HASIL PENGAMATAN BIOKIMPANG konstanta michaelis.pdf

EVELYN WIJAYA 240210120098

V. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Praktikum biokimia pangan yang terakhir ini adalah mengenai penentuan

konstanta Michaelis-Menten yang merupakan suatu parameter kinetika enzim.

Konstanta Michaelis, yang lebih dikenal dengan Km merupakan konsentrasi

substrat yang separuh dari lokasi aktifnya telah terisi, yaitu bila kecepatan reaksi

enzim telah mencapai Vmaks (Wiesman, 1989). Setiap enzim memiliki nilai

Km yang berbeda-beda untuk suatu substrat, dan ini dapat menunjukkan seberapa

kuatnya pengikatan substrat ke enzim (Radzicka dan Wolfenden, 1995).

Penentuan konstanta Michaelis dilakukan dengan 3 tahap yaitu pemurnian

atau isolasi enzim beta-Fruktofuranosidase kemudian hidrolisis sukrosa dengan

enzim tersebut dan uji benedict.

Beta-Fruktofuranosidase merupakan enzim yang terkandung di dalam

yeast yang penting dalam memacu hidrolisis sukrosa menjadi fruktosa dan

glukosa. Enzim ini dikenal sebagai enzim invertase atau sukrase karena sifatnya

yang menghidrolisis sukrosa atau meninvertasi sukrosa.

Sukrosa merupakan golongan gula non pereduksi sedangkan glukosa dan

fruktosa merupakan golongan gula pereduksi. Untuk menentukan konstanta

Michaelis dari reaksi hidrolisis sukrosa ini digunakan metode pengukuran

menggunakan pereaksi kuantitatif Benedict.

Isolasi enzim beta-Fruktofuranosidase dilakukan dengan cara

menghaluskan 1 gram yeast dengan menggunakan alu dan mortar. Penghalusan ini

bertujuan untuk memecah dinding sel ragi karena enzim berada dalam sel. Setelah

halus, ke dalam yeast tersebut ditambahkan larutan buffer dengan pH 5 sebanyak

100ml kemudian dimasukkan dalam tabung sentrifuse dan disentrifugasi dengan

kecepatan tertentu dan diambil filtratnya.

Tahap selanjutnya adalah hidrolisis sukrosa dengan menggunakan enzim

beta-Fruktofuranosidase. Tahapan hidrolisisnya yaitu sebagai berikut pertama-

tama praktikan membuat campuran dalam tabung reaksi berupa sukrosa, aquades,

serta larutan buffer dengan volume yang terdapat pada tabel berikut

I II III IV V

Sukrosa (ml) 10 8 6 4 2

Akuades (ml) 0 2 4 6 8

Buffer (ml) 6 6 6 6 6

(Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2013)


Selanjutnya tabung tersebut dipanaskan hingga mencapai suhu 32C

selama 5 menit. Setelah 5 menit, tabung didinginkan sebentar dan ditambahkan

sebanyak 4ml suspensi yeast 1% dan diinkubasi dengan suhu 37C selama 6

menit dan ditambahkan 2ml NaOH 1%. Campuran tersebut selanjutnya disebut

sebagai larutan A yang akan diuji dengan uji benedict.

Hidrolisis sukrosa disajikan dalam gambar berikut ini:

Gambar 5.1 Hidrolisis Sukrosa (Sumber: 2012books.lardbucket.org)

Uji benedict dilakukan dengan cara memasukkan larutan A ke dalam

tabung reaksi dan menambahkan 5ml larutan benedict kemudian dipanaskan

hingga 96C. Larutan A yang sudah dipanaskan tersebut didinginkan sebentar

baru selanjutnya dimasukkan ke dalam kuvet untuk dibaca absorbansinya melalui

spektrofotometer dengan menggunakan panjang gelombang () 630nm.

Benedict terdiri dari campuran CuSO4, asam sitrat, dan basa. Jika suatu

gula merupakan gula pereduksi (glukosa, galaktosa, dll) Cu akan berubah menjadi

Cu2O yang berwarna merah bata jika kadar gula tersebut tinggi, tetapi jika

rendah, maka akan berwarna hijau, merah, atau kuning.

Gambar 5.2 Reaksi Uji Benedict

(Sumber: chemistry-science29.blogspot.com)


Spektrofotometri adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan

fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang

gelombang tertentu, sementara fotometer merupakan alat untuk mengukur

intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorpsi.

Tabel 5.1 Hasil Pengukuran Nilai Absorbansi

Kelompok Tabung Nilai Absorbansi (A)

6 I 1313

7 II 1570

8 III 1030

9 IV 723

10 V 887


Tabel di atas menunjukkan hasil pengukuran nilai absorbansi (A) yang

ditunjukkan oleh spektrofotometer. Nilai absorbansi dari setiap tabung berbeda-

beda, selain itu apabila dibandingkan nilai absorbansinya juga fluktuatif. Nilai

absorbansi (A) selanjutnya digunakan untuk menghitung laju reaksi dengan

menggunakan rumus :

, di mana waktu yang digunakan yaitu

waktu inkubasi selama 6 menit (360 detik).

Tabel 5.2 Hasil Perhitungan Konsentrasi dan Laju Reaksi

Tabung Konsentrasi

[S]

Nilai Absorbansi

(A/1000)

Laju Reaksi

[V]

1/[S]

(x)

1/[v] (y)

I 0,525 1,313 3,65 x 10-3

1,905 273,973

II 0,42 1,570 4,36 x 10-3

2,381 229,358

III 0,315 1,030 2,86 x 10-3

3,175 349,650

IV 0,21 0,723 2,00 x 10-3

4,762 500

V 0,105 0,887 2,45 x 10-3

9,524 408,163


Laju reaksi dari setiap larutan dapat dilihat pada tabel di atas. Berdasarkan

pengamatan, semakin besar konsentrasi substrat, laju reaksi semakin tinggi.

namun jika dilihat, pada konsentrasi terbesar (tabung 1), laju reaksinya lebih

rendah dibandingkan dengan konsentrasi substrat yang berada pada tabung 2. Hal

ini menunjukkan bahwa kecepatan reaksi tidak banyak mengalami kenaikan

dengan bertambahnya konsentrasi substrat. Pada substrat konsentrasi tinggi,

semua molekul enzim dapat membentuk ikatan komplek dengan substrat (E-S)

yang selanjutnya dengan kenaikan konsentrasi substrat tidak berpengaruh pada

kecepatan reaksinya (Tranggono, 1990).


Setelah menghitung laju reaksi, praktikan kemudian menghitung Vmaks

dan juga Km dengan menggunakan data yang ada. Data untuk menghitung harga

Vmax dan Km adalah dengan membuat grafik hubungan antara 1/[v] dan 1/[S]

sehingga akan diperoleh persamaan linear, y = ax + b di mana y= 1/[v] dan x =

1/[S]. Intersep garis (b) yang didapat dari persamaan linear adalah

dan slope

(a) merupakan

(Suharto, 1995).

Grafik 1. Hubungan antara 1/[S] dan 1/[v]


Berdasarkan grafik di atas, semakin besar nilai substrat semakin tinggi

kecepatan reaksinya, namun ada suatu batas di mana penambahan konsentrasi

substrat tidak menambah kecepatan reaksi tetapi terjadi penurunan kecepatan

reaksi. Seharusnya garis penurunan tersebut cenderung konstan seperti yang

ditunjukkan oleh kurva dibawah ini menunjukkan bahwa kecepatan reaksi tidak

banyak mengalami kenaikan dengan bertambahnya konsentrasi substrat, jadi

jumlah enzim adalah faktor pembatasnya dan kecepatan maksimum telah dicapai

(Tranggono, 1990).

Gambar 5.3 hubungan konsentrasi substrat dengan kecepatan enzimatik

0

100

200

300

400

500

600

1,905 2,381 3,175 4,762 9,542

1/[

v]

1/[S]

y = 20,577x +

262,836


Setelah melakukan pembuatan grafik, didapatkan persamaan linear yaitu

y=20,577 x + 262,836. Persamaan ini didapatkan dengan cara melakukan

perhitungan regresi dengan menggunakan kalkulator di mana

merupakan x dan

merupakan y. Dari persamaan linear y=20,577 x + 262,836 di ketahui 20,557

sebagai slope dan 262,836 sebagai intersep. Vmaks dan Km dihitung

menggunakan persamaan kurva Lineweaver Burk, yaitu:

Berikut merupakan perhitungannya:

Vmaks= 0,0038 mol/ml.menit

Km= 0,0752

Nilai Km selain digunakan sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubungan

dengan tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjadi E dan S. Bila Km

kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap substrat tinggi,

sedangkan bila nilai Km besar afinitasnya menjadi rendah (Fox, 1991).

Berdasarkan hasil perhitungan nilai Km yang diperoleh yaitu 0,0752. Nilai ini

kecil dan menunjukkan bahwa afinitas atau kerja enzim terhadap substrat tinggi.

Harga Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan

lingkungan, dan kekuatan ion.


VI. KESIMPULAN

1. Konstanta Michaelis (Km) merupakan suatu konsentrasi substrat yang

menyebabkan kecepatan reaksi oleh katalis enzim menjadi kecepatan

maksimumnya (Vm).

2. Beta-Fruktofuranosidase merupakan suatu enzim yang terkandung di

dalam yeast dan berperan penting dalam merangsang hidrolisis sukrosa

menjadi fruktosa dan glukosa.

3. Nilai absorbansi suatu larutan yang diuji dengan spektrofotometer

bergantung pada konsentrasi substrat.

4. Efektivitas dari enzim dapat dilihat dari nilai Km di mana semakin kecil

nilai Km efektivitas enzimnya tinggi.

5. Nilai Km yang diperoleh dari hasil praktikum yaitu 0,0752.


DAFTAR PUSTAKA

Radzicka A, Wolfenden R. (1995). "A proficient enzyme". Science 6 (267): 90931. doi:10.1126/science.7809611

Suharto, I. 1995. Bioteknologi dalam Dunia Industri edisi 1. Andi Offset,

Yogyakarta.

Tranggono dan Sutardi. 1989. Biokimia dan Teknologi Pasca Panen. Yogyakarta:

Proyek Pengembangan Pusat Fasilitas Bersama Antar Universitas (Bank

Dunia XVII) PAU Pangan dan Gizi. Universitas Gadjah Mada.

Wiesman, A. 1989. Handbook of Enzymes Biothecnology 2nd

Edition. Ellis

Howard, New York.


JAWABAN PERTANYAAN

1. Bila diperoleh data berikut, tentukan nilai Vmax dan Km bagi reaksi suatu

enzim.

[S] M V

2,5 x 10-6

28

4,0 x 10-6

40

1 x 10-5

70

2 x 10-5

95

4 x 10-5

112

1 x 10-4

128

2 x 10-3

139

1 x 10-2

140

Jawab:

X = 1/[S] Y = 1/v

400000 0.035714286

250000 0.025

100000 0.014285714

50000 0.010526316

25000 0.008928571

10000 0.0078125

500 0.007194245

100 0.007142857

Perhitungan regresi

Y = 7 . 10-8

x + 0,0071

A (slope) = 7 . 10-8

B (intersep) = 0,0071

Vmaks = 1 / 0,0071

= 140,85 mol/L menit

Km = a(slope) x Vmak

= 7 .10-8

x 140,8

= 9,86 x 10-7

HASIL PENGAMATAN BIOKIMPANG konstanta michaelis.pdf

Documents

Transcript of HASIL PENGAMATAN BIOKIMPANG konstanta michaelis.pdf