METODE UNTUK DETEKSI ASAM NUKLEAT (DNA)

Agasta Prio Prasetyo 1306415926

Abstrak

Asam nukleat, terutama DNA dan RNA dari sebuah sistem biologis, diteliti oleh para mikrobiologis dan insinyur genetik karena setiap susunannya mengekspresikan gen dan fungsi tertentu. Tidak ada DNA satu individu yang sama persis dengan DNA individu lainnya, walaupun keduanya termasuk ke dalam golongan satu spesies. Namun, semakin dekat kekerabatan suatu individu, semakin mirip pula sekuens DNA mereka. Variasi sekuens ini membutuhkan metode identifikasi DNA dan RNA yang mampu mendeteksi pada skala nanometer untuk mempermudah aplikasi di bidang genetika. Beberapa metode identifikasi DNA, diantaranya adalah elektroforesis gel, hibridisasi, staining, PCR (Polymerase Chain Reaction), dan blotting.

Kata Kuncistaining; elektroforesis; blotting; hibridisasi; probe; PCR; sequencing; Sanger; Maxam-Gilbert; spektrofotometri

PendahuluanAsam nukleat merupakan molekul vital yang bertanggung jawab terhadap fungsi-

fungsi tertentu yang dapat dilakukan oleh sebuah sel makhluk hidup maupun virus. DNA (Deoxyribonucleic acid) dan RNA (Ribonucleic acid) adalah biopolimer pembawa informasi yang memberikan instruksi genetik pada suatu sistem biologis.

Struktur asam nukleat terdiri dari gugus fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen. Gugus fosfat berikatan dengan gula pentosa, sedangkan gula pentosa berikatan dengan salah satu dari empat basa nitrogen, membentuk nukleotida. Basa nitrogen yang berikatan dengan gula pentosa, atau yang disebut sebagai nukleosida, terdiri dari 4 macam: adenosine (A), guanine (G), thymin (T) (urasil, U, untuk RNA), dan cytosine (C). Keberadaan salah satu dari empat jenis basa nitrogen di dalam nukleotida kemudian membentuk suatu sekuens (sequence) polinukleotida yang masing-masing sekuensnya mengkspresikan gen tertentu. Sekuens basa nitrogen inilah yang dianalisis oleh para mikrobiologis dan insinyur genetik dengan menggunakan beberapa metode deteksi asam nukleat, baik DNA maupun RNA.

Bentuk DNA berupa untai ganda yang melingkar seperti spiral (double helix), yang mana masing-masing untainya memiliki deretan basa nitrogen yang komplementer dengan basa nitrogen pada untai yang lain. Sebelum identifikasi, ekstraksi dan pemurnian DNA dilakukan terlebih dahulu. DNA yang telah dimurnikan masih terlalu panjang untuk dapat dianalisis sehingga pemotongan DNA hingga menjadi fragmen-fragmen dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi yang memotong pada restriction area tertentu. Pemotongan DNA hingga menjadi fragmen-fragmen tersebut dilakukan dalam tabung silinder. Namun, kita tidak dapat mengetahui ukuran atau kode DNA tersebut hanya dengan melihat tabung itu saja.

Elektroforesis gel termasuk salah satu metode pemisahan DNA berdasarkan ukuran yang paling banyak digunakan. Teknik ini mampu mendeteksi berbagai macam ukuran DNA pada suatu sampel. Sebelum dipisahkan melalui elektroforesis, biasanya pewarnaan/staining/labelling dilakukan pada sampel DNA karena sifatnya yang berwarna bening sehingga menjadi sulit dideteksi. Artikel ini akan membahas mengenai metode pendeteksian asam nukleat selanjutnya, yaitu bertujuan untuk mengetahui urutan basa nukleotida DNA sampel tersebut melalui deteksi kualititatif dan konsentrasi serta kemurniannya melalui deteksi kuantitatif.

1. PCR1.1. Pengertian dan Kegunaan PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperbanyak jumlah DNA suatu sampel. Perbanyakan DNA ini memiliki tujuan tertentu, misalnya untuk mengetahui keberadaan materi genetik suatu mikroorganisme atau mengetahui penyebab penyakit turunan (penyakit genetik). Dalam prosesnya, PCR akan melalui beberapa siklus, biasanya 25 hingga 35 siklus. Semakin banyak siklus yang dilkukan, maka akan semakin banyak jumlah DNA yang digandakan sehingga akan lebih mudah untuk mendeteksi keberadaan suatu materi genetik.

1.2. Langkah dan Cara Kerja PCRPCR dapat menyalin urutan DNA sebanyak jutaan salinan dalam satu jam.

Yang dibutuhkan oleh PCR untuk melakukan perbanyakan DNA adalah sebuah sampel DNA yang telah diekstrak dari suatu sel, beberapa reagen, dan pengatur suhu untuk memecah ikatan rantai ganda pada sampel DNA dan mengoptimalkan kerja reagen.

Terdapat beberapa langkah untuk memperbanyak DNA menggunakan metode PCR, yaitu

Memasukkan sampel DNA yang ingin direplikasi ke dalam tabung reaksi (lihat Gbr 1.). Tabung ini harus tahan terhadap perubahan suhu yang terjadi secara terus-menerus karena PCR membutuhkan suhu yang berubah-ubah selama prosesnya.

Menambahkan primer 1. Primer adalah reagen yang digunakan untuk menemukan lokasi dari fragmen DNA target dan akan mengait pada fragmen DNA tersebut

Menambahkan primer 2 Menambahkan nukleotida berupa dNTP. Nukleotida adalah suatu basa A, C,

T, G yang akan membentuk kode DNA. Menambahkan taq DNA polymerase. Reagen yang mampu membaca kode

DNA dan menyocokkannya dengan nukleotida sehingga dapat membentuk untaian DNA yang baru.

Gbr 1. Tabung PCR (sumber: en.wikipedia.org)

Setelah tabung reaksi terisi dengan sampel DNA dan reagen tersebut, tabung reaksi dimasukkan ke dalam mesin yang biasa disebut dengan thermocycler. Secara garis besar, proses PCR terdiri dari 5 tahap, yaitu (1) pra-denaturasi sampel DNA; (2) denaturasi sampel DNA; (3) annealing; (4) pemanjangan primer ( extension) dan (5) post-extension. Untuk lebih jelasnya, di bawah ini merupakan proses PCR:

Untuk memulai reaksi, suhu pada thermocycler akan meningkat hingga 95oC. Pada suhu ini, rantai ganda pada DNA akan mengalami denaturasi sehingga membentuk dua rantai tunggal yang terpisah

Setelah itu, suhu akan turun hingga 50-65oC. Pada suhu ini, kedua rantai tunggal yang telah terpisah berusaha untuk menyatu membentuk rantai ganda kembali. Namun, primer yang ada akan menghalangi terbentuknya rantai ganda tersebut dengan cara mengait dengan fragmen DNA rantai tunggal sebelum rantai ganda terbentuk.

Suhu akan naik menjadi 72oC. Dengan naiknya suhu tersebut, maka DNA polmyerase akan teraktivasi. Selanjutnya DNA polymerase akan menuju primer yang telah terkait dengan untaian fragmen DNA rantai tunggal dan akan mulai membentuk nukleotida komplemen pada untaian tersebut hingga ujung bagian dari untaian tersebut.

Dengan selesainya tahap tersebut, maka siklus pertama selesai dan akan berlanjut pada siklus kedua dengan langkah yang sama dengan siklus pertama.

Mulai siklus ketiga, salinan dari untaian DNA target yang diharapkan mulai terbentuk. Dengan begitu, pada siklus-siklus selanjutnya salinan akan terbentuk lebih banyak lagi.

Gbr 2. Mesin PCR (thermocycler) (sumber: wisbiomed.com)

Gbr 3. Proses yang terjadi pada PCR (sumber:contexo.info)

Jumlah salinan fragmen DNA target yang terbentuk pada akhir siklus PCR dapat dihitung dengan rumus berikut :

Y = jumlah salinan DNA

n = jumlah siklus

x = jumlah sampel DNA awal

Setelah penggandaan DNA dengan PCR selesai, produk dari PCR tersebut dapat dianalisis dengan metode elektroforesis gel. Dengan elektroforesis gel ini, maka dapat diketahui jumlah estimasi pasang basa dari sampel DNA tersebut.

2. Elektroforesis Gel (Gel Electrophoresis)2.1. Penegertian dan Prinsip Elektroforesis Gel

Elektroforesis gel adalah suatu metode yang umum digunakan untuk menganalisis suatu DNA. Metode ini berguna untuk memsisahkan suatu fragmen DNA berdasarkan ukurannya sehingga kita dapat mengetahui estimasi dari jumlah pasangan asam basa satu sampel DNA.

Teknik elektroforesis ini bekerja berdasarkan fakta yang mana DNA memiliki muatan negatif pada suasana yang netral. Oleh karena itu, ketika arus listrik dialirkan pada DNA tersebut, maka DNA akan bergerak menuju muatan positif. Medium yang digunakan pada metode ini adalah agarose gel.

2.2. Langkah yang Dibutuhkan dalam Teknik Elektroforesis GelBerikut ini adalah langkah-langkah yang dperlukan untuk mendeteksi jumlah

pasangan basa dari sampel DNA : Membuat Gel atau agarose

Untuk membuat gel atau agarose ini, bahan yang dibutuhkan adalah bubuk agarose yang menyerupai gelatin, namun terbuat dari rumput laut, dan larutan buffer. Larutan buffer berguna untuk membuat tegangan listrik dapat mengalir melalui gel. Kemudian, kedua bahan tersebut dicampur dengan memasukkannya ke dalam labu erlenmayer. Setelah itu, labu ditutup dengan plastik dan dimasukkan ke dalam oven kemudian dipanaskan.

Setelah proses pemanasan dalam oven selesai larutan agarose dituang ke dalam pencetak dan meletakkan sisir agarose pada salah satu ujung gel sehingga ketika agarose mengeras, akan terbentuk lubang untuk meletakkan sampel DNA yang akan dianalisis.

Menyiapkan kotak elektroforesisLangkah pertama adalah menuangkan larutan buffer ke dalam kotak

eletroforesis agar listrik dapat mengalir dan mencegah gel mengering selama eksperimen berlangsung. Kemudian, memasukkan gel yang sudah mengeras beserta cetakannya ke dalam kotak elektroforesis yang telah berisi larutan buffer tersebut.

Menginjeksi sampel DNA ke dalam AgaroseAlat dan bahan yang digunakan pada langkah ini adalah:o Micropipetteo Pipette tipso Kotak elektroforesis yang berisi larutan buffer dan agarose

o Buffer yang mengandung pewarnao Sampel DNAo DNA standar yang telah diketahui panjangnya

Sedangkan langkah-langkahnya adalah sebagai berikut:

o Mencampurkan larutan buffer yang mengandung pewarna sehingga sampel DNA akan memiliki warna dengan menggunakan pipet tip dan micropipettor

o Memasukkan campuran sampel DNA dan buffer ke lubang pada gel agaroese menggunakan pipet tip yang bersih dan micropipette.

o Memasukkan DNA standar ke lubang lainnya pada gel agarose.

Mengalirkan Arus Listrik pada Kotak ElektroforesisSetelah gel berisi sampel DNA dan DNA standar, kotak elektroforesis

dihubungkan ke sumber tegangan. Dengan adanya gelembung udara pada kedua elektroda pada kotak elektroforesis, berarti tegangan listrik sudah mengalir dengan baik.

Dengan adanya aliran listrik tersebut, DNA yang memiliki muatan negatif ini akan menuju ke kutub positif. Butuh waktu beberapa saat untuk memastikan bahwa DNA telah bermigrasi dengan sempurna. Namun, migrasi dari DNA ini tidak dapat dilihat, hanya migrasi dari loading buffer saja yang terlihat.

Gbr 4. Proses elektroforesis gel (sumber: buku)

Proses Pewarnaan DNA dan Analisis Hasil Elektroforesis GelKetika DNA telah bermigrasi sempurna, maka proses running selesai.

Setelah itu, gel agarose dikeluarkan. Sebelum menganalisis hasilnya, DNA harus diberi pewarnaan dengan menggunakan ethidium bromide. Ethidium bromide ini dapat memancarkan warna ketika disinari oleh cahaya fluoroscent. Dengan adanya perwarnaan ini, kita dapat dengan mudah melihat hasil migrasi DNA. Meskipun kita tidak dapat melihat masing-masing untaian DNA, kita tetap dapat melihat grup DNA yang bermigrasi tersebut. Setelah diberikan pewarnaan, gel agarose diletakkan pada UV-light box dan akan tampak hasilnya seperti gambar di bawah ini

Gbr 5. Tampilan hasil elektroforesis (sumber: www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/)

Fragmen DNA dengan jumlah pasangan basa yang lebih sedikit akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan fragmen DNA dengan jumlah pasangan basa yang lebih banyak.

3. DNA SequencingDNA sequencing adalah suatu metode yang digunakan untuk menentukan urutan

dari suatu molekul DNA. Pada prosedur ini, dibutuhkan suatu cetakan DNA, Taq DNA polymerase, primer, dNTP, dan ddNTP (dideoxyribonucleoside triphosphates) dengan konsentrasi yang rendah. Setiap ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, dan ddTTP) telah dimodifikasi dengan penambahan pewarnaan fluorescent yang berbeda-beda pada ujung 3’.

Reaksi sequencing dimulai dengan memanaskan DNA sehingga DNA rantai ganda akan terdenaturasi menjaid rantai tunggal. Selanjutnya, suhu diturunkan sehingga primer dapat menghibridisasi DNA template. Karena hanya terdapat satu primer pada teknik ini, maka hanya salah satu rantai DNA saja yang diikat oleh primer. Pada tahap ketiga, Taq polymerase akan mengadisi dNTP ke ujung primer yang komplemen dengan DNA template, mensintesis sebuah untaian DNA komplemen yang baru. Pada tahap ini, polymerase sesekali menambahkan ddNTP. ddNTP tidak memiliki gugus hidroksil pada posisi karbon 2 dan 3. Ketika nukleotida ini telah disisipkan pada ujung rantai, tidak adanya gugus hidroksil membuat polimerase tidak bisa menambahkan nukleotida lainnya sehingga pembentukan rantai terhenti. Karena konsentrasi ddNTP yang jauh lebih rendah dibandingkan dNTP, frekuensi penyisipiannya menjadi tidak menentu dan acak.

Setelah reaksi pemanjangan rantai selesai, suhu kembali naik untuk mendenaturasi molekul DNA yang baru. Siklus hibridisasi, sintesis, dan denaturasi akan berulang terus-menerus dan akan membentuk untaian DNA yang mengandung ddNTP dengan jumlah yang banyak. Ketika semua siklus telah selesai, produk kemudian dipisahkan berdasarkan jumlah pasang basa nya dengan metode elektroforesis pada sebuah gel kapiler.

Gel elektroforesis dengan resolusi tinggi dapat memisahkan fragmen DNA bahkan yang panjangnya hanya satu nukleotida. Rantai nukleotida terpendek akan bermigrasi paling jauh dibandingkan yang panjang. Karena ddNTP sudah diberikan pewarnaan fluorescent, maka warna dari untaian tersebut (dilihat menggunakan sinar UV) akan muncul dan memberikan identitas dari nukleotida pada setiap molekul DNA. Susunan warna yang mucul koresponden dengan susunan basa dari DNA template.

4. Pemisahan Asam Nukleat dengan UltracentrifugationStabilitas suatu larutan dipengaruhi oleh komponen di dalamnya. Banyak faktor yang dapat menentukan apakah komponen pada suatu medium dapat mengendap atau tidak, seperti ukurannya, densitas, dan densitas serta viskositas mediumnya. Apabila komponen yang terdapat pada medium cair memiliki densitas yang lebih besar dibandingkan mediumnya, maka gaya sentrifugal akan menyebabkan komponen tersebut terkonsentrasi atau mengendap di bagian bawah tabung centrifuge. Semakin besar ukuran partikelnya, maka akan semakin cepat mengendap dibandingkan dengan partikel yang lebih kecil dengan densitas yang sama. Kecenderungan molekul

Gbr 6. (a) Proses DNA sequencing. (b) fragmen DNA yang telah terpisahkan melalui proses elektroforesis. (c) interpretasi urutan nukleotida yang terekam pada komputer.

terkonsentrasi disebabkan oleh efek difusi. Dengan menggunakan prinsip ini, suatu molekul DNA (dan RNA) dapat dianalisis. Terdapat dua teknik sentrifugasi yang dapat digunakan untuk mempelajari suatu asam nukleat (DNA atau RNA).

Velocity SedimentationKecepatan suatu molekul untuk bergerak sebagai respon akibat dari gaya sentrifugal

disebut sebagai laju sedimentasi. Karena laju sedimentasi akan berubah seiring berubahnya gaya sentrifugal, suatu molekul akan terkarakterisasi berdasarkan koefisien sedimentasinya. Koefisien sedimentasi adalah laju sedimentasi dibagi dengan gaya.

Karena laju dari sebuah partikel bergantung pada ukurannya, maka massa molekul tidak menjadi penentu koefisien sedimentasi, namun hanya ukurannya saja. Pada velocity sedimentation, molekul asam nukleat dipisahkan berdasarkan panjang nukleotidanya. Sebagai contoh, suatu sampel asam nukleat dicampur dengan medium berupa sukrosa pada sebuah tabung sentrifugasi. Sebelum diberikan gaya sentrifugal pada tabung, dapat dilihat adanya gradien konsentrasi sukrosa, dimana pada bagian paling bawah tabung konsentrasi sukrosa lebih tinggi dibandingkan bagian atas. Kemudian, diberikan gaya sentrifugal pada tabung, sehingga terjadi pemisahan molekul asam nukleat (DNA) pada medium sukrosa tersebut yang mana laju sedimentasinya dipengaruhi oleh koefisien sedimentasi. Semakin besar koefisien sedimentasi, semakin jauh molekul bergerak. Karena densitas medium lebih kecil dibandingkan densitas asam nukleat, maka sedimentasi akan terus berlangsung selama proses sentrifugasi. Tahap proses sentrifugasi dan hasilnya dapat dilihat pada gambar di bawah ini

Gbr 7 . Proses velocity sedimentation

Setelah beberapa saat, tabung dikeluarkan dari alat pemutar dan konmponen pada campuran akan terfraksinasi (Gbr 8.) sehingga posisi relatif dari masing-masing molekul dapat ditentukan.

Gbr 8. Absorbansi suatu molekul hasil sentrifugasi

Equilibrium Centrifugation

Terdapat tipe lainnya dari teknik sentrifugasi, yaitu equilibrium centrifugation. Pada teknik ini, molekul asam nukleat dipisahkan berdasarkan densitas apungnya. Pada teknik ini dibutuhkan suatu medium berupa logam berat, seperti cesium klorida, dan sampel DNA.

Analisis dimulai dengan mencampurkan sampel DNA dengan medium cair cesium klorida pada tabung sentrifugasi. Kemudian dilakukan sentrifugasi selama waktu tertentu (2 hingga 3 hari dengan gaya sentrifugal yang besar). Selama proses sentrifugasi, ion cesium yang berat akan menuju ke dasar tabung secara perlahan sehingga terbentuk gradien densitas pada kolom cairan. Setelah beberapa waktu, kecenderungan cesium untuk terkonsentrasi di dasar tabung adalah akibat melawan kecenderungan terdistribusi akibat difusi, dan gradien menjadi stabil. Selama gradien cesium terbentuk, molekul DNA akan turun ke dasar tabung atau mengapung ke atas hingga mencapai posisi densitas apung yang ekuivalen terhadap molekul DNA tersebut (lihat Gbr 9.). Teknik ini cukup sensitif untuk memisahkan molekul DNA berdasarkan komposisi pasangan basanya.

Gbr 9. Proses equilibrium centrifugation

5. BlottingBlotting merupakan proses pemindahan fragmen asam nukleat (DNA atau RNA) ke

lapisan membran yang tipis sehingga asam nukleat dapat dipisahkan dan lebih mudah diamati. Teknik ini adalah teknik lanjutan dari elektroforesis gel.Terdapat 3 metode blotting, yaitu southern blotting, northern blotting, western blotting. Namun, metode western blotting digunakan untuk analisis protein.

5.1. Southern BlottingSouthern blotting adalah suatu teknik yang banyak digunakan pada bidang

biologi molekular. Teknik ini ditemukan oleh E. M. Southern pada tahun 1975. Hasil dari Southern blotting merupakan fragmen dna yang berasal dai gel elektroforesis yang telah terestriksi yang melekat pada membran berupa nitroselulosa atau nylon sheet. DNA yang telah melekat pada membran tersebut akan bersifat immobilized sehingga dapat digunakan sebagai substrat untuk analisis hibridisasi dengan probe DNA atau RNA yang telah diberikan label. Oleh karena itu, Southern blotting merupakan metode yang digunakan untuk deteksi fragmen restriksi yang spesifik terhadap latar belakang fragmen restriksi lainnya. DNA terestriksi dapat berupa plasmid atau bacteriophage clone.

5.1.1. Tahap Southern Blotting

Gbr 9. Tahap dari Southern Blotting

Langkah yang dilakukan untuk melakukan Southern blotting diilustrasikan pada Gbr 9. Sebuah agarose gel dari elektroforesis yang mengandung fragmen DNA terestriksi diletakkan pada sebuah kertas saring sumbu yang menghubungkan gel tersebut dengan sebuah larutan alkali. Membran ntroselulosa atau membran nylon diletakkan di atas agarose gel tersebut dan dilapisi oleh tumpukan paper towels dengan tambahan bebas di atasnya. Karena adanya tekanan dari beban tersebut, larutan penyangga (alkali) akan terserap melewati kertas saring dan menuju membran dan paper towel karena adanya peristiwa kapilaritas. Ketika larutan penyangga melewati gel, fragmen DNA akan ikut terbawa menuju membran dan akan tercetak pada membran tersebut.

Apabila membran telah mengandung fragmen-fragmen DNA, membran akan ditempatkan pada sebuah wadah yang mengandung probe DNA radioaktif yang dapat mendeteksi urutan DNA. Probe akan membentuk ikatan dengan DNA komplementer untuk mengetahui susunan rantai DNA tersebut. Proses ini dinamakan sebagai hibridisasi.

Setelah proses hibridisasi selesai, membran akan dibersihkan untuk menghilangakn probe yang tidak membentuk ikatan. Kemudian, membran akan dilapisi dengan membran sinar x sehingga akan muncul rekaman berupa pita hitam yang disebut autoradiogram. Dengan membaca mengidentifikasi aoutoradiogram ini, urutan pasang basa pada DNA dapat diketahui.

5.2. Northern Blotting

Teknik Northern blotting dikembangkan pada tahun 1977 oleh James Alwine, David Kemp, and George Stark. Prinsip dan metode yang digunakan pada teknik Northern blotitng mirip dengan yang digunakan pada Southern blotting, hanya saja metode ini digunakan untuk mendeteksi rantai RNA. Pada Southern blotting, larutan yang digunakan adalah garam alkali, namun pada Northern blotting digunakan formaldehid.