BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan selama 3 bulan di Laboratorium Taksonomi

Tumbuhan Fakultas Biologi, Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Kedokteran dan

Laboratorium Biologi Farmasi Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu-Ilmu

Kesehatan Unsoed Purwokerto.

B. Alat dan Bahan

1. Alat Penelitian

Alat yang digunakan adalah timbangan, neraca analitik, oven,

autoklaf, penangas air, evaporator, lumpang alu, alat-alat gelas, inkubator,

mikropipet, lampu spirtus, corong buchner, jarum ose, wrapping, kapas,

cotten bat steril, batang drÜgalsky, kertas alumunium foil dan bunsen.

2. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah manggis dari

Kecamatan Rawalo, Kabupaten Banyumas. Bahan kimia yang digunakan

adalah etanol 70%, isolat S.flexneri dari Laboratorium Mikrobiologi Jurusan

Kedokteran UNSOED, media Nutrien Broth (NB), media Muller Hinton Agar

(MHA), akuades dan ciprofloksasin.

14

15

C. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium. dengan

konsentrasi ekstrak kulit buah manggis yang digunakan adalah 6 konsentrasi yaitu

50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12 %, dan 1,56%. Masing-masing konsentrasi akan

diulang sebanyak 3 kali.

Variable penelitian yang diamati adalah sebagai berikut :

1. Variabel Bebas

Variabel bebas adalah variasi konsentrasi ekstrak etanol 70% kulit buah

manggis.

2. Variabel Terikat

Variabel terikat adalah kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh

minimum (KBM) ekstrak etanol kulit buah manggis.

3. Variabel Terkendali

Variabel terkendali adalah suhu incubator.

Tahapan penelitiannya adalah sebagai berikut :

1. Ekstraksi kulit buah manggis dengan menggunakan metode maserasi.

2. Uji KHM dan KBM ekstrak etanol kulit buah manggis terhadap bakteri

S.flexneri dengan metode dilusi cair.

Kulit buah manggis (G. mangostana)

Serbuk simplisia

Ekstrasi

Ekstrak kental

Uji KHM dan KBM dengan dilusi cair

Kesimpulan

Analisis

16

Tahapan penelitian secara skematis yang akan dilakukan dapat dilihat pada

gambar 3.1

Dideterminasi

Dibersihkan

Dikeringkan

Dimaserasi denagan etanol 70% selama 3x24 jam

dievaporasi

Gambar 3.1. Diagram Alir Penelitian

D. Jalannya Penelitian

1. Determinasi Tumbuhan

Buah manggis diperoleh dari Kecamatan Rawalo Kabupaten

Banyumas. Kemudian buah manggis dilakukan determinasi dan deskripsi

17

untuk mengetahui kebenaran sampel yang digunakan dalam penelitian.

Determinasi ini dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas

Biologi UNSOED.

2. Penyiapan Bahan

Buah manggis dibersihkan kemudian dipisahkan antara buah dan kulit

buah manggis. 10 kg buah manggis didapatkan 4,8 kg kulit buah manggis.

Kulit buah manggis yang telah dipotong kecil-kecil kemudian dijemur terlebih

dahulu selama 7 jam dipanas matahari dengan ditutup kain hitam kemudian

dikeringkan di dalam oven dengan suhu 700 C selama 1x18 jam. Kemudian

simplisia kering ditumbuk sampai menjadi serbuk lalu diayak dengan ayakan

4/18 (Poeloengan, 2010).

3. Pembuatan Ekstrak

Hasil dari simplisia kering didapatkan serbuk kulit buah manggis 400

gram. Serbuk direndam dalam etanol 70% selama 3x24 jam, kemudian

diambil filtratnya dengan cara disaring menggunakan corong buchner. Filtrat

dipekatkan dengan menggunakan evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat

dan tidak mengandung etanol.

4. Uji Antibakteri

a. Pembuatan Medium Nutrien Broth (NB)

Pembuatan medium NB oxoid menurut aturan yang tertera dalam kemasan

adalah sebanyak 13 gr dilarutkan kedalam 1000 ml aquades. Satu kali

pengujian membutuhkan 10 tabung, 1 tabung berisi 10 ml medium cair.

18

Pengujian dilakukan 3 kali pengulangan. Medium disterilkan dengan

menggunakan autoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1 atm selama 15 menit.

b. Pembuatan Medium Mueller Hinton Agar (MHA)

Medium yang digunakan untuk pengujian adalah Mueller Hinton Agar

Oxoid yang memiliki formula (300 gr/L), Casein hydrolysate (17,5 gr/L),

Starch (1,5 ge/L), Agar (17 gr/L). Medium MHA dibuat dengan cara

melarutkan sebanyak 3,8 gram serbuk medium MHA (Oxoid) instan ke dalam

100 ml aquades. Selanjutnya medium dipanaskan di atas hot plate dan di aduk

sehingga semua bahan larut. Medium dimasukkan ke dalam beberapa tabung

reaksi ± 15 ml, lalu ditutup dengan alumunium foil dan disterilkan

menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15-20

menit (Bridson, 1998).

c. Pembuatan Inokulum Bakteri Uji

Sebanyak satu ose isolat S. flexneri dari biakan agar dan

diinokulasikan ke dalam 10 ml media NB steril. Kemudian diinkubasi di

dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam.

d. Pembuatan Larutan Uji

Variasi konsentrasi larutan uji dibuat dengan pengenceran ekstrak

kental ditambahkan akuades. Pengenceran larutan stok ini menggunakan

rumus pengenceran.

19

Ket:

C1 = konsentrasi larutan stok

V1 = volume larutan stok

C2 = konsentrasi larutan uji

V2 = volume larutan stok

e. Uji KHM dan KBM S. flexneri (Khunaifi, 2010).

Penelitian ini menggunakan metode dilusi yang meliputi dua tahap,

yaitu penentuan KHM (Kadar Hambat Minimum) dan KBM (Kadar

Bunuh Minimum). Konsentrasi ektrak etanol kulit manggis yang

digunakan adalah 6 konsentrasi yaitu 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12 %,

dan 1,56% . Masing-masing konsentrasi yang telah dibuat diambil 1 ml

dan ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S flexneri dan ditambah 5 ml

Nutrien Broth. Ada 2 kelompok tambahan yaitu kelompok kontrol

negatif dan kontrol positif masing-masing pelakuan diinkubasi selama

1x24 jam. Sehingga penelitian ini dibagi menjadi 8 kelompok:

1. Kelompok perlakuan 1 (P1) untuk konsentrasi 50% : sebanyak 1 ml

ekstrak etanol kulit buah manggis 50% ditambah dengan Nutrien Broth 5

ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S flexneri.

2. Kelompok perlakuan 2 (P2) untuk konsentrasi 25% : sebanyak 1 ml

ekstrak etanol kulit buah manggis 25% ditambah dengan Nutrien Broth 5

ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S.flexneri.

V1 C1 = V2 C2

20

3. Kelompok perlakuan 3 (P3) untuk konsentrasi 12,5% : sebanyak 1 ml

ekstrak etanol kulit buah manggis 12,5% ditambah dengan Nutrien Broth

5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S.flexneri

4. Kelompok perlakuan 4 (P4) untuk konsentrasi 6,25% : sebanyak 1 ml

ekstrak etanol kulit buah manggis 6,25% ditambah dengan Nutrien

Broth 5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S flexneri

5. Kelompok perlakuan 5 (P5) untuk konsentrasi 3,12% : sebanyak 1 ml

ekstrak etanol kulit buah manggis 3,12% ditambah dengan Nutrien Broth

5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S flexneri

6. Kelompok perlakuan 6 (P6) untuk konsentrasi 1,56% : sebanyak 1 ml

ekstrak etanol kulit buah manggis 1,56% ditambah dengan Nutrien Broth

5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S.flexneri

7. Kelompok kontrol negatif (K-) yaitu 5 ml Nutrien Broth ditambah 0,1 ml

suspensi bakteri S.flexneri

8. kelompok kontrol positif (K+) yaitu 5 ml Medium Nutrien Broth

ditambah ciprofloksasin yang dilarutkan dengan etanol dan ditambah 0,5

ml suspensi bakteri S.flexneri

Masing-masing kelompok diatas dilakukan pengulangan sebanyak tiga

kali. Semua tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 1x24 jam,

kemudian diamati antara kelompok perlakuan dan kontrol. Larutan sampel

dengan kosentrasi terkecil yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri

(ditandai dengan kejernihan secara visual yang dinilai oleh tiga pengamat secara

independent) dinyatakan sebagai Kadar Hambat Minimum (KHM). Umtuk

21

mengetahui nilai Kadar Bunuh Minimum (KBM) dapat diketahui dengan cara

menggoreskan larutan yang telah didapat pada penentuan KHM pada medium

Mueller Hinton Agar (MHA) setelah itu baru dimasukkan dalam inkubator selama

1x24 jam . Konsentrasi terendah dimana pada media tidak terdapat pertumbuhan

koloni bakteri ditentukan sebagai KBM. Pertumbuhan bakteri dapat dihitung

dengan menggunakan colony counter. Masing-masing dilakukan 3 kali

pengulangan (Ramadanti, 2008).

Pengamatan dan perhitungan dilakukan pada jumlah koloni dan rata-rata

koloni, kemudian dapat ditentukan presentase penghambatannya dengan

menggunakan perhitungan sebagai berikut :

% penghambatan = A - BA

x 100%

Keterangan : A = Rata-rata koloni kontrol B = Rata-rata koloni perlakuan

E. Analisis Data

Data hasil penelitian Kadar Hambat Minimum dan Kadar Bunuh Minimum

suatu bakteri dilakukan secara deskriptif dengan melihat kejernihan secara visual

yang dilihat oleh tiga pengamat independent. Setelah didapatkan data kemudian

dianalisis dan ditarik kesimpulan.