. Kemudian sediaan dipulas dengan Larutan Giemsa, biarkan 30 menit.

c. Bersihkan sediaan dengan air, lalu dikeringkan.

d. Preparat siap untuk diperiksa dibawah mikroskop.

1.6. Cara Pemeriksaan Sediaan Apusan Giemsa

Pemeriksaan sediaan apusan Giemsa secara mikroskopis dilakukan oleh

dua tenaga laboratorium (reader 1 dan reader 2).

a. Mula-mula apusan darah Giemsa diperiksa dengan pembesaran 10x10, untuk

mendapatkan lapangan pandang. Kemudian dipakai pembesaran10x100

dengan minyak imersi.

b. Spesies Plasmodium dapat dibedakan berdasarkan bentuk-bentuk stadium

antara lain bentuk trofozoit, skizon, bentuk gametosit. Stadium tersebut

dapat dibedakan berdasarkan perbedaan inti, sitoplasma, pigmen parasit,

ukuran parasit dan eritrosit yang terinfeksi.

c. Hasil pemeriksaan dinyatakan negatif apabila tidak ditemukan parasit pada

pengamatan 100 lapangan pandang, yang dinyatakan oleh kedua pemeriksa.

d. Hasil negatif apabila tidak ditemukan parasit pada pengamatan 100 lapangan

pandang yang dinyatakan oleh kedua pemeriksa.

2. Pemeriksaan Metode PCR

a. Ektraksi DNA chelex-100

Bahan : - Phospate Buffer Saline (PBS) pH 7,4.

- Safonin 0,5% dalam PBS

- Chelex 20% dalam ddH2O Ph 10,5.

b. Cara Kerja ektraksi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan teknik chelex-100

1. Masukkan 1000 µl PBS pH 7,4 ke dalam tabung eppendorf.

2. Tambahkan 200 µl darah sampel ke dalam tabung eppendorf tersebut.

3. Lalu disentrifugasi 5000 rpm selama 5 menit dan dilakukan pencucian

dengan PBS pH 7,4 sebanyak 2 kali.

4. Kemudian tambahkan 500 µl saponin 0,5%, vorteks selama 5-10 detik.

Sampel diinkubasi semalam pada suhu -20ºC.

5. Setelah itu disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.

6. Kemudian ditambahkan 1 ml PBS pH 7,4, dibolak-balik beberapa kali

dengan tangan atau vorteks 5-10 detik dan disentrifugasi pada 12.000 rpm 5

detik, supernatan dibuang lagi.

7. Tahap pencucian ini diulang lagi, ditambahkan 1 ml PBS Ph 7,4, vorteks 5-

10 detik dan disentrifugasi 12.000 rpm 5 detik supernatan dibung.

8. Setelah itu ditambahkan 100 µl H2O + 50 µL Cheleks 20% dalam ddH2O

Ph 10,5.

9. Rebus pada suhu 100ºC selama 10 menit, vorteks setiap 2 menit, lalu

disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit.

10. Larutan supernatan (DNA) dipindahkan ke tabung mikro yang steril. DNA

disimpan pada -20ºC atau langsung diamplifikasi PCR (Dokomajilar and

Greenhouse, 2006).

c. Nested PCR

Melalui teknik ini, fragmen DNA target yang spesifik diperbanyak secara in vitro

dengan menggunakan pasangan primer oligonukleotida sintetik yang membatasi daerah

yang akan diperbanyak. Amplifikasi DNA dilakukan 2 tahap (nested), yaitu :

PCR pertama, untuk amplifikasi gen MSP-1 dan MSP-2 parasit P. falciparum

dengan menggunakan sepasang primer spesifik. Komposisi campuran yang

digunakan sebanyak volume total 25 µl yang terdiri dari 10 µl Mix Go Taq

(Promega USA), 9 µl ddH2O, 5 µl DNA cetakan (template) serta primer

oligonukleotida reverse (R) dan forward (F) masing-masing 0,5 µl.

Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Thermal cycler.

Campuran tersebut diamplifikasi sebanyak 30 siklus dengan kondisi sebagai

berikut: predenaturasi pada 94ºC selama 30 detik (1 siklus); denaturasi 94ºC selama

15 detik, annealing 60ºC selama 30 detik dan ekstensi 72ºC selama 15 detik dan

diakhiri dengan final ekstensi 72ºC selama 5 menit.

PCR kedua (nested PCR) , untuk memperbanyak DNA yang sudah diamplifikasi

pada PCR yang pertama. Produk DNA hasil amplifikasi pada PCR pertama,

diamplifikasikan kembali menggunakan internal primer yang spesifik untuk masing-

masing alel pada gen MSP-1 dan MSP-2 P. falciparum (Dokomajilar and

Greenhouse, 2006). Komposisi dan siklus amplifikasi sama dengan PCR pertama.

Tabel 1. Sekuen oligonukleotida primer yang digunakan berdasarkan Aubuoy, 2003 (Irawati et al., 2011)

Gen Primer Sekuen Panjang (pb)

MSP-1

Msp1-C1Msp1-C2

K1aK1b

MAD20aMAD20b

RO33aRO33b

F: 5’ TAGAAGATGCAGTATTGACAGGTTA 3’

R: 5’ ATTCTAATTCAAGTGGATCAGTAAATAA 3’

F: 5’ TAGAAGATGCAGTATTGACAGGTTA 3’

R: 5’ ATTCTAATTCAAGTGGATCAGTAAATAA 3’

F: 5’ GTATTAAATGAAGGAACAAGTGGAACA 3’

R: 5’ TATCTGAAGGATTTGTACGTCTTGAATT 3’

F: 5’ ATTAAAGGATGGAGCAAATACTCAAGTTGT 3’

R: 5’ ATTCTAATTCAAGTGGATCAGTAAATAA 3’

99-147

110-136

99-120

MSP-2

msp2-C1msp2-C2

FC27aFC27b

3D7a3D7b

F: 5’ ATGAAGGTAATTAAAACATTGTCTATTATA 3’

R: 5’ CTTTGTTACCATCGGTACATTCTT 3’

F: 5’ GCAAATGAAGGTTCTAATACTAATAG 3’

R: 5’ GCTTTGGGTCCTTCTTCAGTTGATTC 3’

F: 5’ AGAAGTATGGCAGAAAGTAAGCCTCCTACT 3’

R: 5’ GATTGTAATTCGGGGGATTCAGTTTGTTCG 3’

260-500

400-610

d. Deteksi hasil PCR

Kualitas DNA hasil amplifikasi dengan teknik PCR dilihat dengan menggunakan

teknis elektroforesis gel agarose (konsentrasi 2%). Elektroforesis dilakukan didalam

apparatus elektroforesis (Horizontal MiniSub DNA Biorad) yang berisi TBE 1x (Tris-

Boric acid-EDTA, 10,8 g/l. Tris pH 8,0 yang mengandung 5.5 g/l Boric Acid dan 0,5 M

EDTA pH 8,0) dan ditambahkan zat interkalator Ethidium Bromide 0,1%.

DNA hasil PCR sebanyak 5 µl loading dye (0,25% bromphenol blue, 40% b/v

sukrosa) dimasukkan dalam sumuran yang terdapat pada gel. Sebagai penanda ukuran

pita-pita DNA hasil elektroforesis pada gel digunakan marker (100bp DNA ladder Cat

no: 15628-019 LOT NO. 1289697 sebanyak 3µg/µl; promega) yang dicampur 2µl

loading dye dan 4,5 µl 1x TBE buffer. Gel elektroforesis diset pada tegangan listrik 110

volt. Selanjutnya dideteksi dengan menggunakan Gel Doc 1000 (Biorad USA) untuk

divisualisasi dengan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 300nm dan direkam

(Dokomajilar and Greenhouse, 2006).

Analisis data

Data disajikan secara naratif deskriptif dan dalam bentuk tabulasi. Prevalensi

masing-masing alel dihitung berdasarkan persentase dari fragmen PCR untuk masing-

masing alel dibandingkan dengan jumlah pita yang teramplifikasi untuk alel tersebut.

Multiplicity of Infection atau MOI adalah rata-rata genotipe p. falciparum yang

terdeteksi pada satu individu penderita malaria.

Alur Penelitian

Sampel darah penderita tersangka malaria (klinis malaria) yang dibawa ke laboratorium untuk pemeriksaan

Pemeriksaan apusan darah tipis dengan pengecatan Giemsa

BAB IV PEMBIAYAANRincian Anggaran Penelitian

JENIS PENGELUARAN JUMLAH

Pelaksana (gaji dan upah) Rp. 11.160.000,-

Peralatan Rp. 550.000,-

Bahan habis pakai Rp. 31.231.800,-

Perjalanan Rp. 1.200.000,-

Lain-lain Rp. 5.300.000,-

Total Rp. 49.741.800,-

DAFTAR PUSTAKAArwati, H., Hidayati, S. and Y. P. Dachlan. 2011.

Polymorphism of Plasmodium Falciparum MSP-1 and MSP-2 in Imported and

Indigenous Malaria in Pacitan District East Java Province, Indonesia. Fakultas

Kedokteran Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia.Barnwell, J. W. and M. R.

Galinski. 1998. Malaria: Parasite Biology, Pathogenesis, and Protection; Invasion of

Vertebrate Cells: Erythrocytes. ASM Press, Washington DC, United States of

America.Departemen Kesehatan RI. 2006. Pedoman Pemberantasan Vektor.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia Direktorat Jenderal Pengendalian Penyakit

Plasmodium falciparum positif

Ekstraksi DNA

Nested PCR

Identifikasi alel-alel MSP-1 dan MSP-2 P. falciparum melalui elektroforesis

Analisis data

dan Penyehatan Lingkungan, Jakarta, Indonesia.Dinas Kesehatan Provinsi Sumatera

Selatan. 2010. Pencegahan Penyakit dan Penyehatan Lingkungan. Profil Kesehatan

Provinsi Sumatera Selatan.Dokomajilar, C and B. Greenhouse. 2006. Protocols for

Genotyping P. falciparum. Gardner, M. J., Hall, N. Fung, E. White, O. and M.

Berriman. 2002. Genome Sequence of the Human Malaria Parasite Plasmodium

falciparum. Nature 419: 498-511.Harijanto, P.N. 2006. Buku Ajar Ilmu Penyakit

Dalam: Malaria. Volume 3 (hal.1754-1760). Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia, Jakarta, Indonesia. Heidari, A., Keshavarz, H. Rokni, M. B. and T. Jelinek.

2007. Genetic Diversity in Merozoite Surface Protein (MSP)-l and MSP-2 Genes of

Plasmodium falciparum in a Major Endemic Region of Iran. Korean Journal of

Parasitology 45(1): 59-63.Irawati, N. 2011. Genetic Polymorphism of Merozoite

Surface Protein-1 (MSP-1) block 2 Allelic Types in Plasmodium falciparum Field

Isolates from Mountain and Coastal Area in West Sumatera, Indonesia. Med J Indones

20: 11-14.Kang, J. M., Moon, S. U. Kim, J. Y. Cho, S. H. Lin, K. Sohn, W. M. et al.

2010. Genetic Polymorphism of Merozoite Surface Protein-1 and Merozoite Surface

Protein-2 in Plasmodium falciparum Field Isolates from Myanmar. Malaria Journal 9:

131.Kementerian Kesehatan RI. 2011. Buletin Jendela Data dan Informasi Kesehatan:

Epidemiologi Malaria di Indonesia. Mayengue, P. I., Ndounga, M. Malonga, F. V.

Bitemo, M. and F. Ntoumi. 2011. Genetic Polymorphism of Merozoite Surface Protein-

1 and Merozoite Surface Protein-2 in Plasmodium falciparum Isolates from Brazzaville,

Republic of Congo. Malaria Journal 10: 276.Moss, D. K., Remarque, E. J. Faber, B. W.

Cavanagh, D. R., Arnot, D. E. Thomas, A. W. and A. A. Holder. 2012. Plasmodium

falciparum 19-Kilodalton Merozoite Surface Protein 1 (MSP1)-Specific Antibodies that

Interfere with Parasite Growth In Vitro can Inhibit MSP1 Processing, Merozoite

Invasion, and Intracellular Parasite Development. Infect Immun 80(3): 1280–

1287.Nugroho, A., dan W.M. Tumewu. 2000. Siklus Hidup Plasmodium Malaria.

Dalam P.N. Harijanto (editor). Malaria, Epidemiologi, Patogenesis, Manifestasi Klinis

dan Penanganan (hal.38-5). EGC, Jakarta, Indonesia.Pusarawati, S., dan I.S. Tantular.

2008. Diagnostik Mikroskopis Malaria Pewarnaan Giemsa dan Acridine Orange (AO).

Silveira, L. A., Dorta, M. L. Kimura, E. A. S. Katzin, A. M. Kawamoto, F. Tanabe, K.

Ferreira, M.U. 1999. Allelic Diversity and Antibody Recognition of Plasmodium

falciparum Merozoite Surface Protein 1 during Hypoendemic Malaria Transmission in

the Brazilian Amazon Region. Infect Immun. 67(11): 5906–5916.Sutanto, I. dan R.

Muljono. 2008. Buku Ajar Parasitologi Kedokteran: Plasmodium falciparum (edisi ke-

4). Balai Penerbit FK UI, Jakarta, Indonesia.Sutanto, I. dan W. Pribadi. 2008. Buku

Ajar Parasitologi Kedokteran: Parasit Malaria (edisi ke-4). Balai Penerbit FK UI,

Jakarta, Indonesia.Tanabe, K., Sakihama, N. Nakamura, Y. Kaneko, O. Kimura, M.

Ferreira, M. U. and K. Hirayama. 2000. Selection and Genetic Drift of Polymorphisms

within the Merozoite Surface Protein-1 Gene of Plasmodium falciparum. Gene 241:

325-31.WHO. 2006. Guidelines for the Treatment of Malaria. Geneva.WHO. 2011.

World Malaria Report. Geneva.LAMPIRANI. Alokasi Pertimbangan

BiayaPelaksana (Gaji dan Upah)

No Pelaksana Jumlah pelaksana

Jumlah jam/minggu*

Honor/jam(Rp.)

Biaya(Rp.)

1 Ketua Peneliti 1 15 12.000 5.580.0002. Peneliti anggota 1 12 10.000 3.720.0003. Teknisi 1 12 5.000 1.860.000 Sub total gaji dan upah 11.160.000

*7 bulan : 31 minggu

1. Peralatan Jenis Pengeluaran Volume Biaya

Satuan (Rp.)Biaya (Rp)

1. Sewa Laboratorium BBLK 1 penelitian 500.000 1.000.0001. Gelas Objek 1 kotak 50.000 50.000

Sub total peralatan

550.000

2. Bahan Habis Pakai No Nama bahan Volume Biaya Satuan

(Rp.)Biaya(Rp.)

1. Tabung eppendorf 1,5 ml 1000 bh 400.000 400.000

2. Centrifuge tube 1 pkg 608.000 608.000

3. Pipette tip 100 µL 1x1000 1.000.000 1.000.000

4. Pipette tip 1000 µL 1x1000 1.000.000 1.000.000

5. Pipette tip 10µ L 1x1000 1.000.000 1.000.0006. Sarung tangan 2 dus 25.000 50.0007. PCR tube thermowell 1 pkg 1.311.000 1.311.0008. Agarose 200 gram 2.300.000 2.300.0009. Ethidium bromide 5 tablet 165.000 165.000

10. Gel loading solution 10 mL 113.900 227.80011. DNA marker 100 µL x 2 1.000.000 2.000.00012. Taq DNA polymerase 750 U 1.250.000 3.750.00013. PCR Primer 1 200 bp x 7 10.000 14.000.00014. Aquabidest 10 L 15.000 150.00015. Tris base 2x500 gram 950.000 1.900.00016. Metanol 500 ml 100.000 100.00017. Giemsa 500 ml 100.000 100.00018. Alkohol 70% 200 ml 20.000 20.00019. Spuit 3 cc 1 x 100 200.000 200.00020. Alat tulis kantor (cartridge,

tinta, kertas HVS, kertas label, spidol, bolpoin, CD, pensil, selotip, )

1 paket 1.250.000 1.250.000

Jumlah 31.531.800

3. Perjalanan No Kota/ Tempat tujuan Volume Biaya Satuan

(Rp.)Biaya(Rp.)

1. Lahat, 2 kali, 1 orang 2 x 1 OK 200.000 400.000

2. Sekayu, 2 kali, 1 orang 2 x 1 OK 200.000 400.000

3. Baturaja, 2 kali, 1 orang 2 x 1 OK 200.000 400.000

Jumlah 1.200.000

4. Lain-lainNo Nama bahan Volume Biaya satuan

(Rp.)Biaya(Rp.)

1. Dokumentasi 1 paket 500.000 500.000

2. Komunikasi (telepon, HP) 1 paket 700.000 600.000

3. Penelusuran pustaka (internet)

1 paket 600.000 600.000

4. Penggandaan dan pengiriman laporan akhir

10 paket 100.000 1.000.000

5. Seminar nasional 1 paket 1.000.000 1.000.000

6. Publikasi jurnal nasional terakreditasi

1 artikel 1.500.000 1.500.000

Jumlah 5.200.000

II. Dukungan pada Pelaksanaan Penelitian

1. Dukungan Aktif yang Sedang Berjalan: Tidak ada

2. Dukungan yang Sedang dalam Tahap Pertimbangan: Tidak ada

3. Usulan yang Sedang Direncanakan atau dalam Taraf Persiapan: Tidak ada

III. Sarana

No Peralatan Laboratorium

1. Mikroskop binokuler (Olympus) Parasitologi FK Unsri

2. Thermal Cycle BBLK Palembang

3. Sentrifuge BBLK Palembang

4. Elektroforesis BBLK Palembang

5. Gel doc BBLK Palembang

IV. Biodata Peneliti

1. Ketua PenelitiA. Identitas Diri

1. Nama : dr. Dwi Handayani, MKes

2. NIP : 19811004 200912 2 001

3. Jenis Kelamin : Perempuan

4. Tempat/ Tanggal lahir: Palembang/ 4 Oktober 1981

5. Alamat rumah : Jl. Sutan Syahrir Lrg. H. Zahidin No. 1393 RT. 013

RW. 003 Kelurahan 5 Ilir, Ilir Timur 2, Palembang,

Sumatera Selatan 30115

6. Telp/ Hp : (0711) 714282 / 0812 7824209

7. Email : wie_dr@yahoo.com

B. RIWAYAT PENDIDIKAN

1999 – 2003 : Program Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya,

Indralaya, Sumatera Selatan.

2003 – 2005 : Program Profesi Dokter Fakultas Kedokteran Universitas

Sriwijaya.

2010 – 2013 : Program Studi Magister Biomedik Fakultas Kedokteran

Universitas Sriwijaya.

C. PENGALAMAN PENELITIAN (Lima Tahun Terakhir)

No Judul Penelitian Status Sumber Dana Tahun

1. Identifikasi Polimorfisme Val511Ala Pada Ekson 10 Gen Siklooksigenase-2 (COX -2)

Anggota

peneliti

Sateks 2010

Dalam Mempengaruhi Efektivitas Terapi Anti Inflamasi Pada Etnis Melayu.

2. Analisis gen yang berhubungan dengan timbulnya Resistensi Plasmodium falciparum terhadap Klorokuin dan Kombinasi Sulfadoksin-Pirimetamin di Sumatera Selatan.

Anggota

peneliti

Hibah

Fundamental

2011

3. Deteksi Mutasi Titik Gen Natrium Voltage Gated Channel menggunakan Polymerase Chain Reaction pada Aedes aegypti Resisten Sintetik Piretroid di Palembang.

Ketua

peneliti

Sateks 2011

4. Karakteristik Sosiodemografi Penderita Demodicidosis yang Berobat ke Rumah Sakit Dr. Moh. Hoesin Palembang.

Ketua

peneliti

Sateks 2012

5. Prevalensi Infeksi Soil Transmitted Helminths dan Hubungannya dengan Perilaku Hidup Sehat, Status Gizi, dan Hasil Prestasi Belajar pada Siswa SD di desa Sukarami Kecamatan Pamulutan Kabupaten Ogan Ilir.

Ketua

peneliti

Sateks 2013

D. PENGALAMAN KERJA

April 2006 – sekarang : Staf Pengajar Mata Kuliah Anatomi FK Unsri.

2011 – sekarang : Sekretaris Bagian Anatomi FK Unsri.

CURRICULUM VITAE ANGGOTA I

A. DATA PERSONAL

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Nama

Jenis Kelamin

Tempat/ Tanggal lahir

Alamat

Telp/ Hp

Email

:

:

:

:

:

:

Drg. Shanty Chairani, M. Si

Perempuan

Pangkal Pinang/ 21-07-1986

Jl. Letnan Murod No. 719/ 16 RT. 10 RW. 04

Perumahan Rakyat Talang Ratu Kecamatan Ilir

Timur I Palembang 30128

0812-73122212

nindela_adel@yahoo.com

B. RIWAYAT PENDIDIKAN

2012 – sekarang

2004 – 2010

2001 – 2004

1998 – 2001

1992 – 1998

:

:

:

:

Program Studi Biomedik FK Unsri

Fakultas Kedokteran Umum Universitas Sriwijaya.

SMUN 1 Palembang

SMPN 17 Palembang

SDN I9 Pangkalpinang

C. PENGALAMAN PENELITIAN

--- : ---

D. PENGALAMAN KERJA

2010 – sekarang : Dosen PNS Bagian Patologi Klinik FK Unsri

2010 – sekarang Anggota Komisi 1 UPK FK Unsri