Enzym Immunoassays HeterogenEnzym immunoassays (EIA) dapat diklasifikasikan berdasarkan analit (antigen atau antibodi), reaktan yang dilabel (antigen atau antibodi), metode deteksi (kompetitif atau non-kompetitif), dan metode pemisahan dari reaktan terikat dan yang bebas.

Secara garis besar ada 2 tipe EIA yaitu: Heterogen dan Homogen.

EIA heterogen yaitu jika salah satu dari analit ditempelkan (immobilisasi) pada fase padatan. Dalam EIA heterogen ini reaksi antigen-antibodi tidak mempengaruhi aktivitas dari label enzym.

Dalam EIA homogen, interaksi antigens-antibodi memperkuat aktivitas enzym, sehingga tahap pemisahan tidak diperlukan.

Semua EIA heterogen memerlukan paling tidak satu tahap pemisahan untuk memisahkan reagen yang bereaksi dengan yang tidak bereaksi.

Salah satu EIA yang paling banyak digunakan adalah ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

ELISA dapat diklasifikasikan menjadi kompetitif atau non-kompetitif tergantung pada apakah metode melibatkan suatu tahap reaksi di mana antigen tidak berlabel dan antigen berlabel diimmobilisasi pada suatu fase padatan.

Competitive Immunoassays

Competitive Immunoassays using antibody-enzyme conjugates

Target proteins from the sample bind to the container walls

Specific antibodies bind to their target protein and react causing a color change

Photometric reader quantifies by degree of color change

Non-competitive Immunoassays (Immunoenzymometric)

Digunakan untuk assay dari antigen univalensi. Terdiri dari 2 jenis yaitu 1. antigen yang dilabel 2. antibodi yang dilable

Single site Non-competitive Immunoassays

Single site Non-competitive Immunoassays (labeled antibody)

Two-site Non-competitive (Sandwich) Immunoassays

Hanya dapat digunakan untuk antigen-antigen bivalensi atau polivalensi

Non-competitive ELISA for Measuring Antibody

Melibatkan antigen terimmobilisasi yang bereaksi dengan sampel antibodi

Amplifikasi EIA

Banyak enzim dapat digunakan untuk menghasilkan molekul-molekul yang aktif sebagai katalis untuk reaksi yang lain, memberikan produk yang dapat dideteksi dengan baik. Katalis kedua ini dapat berupa enzim lain, enzim modulator, suatu substrate atau kofaktor yang berperan dalam reaksi-reaksi siklis.

Amplifikasi signal EIA dapat dilakukan melalui: 1. meningkatkan jumlah molekul enzim yang secara spesifik berikatan dengan dengan antibodi.2. Menggunakan suatu substrate yang sensitive yang dapat mendeteksi aktivitas minimal enzim.

Enzym Immunoassays Homogen

Homogeneous EIA dapat juga diklasifikasikan menjadi assay kompetitif atau non-kompetiitf. Assay kompetitif biasanya terdiri dari antigen berlabel enzim, substrat, kofaktor, modulator (mis: koenzim), aktivator, inhibitor, dan komponen-komponen lain.

Assay ini berdasarkan pada perubahan aktivitas enzim sebagai akibat dari reaksi kompetitif antibodi dengan antigen berlabel dan antigen bebas. Aktifitas enzim diinhibisi atau diaktivasi sebagai hasil dari pembentukan immunokompleks konjugat dengan antibodi. Assay ini cocok untuk menentukan antigen-antigen dengan bobot molekul rendah seperti obat-obatan atau hormon.

Assay non-kompetitif menggunakan suatu konjugat dari antibodi yang dilabel dengan enzim. Metode ini dapat dibagi menjadi 2 kategori yaitu:1.Proximal linkage assay yang didasarkan pada substrate channeling yang disebabkan oleh kontak satu enzim dengan enzim pasangannya.2.Berdasarkan modulasi aktivitas enzim yang disebabkan oleh ikatan antigen ke konjugat.

Assay Kompetitif : EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique), SLFIA (substrate-labeled fluorescein immunoassay), ARIS (Apoenzyme reactivation immunoassay), dan CEDIA ( cloned enzyme donor immunoassay)

Assay Non-kompetitif: EIHIA (enzyme inhibitor homogeneous immunoassay, AEST (associated enzyme-sensitive technique).

EMIT terdiri dari sebuah antibodi dan antigen berlabel enzim (konjugat). Aktivitas enzim dapat dimodulasi melalui interaksi antibodi–konjugat. EMIT digunakan untuk monitoring obat-obat terapi seperti digoxin, phenytoin, dan theophylline maupun untuk laboratorium klinik untuk mendeteksi penyalah gunaan obat atau hormon.

Ada 2 jenis EMIT berdasarkan penurunan atau penaikan aktifitas enzim.

ELFIA digunakan untuk mendeteksi obat-obat antibiotik, anticonvulsants, antiasthmatic.

Umbelliferone dilepaskan sebagai fluorogen ketika substrat dihidrolisis oleh β-galaktosidase. Ketika substrat berasosiasi dengan antibodi, halangan sterik tidak mengizinkan substrat untuk dihidrolisis oleh enzim. Substrat dihidrolisis ketika konjugat dilepaskan dari kompleks. Konsentrasi antigen sampel berbanding lurus dengan intensitas fluorescent dari fluorogen yang dihidrolisis.