HASIL DAN PEMBAHASAN

RT-PCR Konvensional dan Real Time

Percobaan membandingkan RT-PCR konvensional dan real time dilakukan

untuk mengetahui perbedaan sensitivitas kedua uji dalam mendeteksi VAI H5.

Virus yang digunakan sebagai kontrol positif (A/chicken/Indonesia/SmiWN

18/2009; GenBank accession number: JF302895) diencerkan secara serial 1:1

kemudian diekstraksi dan dilakukan RT-PCR H5 secara konvensional maupun

real time. Dengan RT-PCR konvensional, virus dapat terdeteksi hingga

pengenceran 2-14

sedangkan menggunakan teknik real time, virus dapat terdeteksi

hingga pengenceran 2-22

(Gambar 5). Perbedaan pengenceran hingga 28 ini

menunjukkan bahwa RRT-PCR dapat mendeteksi sampel dengan konsentrasi

hingga 250 kali lebih rendah dibandingkan RT-PCR konvensional. Lee dan

Suarez (2004) menemukan bahwa RRT-PCR H5 memiliki limit deteksi 103-10

4

salinan gen atau 10 EID50 dan kuantitas RNA yang ditentukan dengan metode

RRT-PCR berkorelasi erat dengan EID50 yang ditentukan dengan metode isolasi

virus pada embrio ayam.

a b

Gambar 5. Perbandingan hasil PCR konvensional dan real time (a) elektroforesis

gel RT-PCR konvensional, H5 terdeteksi hingga pengenceran 2-14

dan

(b) grafik amplifikasi RRT-PCR hingga pengenceran 2-22

.

Pada pengenceran virus 2-6

diperoleh nilai Ct 19,97 sehingga pengenceran

ini digunakan untuk mengencerkan stok virus yang kemudian diekstraksi dan

RNA hasil isolasi dibagi kedalam tabung-tabung berisi 8 µl untuk digunakan

sebagai kontrol positif PCR. Pembagian kontrol kedalam tabung-tabung dengan

37

volume satu atau dua kali run dilakukan untuk menghindari frezee-thaw. Untuk

kontrol positif isolasi RNA, stok virus diencerkan 2-15

dan dibagi kedalam tabung-

tabung berisi 100 µl sehingga dapat digunakan pada dua kali isolasi RNA.

Gambar 6. Grafik amplifikasi real time RT-PCR (a) matriks sampel bulan kedua

dan (b) subtipe H5 berbagai bulan pengambilan sampel. Grafik

eksponensial yang melewati threshold (garis hijau) menunjukkan hasil

positif sedangkan background noise di bawahnya merupakan hasil

negatif.

38

Gambar 6 menunjukkan hasil RRT-PCR MA sampel bulan kedua dan H5

berbagai bulan pengambilan sampel dengan kontrol positif dan negatif isolasi

RNA dan PCR Teknik RT-PCR konvensional mendeteksi RNA setelah reaksi

PCR selesai dan dilanjutkan dengan elektroforesis gel yang memerlukan waktu

serta melibatkan bahan kimia berbahaya seperti etidium bromida dan sejenisnya.

Sedangkan bahan kimia yang digunakan dalam RRT-PCR lebih aman dan

memungkinkan deteksi dilakukan pada tahap awal reaksi sehingga dalam hal ini

teknik real time lebih menguntungkan dibandingkan konvensional. Secara

konvensional hasil yang diperoleh bersifat kualitatif sedangkan secara real time

hasil yang diperoleh merupakan konsentrasi relatif RNA target dalam bentuk nilai

Ct dari perpotongan antara kurva amplifikasi dengan garis threshold.

Influenza A

Tingkat kesepakatan antara pengujian RRT-PCR matriks (MA RRT-PCR)

untuk mendeteksi keberadaan virus influenza A dan isolasi virus pada embrio

ayam tidak 100% sehingga RRT-PCR MA positif/isolasi virus negatif dan RRT-

PCR MA negatif/isolasi virus positif pada sampel usap dapat terjadi (Spackman et

al. 2002; Cattoli et al. 2004). Sensitivitas diagnostik relatif RRT-PCR terhadap

isolasi virus adalah 85,1% dengan spesifisitas 98,9% (Elvinger et al. 2007)

sehingga hasil RRT-PCR diinterpretasikan pada tingkat kandang/peternakan

daripada tingkat individu.

Dari 3.240 sampel yang diharapkan, berhasil dikoleksi 2.786 sampel karena

faktor kematian atau itik yang tidak ditemukan saat pengambilan sampel. Virus

influenza A dapat ditemukan di ketiga tipe peternakan, dan telah ada sejak awal

pengambilan sampel di peternakan tipe 1 dan 2. Pada peternakan tipe 1, VAI

terdeteksi hampir setiap bulan pengambilan sampel kecuali Januari (Tabel 2).

Keberadaan VAI di peternakan tipe 2 terdeteksi saat screening di bulan

September, Desember, Januari, dan Maret. Sedangkan pada peternakan tipe 3,

VAI hanya ditemukan di akhir pengambilan sampel bulan Maret pada sampel

usap kloaka dan orofaringeal itik sentinel maupun non sentinel.

Dari total 614 pool sampel usap kloaka dan orofaringeal yang diambil

selama tujuh bulan, didapati 98 (16%) pool positif VAI. Perbandingan usap

39

kloaka positif hampir seimbang dengan usap orofaringeal yaitu masing-masing 52

(53,1%) dan 46 (46,9%) dengan nilai Ct yang bervariasi (Tabel 2). Virus AI

terdeteksi secara berulang sejak saat screening pada bulan September di tiga

peternakan dari tipe 1 dan 2. Umumnya pengulangan terjadi pada dua waktu

pengambilan sampel kemudian virus menghilang dan terdeteksi kembali pada

bulan berikutnya atau virus hilang timbul pada tingkat pool dari waktu ke waktu

pengambilan sampel. Di tingkat peternakan, VAI dapat ditemukan hampir setiap

bulan pada peternakan tipe 1, kecuali bulan Januari pada P1 dan Januari-Februari

pada P2. Pada peternakan tipe 2 VAI lebih jarang ditemukan dan hanya berulang

pada P3 yaitu September, Desember, dan Januari. Sedangkan pada P4 VAI hanya

ditemukan di bulan Maret setelah itik dalam peternakan diganti dengan itik yang

dibeli dari peternak lain. Hal ini menunjukkan peran introduksi itik baru dalam

penularan VAI pada peternakan itik angon.

Tabel 2. Virus AI di tiga tipe peternakan itik angon Kabupaten Indramayu.

Peternakan Waktu pengambilan sampel Ct MA Subtipe H5

Tipe 1

September 2009 36-38 -

Oktober 2009 30-35 +

November 2009 25-33 -

Desember 2009 26-38 -

Januari 2009 - -

Februari 2009 36 -

Maret 2009 33-38 +

Tipe 2

September 2009 29-38 -

Oktober 2009 - -

November 2009 - -

Desember 2009 37 -

Januari 2009 29-37 +

Februari 2009 - -

Maret 2009 28-37 +

Tipe 3

September 2009 - -

Oktober 2009 - -

November 2009 - -

Desember 2009 - -

Januari 2009 - -

Februari 2009 - -

Maret 2009 28-37 -

Pengulangan kemunculan VAI dalam peternakan menunjukkan bahwa VAI

bersirkulasi di satu peternakan untuk waktu yang lama dan mungkin melibatkan

lebih dari satu strain virus meskipun shedding virus terjadi dalam rentang waktu

tertentu pada tingkat pool. Penelitian eksperimental pada itik berumur 2-16

40

minggu yang diinfeksi virus A/Mallard/MN/ 355779/00 (H5N2) mengeluarkan

virus yang terdeteksi dengan RRT-PCR hingga hari ke 16 pascainfeksi kemudian

virus tidak terdeteksi pada hari ke 21 (Costa et al. 2010). Percobaan lain

menunjukkan bahwa itik yang direinokulasi setelah 28 hari pascainfeksi awal

dengan virus yang sama (LPAI H7N2) tidak mengeluarkan virus melalui kloaka

maupun trakhea (Kida et al. 1980). Namun infeksi yang pernah terjadi tidak dapat

melindungi itik terhadap infeksi berikutnya oleh subtipe virus lain. Sebagai

contoh, itik yang diinfeksi subtipe H4N6 terlindungi dari infeksi ulang dengan

virus yang sama tetapi mengeluarkan virion selama 8 hari setelah ditantang

dengan isolat H11N3 (Austin dan Hinshaw 1984).

Tabel 3. Persentase sampel usap kloaka/orofaringeal positif di 6 peternakan itik

Tipe P VAI Sep-N Sep Okt Nov Des Jan Feb Mar Mar-N

1

1MA 0/0 0/33 33/50 17/17 33/17 0/0 0/0 20/0 17/0

H5 0/0 0/0 10/33 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

2MA 17/0 17/0 33/17 0/0 67/17 0/0 17/0 33/100 33/50

H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/4 0/0

2

3MA 50/50 50/17 0/0 0/0 33/0 67/67 0/0 0/0 0/0

H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 94/71 0/0 0/0 0/0

4MA 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 67/33 50/100

H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 8/0 0/43

3

5MA 0/0 0/0 0/0 17/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

6MA 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 100/100 100/100

H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Virus AI lebih banyak ditemukan pada peternakan tipe 1, diikuti tipe 2, dan

terendah pada peternakan tipe 3 selama periode pengambilan sampel. Pada P1 dan

P2 (tipe 1) terlihat pola pengulangan kemunculan VAI yang mirip satu sama lain.

Pada P3 dan P4 (tipe 2) pengulangan kemunculan VAI hanya terjadi pada P3 yang

memelihara itik hasil penetasan sendiri dengan wilayah angon sempit yaitu

disekitar kandang. Sedangkan pada P4 yang wilayah angonnya lebih luas dan

berinteraksi dengan P2 (tipe 1), VAI terdeteksi pada sampel usap sentinel pada

bulan akhir pengambilan sampel di lokasi yang sama dan setelah keduanya

mengganti itik. Hal ini menunjukkan bahwa kesamaan wilayah angon mungkin

mempengaruhi kemunculan VAI pada peternakan, sama seperti kontak intensif

antar itik dalam satu peternakan dan introduksi itik baru. Pada P5 dan P6 (tipe 3),

hanya salah satu peternakan yang terdeteksi VAI positif yaitu di akhir

pengambilan sampel sehingga tidak terlihat adanya pengulangan. Perbedaan

1

2

3

4

5

6

penemuan

VAI sanga

yang sel

mengeluar

mudah un

lebih mud

P6 di akhi

Subtipe H

Viru

(Gambar

diperiksa

terhadap s

positif H5

bahwa itik

saluran pe

Gambar 7

Subt

peternakan

seperti kem

di tingkat

satu petern

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Se

p-0

9 N

Se

p-0

9

Okt-

09

T

n VAI dalam

at dipengaru

lalu dikan

rkan virus i

ntuk dikenda

dah akibat k

ir pengambi

H5

us AI subt

7). Dari t

453 sampe

subtipe H5

5 masing-m

k angon yan

ernafasan di

K

. Distribusi

tipe H5 te

n tipe 1 (P1

munculan v

peternakan

nakan namu

Okt-

09

No

v-0

9

De

s-0

9

Ja

n-1

0

Feb-1

0

Tipe 1

m satu tipe

uhi oleh ke

ndangkan m

influenza A

alikan. Nam

kontak inten

ilan sampel

tipe H5 ha

total 98 sa

el individu

dengan pe

masing 18

ng diteliti m

ibandingkan

Kloaka Or

i temporal V

erdeteksi p

Oktober, P

virus influen

n. Hal ini m

un tidak be

Mar-

10

Mar-

10 N

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

peternakan

adaan lingk

memiliki

A karena ke

mun bila ter

nsif antar it

pada bulan

anya ditemu

ampel pool

u dan didap

rbandingan

(36,7%) da

mengeluarka

n pencernaa

rofaring H

VAI di tiga

pada samp

P2 Maret) d

nza A, subti

menunjukka

rtahan lama

Se

p-0

9 N

Se

p-0

9

Okt-

09

No

v-0

9

Tipe 2

n ini menun

kungan mas

kecenderun

ebersihan da

rjadi infeksi

tik dalam k

n Maret (Tab

ukan pada

l yang pos

pati 49 (10

n sampel us

an 31 (63,3

an VAI subt

an.

H5 Kloaka

tipe peterna

pel usap k

an tipe 2 (P

pe H5 tidak

an bahwa su

a karena ke

De

s-0

9

Ja

n-1

0

Feb-1

0

Mar-

10

Ma

r1

0N

2

njukkan bah

sing-masing

ngan lebih

an keamana

i maka penu

kandang sep

bel 3).

peternakan

sitif terhada

0,9%) samp

sap kloaka d

3%). Hal in

tipe H5 lebi

H5 Orof

akan itik an

kloaka dan

P3 Januari, P

k ditemukan

ubtipe H5

emudian me

Ma

r-1

0N

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Se

p-0

9 N

S0

9

hwa kemun

g peternakan

h sedikit/j

an biologis

ularan juga

perti terjadi

n tipe 1 d

ap influenz

pel yang p

dan orofari

ni menunju

ih sering m

faring

ngon

n orfaringe

P4 Maret). T

n secara beru

dapat munc

enghilang se

Se

p-0

9

Okt-

09

No

v-0

9

De

s-0

9

Ja

n-1

0

Tipe 3

41

nculan

n. Itik

arang

lebih

akan

pada

dan 2

za A,

positif

ingeal

ukkan

elalui

al di

Tidak

ulang

cul di

eiring

Ja

n1

0

Feb-1

0

Mar-

10

Mar-

10 N

42

kematian itik yang terinfeksi atau pembersihan virus (clearance). Temuan ini

didukung oleh hasil penelitian yang menginfeksi virus H5N1 HPAI maupun LPAI

pada itik dan menghasilkan shedding virus terdeteksi hingga hari ke 11-17

pascainfeksi kemudian virus menghilang (Hulse-Post et al. 2005).

Jumlah VAI subtipe H5 yang ditemukan bervariasi selama pengambilan

sampel. Dilihat dari tipe peternakan, VAI H5 lebih banyak ditemukan pada tipe 2,

diikuti tipe 1, dan tidak ditemukan pada tipe 3 (Tabel 4). Pada P1 dan P2 (tipe 1)

subtipe H5 lebih banyak ditemukan pada sampel usap orofaringeal. Subtipe H5

ditemukan di P1 setelah sebelumnya 10 ekor sentinel mati. Temuan ini membuka

kemungkinan bahwa virus yang ada di peternakan tipe 1 merupakan HPAI pada

itik yang dicirikan oleh virus lebih tinggi/sering ditemukan pada usap orofaringeal

dibandingkan usap kloaka (Sturm-Ramirez et al. 2004; Keawcharoen et al. 2008).

Hal ini juga didukung oleh hasil penelitian yang menginfeksi itik dengan isolat

HPAI H5N1 setelah 2002 dan menemukan bahwa shedding virus melalui trakhea

secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kloaka (Sturm-Ramirez et al. 2005)

terlepas dari rute infeksi. Penemuan VAI H5 yang kemungkinan merupakan HPAI

pada peternakan tipe 1 yang sepenuhnya memelihara itik dengan cara diangon ini

dikhawatirkan akan berdampak pada penyebaran virus ke lingkungan maupun

unggas lain dalam wilayah yang luas. Hal senada juga dilaporkan oleh Gilbert

(2006) yang menemukan keterkaitan erat antara tingginya H5N1 di Thailand

dengan besarnya jumlah itik angon yang didukung oleh luasnya pertanian basah

serta tingginya populasi unggas darat, dan manusia.

Tabel 4. Virus AI subtipe H5 di peternakan itik angon, Indramayu

Tipe PKeadaan

peternakan

Asal itik Bulan Rute Jml Ct

1

110 ekor sentinel mati Penetasan

sendiri

Oktober kloaka

orofaringeal

1

5

33

29-35

2itik baru, 4 ekor

sentinel mati

Peternakan

lain

Maret orofaringeal 1 36

2

3kematian meningkat,

2 ekor sentinel mati

Penetasan

sendiri

Januari kloaka

orofaringeal

16

12

21-36

19-36

4

itik baru, 3 ekor

sentinel mati

Peternakan

lain

Maret

Maret-

NS

kloaka

orofaringeal

1

13

35

16-36

Pada

di bulan J

dengan rat

tinggi dib

5,32) dan

tersebut m

positif leb

fekal-oral

yang dipe

infeksi VA

epitel salu

a

b

Gambar 8

a P3 (tipe 2

anuari men

ta-rata kons

bandingkan

27,83 (STD

merupakan v

bih tinggi dib

(Webster e

eroleh pada

AI sebelum

uran pencern

. Distribusi

angon ke

didatangi

bulan pe

menunjuk

2) VAI H5 l

gikuti kema

sentrasi viru

orofaring,

D 5,64). Hal

virus LPAI

bandingkan

et al. 1992

a peternakan

tahun 2002

naan (Webs

i wilayah

eenam pete

peternakan

ngambilan

kkan bulan d

lebih banya

atian 2 itik

us yang diek

terlihat dar

l ini membu

pada itik y

n orofaringe

2). Temuan

n tipe 1 in

2 yang umu

ster et al. 19

angon itik

ernakan dan

n angon pad

sampel (1

ditemukan s

ak ditemuka

sentinel (ter

kskresikan

ri nilai Ct m

uka kemung

yang dicirika

eal dan biasa

yang berto

ni bisa saja

mnya tidak

978).

k Kabupaten

n (b) lokas

da bulan ter

1-6 = Okto

subtipe H5.

an pada sam

rendah dian

melalui klo

masing-mas

gkinan bahw

an oleh jum

anya ditular

olak belaka

terjadi kar

k patogen pa

n Indramay

si peternak

rtentu. Angk

ober-Maret)

mpel usap k

ntara petern

oaka sedikit

sing 27,68

wa VAI H5

mlah usap k

rkan melalu

ang dengan

rena situs u

ada itik adal

yu. (a) wi

kan tipe 3

ka menunju

). Angka m

43

kloaka

akan)

lebih

(STD

di P3

kloaka

ui rute

hasil

utama

lah di

ilayah

yang

ukkan

merah

44

Meskipun sesama tipe 2 yang memelihara itik dengan cara dikandangkan

dan diangon, P3 memiliki luas wilayah angon yang lebih sempit dibandingkan P4

(Gambar 8). Hal ini menjadi alasan mengapa infeksi VAI H5 lebih tinggi pada P3

dibandingkan P4, mengingat wilayah yang sempit meningkatkan intensitas kontak

antar itik dalam kandang. Temuan ini didukung oleh hasil penelitian yang

melaporkan bahwa kepadatan populasi dapat meningkatkan prevalensi (Okazaki

et al. 2000; Munster et al. 2007; Wallensten et al. 2007).

Pada P4 yang wilayah angonnya lebih luas dibandingkan P3 (sesama tipe 2)

dan berpotongan dengan P2 (tipe 1) di bulan yang sama dengan penemuan VAI

H5 yaitu Maret, subtipe H5 lebih banyak ditemukan pada sampel usap

orofaringeal itik non-sentinel yang baru dibeli dari peternak lain (sama seperti P2)

(Gambar 8). Hal ini menimbulkan kecurigaan bahwa itik sentinel terpapar pada

virus yang dibawa oleh itik baru dari tempat pembibitan meskipun perpotongan

wilayah angon juga dapat berperan dalam meningkatkan kontak itik antar

peternakan. Namun demikian, penularan yang terjadi tidak berlangsung intensif

karena kerenggangan populasi (Hinshaw et al. 1985) sehingga prevalensi VAI H5

pada P4 lebih rendah dibandingkan P3. Keberadaan VAI H5 pada itik angon

dalam penelitian ini menunjukkan indikasi bahwa populasi itik angon berperan

penting sebagai reservoir dan pembawa VAI H5 yang efektif serta berpotensi

mempertahankan keberadaan dan menyebarkan virus ke lingkungan maupun

unggas lain yang rentan.