Siti Hudaiyah4 TPHP 37675

PEWARNAAN GRAM

A. Pengertian dan SejarahCristian Gram seorang ahli bakteriologi Denmark secara kebutulan menemukan suatu pewarnaan bertingkat, yang dinamakan pewarnaan Gram. Pewarnaan ini merupakan salah satu prosedur yang penting dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan Gram juga merupakan tahap penting dalam identifikasi bakteri, termasuk pewarnaan diferensial. Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negative. Bakteri Gram positif berwarna ungu yang disebabkan kompleks warna Kristal violet-iodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat. Sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah karena kompleks warna tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian mengambil zat warna kedua yang berwarna merah. Perbedaan hasil warna tersebut disebabkan perbedaan struktur, terutama dinding sel kedua kelompok bakteri tersbut.karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dengan kelompok lainnya.Reagen yang digunakan dalam pewarnaan Gram :1. Zat warna utama ( violet kristal )2. Mordan ( larutan iodine ) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengitensifkan warna utama3. Pencuci/peluntur zat warna ( alcohol/aseton ) yaitu organic solvent yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama4. Zat warna kedua/cat penutup ( safranin ) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol.Penyebab perbedaan pewarnaan Gram dimungkinkan karena komposisi dinding sel bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif. Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri Gram positif menyusut oleh perlakuan alcohol karena terjadi dehidrasi, menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutannya kompleks zat warna ungu Kristal-iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan bakteri Gram negatif memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding sel dan lipid tersebut dapat larut dalam alcohol dan aseton. Larutnya lipid oleh zat pemucat yang digunakan dalam pewarnaan Gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah penyebab proses pemucatan antara dinding sel Gram negative lebih cepat.Dinding sel bakteri merupakan factor penting penghalang proses pemucatan pada bakteri Gram positif. Hal ini didukung oleh kenyataan bahwa berubahnya atau dibuangnya dinding sel bakteri Gram positif menyebabkan mikroba tersebut berubah menjadi Gram negatif.Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram posotif dan bakteri Gram negatif :1. Ciri-ciri bakteri Gram negatif :a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-15 mm, berlapis tiga atau multilayerb. Bentuk sel bulat, oval, batang lurus atau melingkar seperti tanda koma, heliks atau filament, beberapa mempunyai selubung atau kapsulc. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-12%), peptidoglikan terdapat didalamd. Lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah kurang lebih 10% dari berat kering, tidakmengandung asam tekoate. Kurang rentan terhadap senyawa penisilinf. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya violetg. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relative sederhanah. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekati. Peka terhadap streptomisinj. Toksin yang dibentuk EndoktoksinContoh : Escherichia Coli, Salmonella, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Bakteri asam asetat, Cynobacteria, Spirochaeta2. Ciri-ciri bakteri Gram positif :a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 mm, berlapis tunggal atau monolayerb. Bentuk sel bulat, batang atau filamenc. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebgai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoatd. Bersifat lebih rentan terhadap penisiline. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna ungu Kristalf. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumitg. Lebih resisten terhadap gangguan fisikh. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) laruti. Tidak peka terhadap streptomisisnj. Toksin yang dibentuk Eksotoksin EndoktoksinContoh : Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Nocardia, Clostridium, Acinobacteria, ListeriaBeberapa faktor yang mempengaruhi laju lepasnya kompleks warna ungu-kristal-iodium pada pemucatan :1. Pelaksanaan Fiksasi panas terhadap olesanOlesan bakteri yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan pecahnya dinding sel bakteri. Dalam keadaan demikian, maka sel bakteri Gram positif akan melepaskan warna primer dan menerima warna tandingannya. Hal ini mendukung pendapat bahwa reaksi Gram bergantung pada struktur dinding sel.

2. Kerapatan sel pada olesanOlesan yang baik hendaknya tidak terlalu tebal atau terlalu tipis.pada pewarnaan Gram, olesan terlampau tebal tidak akan memucat secepat seperti olesan dengan kerapatan sel yang normal.3. Jenis dan konsentrasi reagen yang digunakan dalam pewarnaanLarutan etanol 95% bekerja paling lambat sebagai larutan pemucat, sedangkan aseton paling cepat. Larutan pemucat paling banyak digunakan adalah campuran larutan etanol 95% dan aseton ( 1:1 ). Namun untuk pemula sebaiknya menggunakan larutan etanol 95% untuk memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan.4. Jenis medium pertumbuhanBakteri gram positif bila terlalu lama ditumbuhkan dalam medium yang mengandung bahan yang mudah terfermentasi dapat berubah menjadi Gram negatif. Demikian pula bila bakteri Gram negatif bila ditambah perlakuan khusus, misalnya ditambah larutan pekat dan dapat berubah menjadi Gram positif.5. Umur biakanPewarnaan Gram memberikan hasil baik bila menggunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila menggunakan biakan tua, maka kemungkinan besar terjadi penyimpangan hasil pewarnaan Gram. Pada biakan tua banyak sel yang mengalami kerusakan pada dinding selnya. Kerusakan dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Hal ini berarti bakteri Gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak dapat lagi mempertahankan kompleks warna Kristal violet-iodium sehingga terlihat sebagai bakteri Gram negatif. Tetapi untuk Gram negatif tidak akan berubah menjadi bakteri Gram positif terlepas umur atau medium yang digunakan.

Tabel 1. Pewarnaan GramZat warnaGram positifGram negatif

Kristal VioletUnguUngu

Larutan lugol/mordanUnguUngu

Larutan pemucatUnguTidak berwarna

SafraninUnguMerah

B. Metodologi1. Bahan dan Alat :a. Kaca obyek bersihb. Spidolc. Jarum osed. Biakan muda (kurang dari 24 jam), Escherhia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan Streptococcus sppe. Zat warna ungu Kristal (modifikasi Hucker), larutan iodium, larutan etanol 95%, dan safraninf. Air suling dalam botol pijitg. Kertas hisap, kertas lensah. Mikroskop2. Cara Kerja :a. Buat preparat ulas dari keempat mikroba tersebut kemudian dipanaskan diatas apib. Beri larutan Kristal ungu selama 1 menitc. Miringkan kaca obyek diatas pewarna untuk membuang kelebihan Kristal ungu lalu bilas dengan air sulingd. Tiriskan kaca obyek dengan menegakkan sisi-sisi yang sempit pada kaca obyek diatas kertas serap, dan kembalikan keatas rak kawat pada bak pewarnaane. Beri larutan iodium selama 2 menitf. Miringkan kaca obyek untuk membuang kelebihan iodium lalu bilas dengan air sulingg. Cuci dengan etano 95%, tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna ungu Kristal tidak terlihat lagi mengalir dari kaca obyekh. Cuci dengan air, lalu tiriskan dan kembalikan keatas rak kawat pada bak pewarnaani. Beri safranin selama 30 detikj. Miringkan kaca obyek dan serap kelebihan air pada olesan dengan menekankan kertas serap hati-hati keatasnyak. Amati dibawah mikroskop dengan lensa obyektif mulai berkekuatan rendahl. Gambar mikroba tersebut Contoh hasil pewarnaan Gram pada bakteri dapat dilihat pada gambar 1 berikut.Bakteri Gram NegatifBakteri Gram PositifGambar 1. Contoh Hasil Pewarnaan Gram pada Bakteri

PENGUJIAN MIKROBIOLOGI METODE MPN DAN TPC

A. Metode MPN1. PengertianMPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel. Terdiri dari uji presumtif (penduga) dan uji konfirmasi (peneguhan).Contoh :Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000.Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g2. Prinsip PengujianPrinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :a. bakteri terdistribusi sempurna dalam sampelb. sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).c. media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut.d. jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi. MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (GrowthUnit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi 1/100> 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceran mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna.Selain persiapan pendahuluan pada peralatan, dalam analisa mikrobiologi juga diperukan persiapan pendahuluan untuk sampel yang akan dianalisa dengan cara sebagai berikut:a. Persiapan ContohDisiapkan alat untuk persiapan contoh yang sudah steril, atau dapat disterilkan menggunakan bunsen burner setelah lebih dulu dibersihkan dengan alkohol 70%. Metode persiapan contoh sebagai berikut:1) Contoh dengan kemasan kertas atau plastikPada bagian yang akan dibuka, bersihkan dengan alkohol 70% kemudian dibuka secara aseptik.2) Contoh dalam kemasan botolSumbat atau tutup botol dibersihkan dengan alkohol 70% lalu dipanaskan di api bunsen sebentar. Sumbat dibuka secara aseptik.3) Wadah KalengPermukaan kaleng dicuci bersih dan terakhir dibersihkan dengan alkohol 70%. Bagian ini dilewatkan api, lalu buka secara aseptik.b. Homogenisasi Contoh1) Contoh bentuk kental (misal saus, kecap, pasta)Dipipet sejumlah 5 mL atau ditimbang sejumlah 5 gram sample ke dalam Erlenmeyer yang telah berisi 45 mL larutan BPDW hingga diperoleh pengenceran 10-1. Kocok dengan baik sampai homogen lalu dilanjutkan dengan pengenceran yang diperlukan.2) Contoh bentuk padatHaluskan dengan blender atau tumbuk secara aseptis sejumlah sample padat (dengan perkiraan bobot > 5gram). Timbang 5 gram sample ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 45 mL larutan BPDW hingga diperoleh pengenceran 10-1. Kocok dengan baik sampai homogen lalu dilanjutkan dengan pengenceran yang diperlukan.3) Contoh untuk pengujian khususTimbang dalam kantong plastik HDPE steril sejumlah 50 gram sample, haluskan. Tuang 450 mL BPDW steril sedikit demi sedikit hingga diperoleh pengenceran 10-1. Kocok dengan baik sampai homogen lalu dilanjutkan dengan pengenceran yang diperlukan. Suspensi ini dapat pula untuk analisa TPC, Kapang, juga Khamir.Metode MPN dalam uji mikrobiologi digambarkan sebagai berikut.

B. Metode TPC1. PengertianTPC (Total Plate Count) adalah metode penghitungan mikroba dengan acar menghitung jumlah koloni yang terdapat pada Petri dish secara langsung. Menurut Hadioetomo (1993), jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung dalam sampel. Terdapat dua metode penghitungan bakteri yaitu metode hitungan mikroskopis langsung (direct microscopis count) dan metode hitungan tak langsung (indirect count) dengan hitungan cawan, baik dengan metode penyebaran maupun metode penuangan. Berikut adalah penjelasan singkat metode-metode beserta ukuran sampel yang disarankan dalam pengujian mikrobiologi metode TPC.Spread plate: teknik penanaman ini didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan agar. Volume sampel yang ditanamkan umumnya 0,1 ml pada cawan dengan diameter +/-9 cm.Pour Plate : teknik pour plate adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar. Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat tumbuh di dalam agar (bersifat mikroaerofilik). Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml. Sebaiknya sampel yang dipakai untuk teknik ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran 30-300 koloni/cawan.Membrane filtration : Prinsip teknik ini adalah dengan melewatkan sejumlah volume sampel pada saringan dengan diameter pori lebih kecil dari pada sel mikroba. Hal inilah yang menjadi keterbatasan teknik filtrasi membran, dan dapat berpengaruh kepada jenis sampel dan ukuran sampel yang akan dianalisa.

2. PrinsipPrinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu: metode tuang (pour plate) dan metode permukaan/sebar (surface/spread plate) (Fardiaz, 1993). Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk dihitung mengandung 30-300 koloni.Untuk memenuhi persyaratan tersebut dilakukan sederatan pengenceran dan pencawan.Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang digunakan untuk menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu = colony forming units)(Waluyo 2008).CFUs adalah singkatan dari Coloni Forming Units yang artinya unit-unit / satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi ada jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan masih menempel pada induknya, seperti halnya yang terjadi pada streptococcus, diplococcus, sarcina dll. sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel.

3. Cara Kerja AnalisaSelain persiapan pendahuluan pada peralatan, dalam analisa mikrobiologi juga diperukan persiapan pendahuluan untuk sampel yang akan dianalisa dengan cara sebagai berikut:a. Persiapan ContohDisiapkan alat untuk persiapan contoh yang sudah steril, atau dapat disterilkan menggunakan bunsen burner setelah lebih dulu dibersihkan dengan alkohol 70%. Metode persiapan contoh sebagai berikut:1) Contoh dengan kemasan kertas atau plastikPada bagian yang akan dibuka, bersihkan dengan alkohol 70% kemudian dibuka secara aseptik.2) Contoh dalam kemasan botolSumbat atau tutup botol dibersihkan dengan alkohol 70% lalu dipanaskan di api bunsen sebentar. Sumbat dibuka secara aseptik.3) Wadah KalengPermukaan kaleng dicuci bersih dan terakhir dibersihkan dengan alkohol 70%. Bagian ini dilewatkan api, lalu buka secara aseptik.

b. Homogenisasi Contoh1) Contoh bentuk kental (misal saus, kecap, pasta)Dipipet sejumlah 5 mL atau ditimbang sejumlah 5 gram sample ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 45 mL larutan BPDW hingga diperoleh pengenceran 10-1. Kocok dengan baik sampai homogen lalu dilanjutkan dengan pengenceran yang diperlukan.2) Contoh bentuk padatHaluskan dengan blender atau tumbuk secara aseptis sejumlah sample padat (dengan perkiraan bobot > 5gram). Timbang 5 gram sample ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 45 mL larutan BPDW hingga diperoleh pengenceran 10-1. Kocok dengan baik sampai homogen lalu dilanjutkan dengan pengenceran yang diperlukan.3) Contoh untuk pengujian khususTimbang dalam kantong plastik HDPE steril sejumlah 50 gram sample, haluskan.Tuang 450 mL BPDW steril sedikit demi sedikit hingga diperoleh pengenceran 10-1. Kocok dengan baik sampai homogen lalu dilanjutkan dengan pengenceran yang diperlukan. Suspensi ini dapat pula untuk analisa TPC, Kapang, juga Khamir.Langkah yang dilakukuan untuk pengujian ini adalah sebagai berikut:a. Masukkan sebanyak 1 mL suspensi dari setiap pengenceran ke dalam cawan petri secara duplo.b. Tambahkan 15 20 mL PCA steril yang sudah didinginkan hingga suhu 45 1oC pada masing masing cawan yang sudah berisi suspensi. Supaya larutan dan media tercampur seluruhnya, lakukan pemutaran cawan ke depan dan ke belakang atau membentuk angka delapan dan diamkan sampai menjadi padat.c. Inkubasikan pada temperatur 34 36oC selama 24 48 jam dengan meletakkan cawan pada posisi terbalik.Setelah diinkubasi, dilakukan perhitugan koloni pada setiap Petri. Cara untukmenghitung koloni (interprestasi hasil) adalah:a. Hitung koloni pada setiap seri pengenceran kecuali cawan petri yang berisi koloni menyebar (Spreader Colonies). Pilih cawan yang mempunyai jumlah koloni 25 250. Hitung rata rata jumlah koloni dan kalikan dengan faktor pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri per mililiter atau gram.b. Jika salah satu dari dua cawan petri terdapat jumlah koloni lebih kecil dari 25 atau lebih besar 250, hitung rata rata jumlah koloni kalikan dengan faktor pengenceran, dan nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri per milililiter atau gram.c. Jika hasil dari dua pengenceran jumlahnya berturut turut terletak antara 25 250 koloni, hitung jumlah koloni dari masing masing pengenceran, dan hitung rata rata jumlah koloni dari kedua pengenceran tersebut. Jika jumlah yang tertinggi lebih besar dari dua kali jumlah yang terkecil, nyatakan jumlah yang kecil sebagai jumlah bakteri per mililiter atau gram.d. Jika rata rata jumlah koloni masing masing cawan petri tidak terletak antara 25 dan 250 koloni, hitung jumlah koloni seperti pada poin (1) dan (2), dan nyatakan sebagai jumlah bakteri per mililiter atau gram.e. Jika jumlah koloni dari semua pengenceran lebih dari 250 koloni, maka setiap dua cawan petri dengan pengenceran tertinggi dibagi ke dalam 2, 4, atau 8 sektor. Hitung jumlah koloni dalam satu bagian atau lebih. Untuk mendapatkan jumlah koloni dalam satu petri, hitung rata rata jumlah koloni, dan kalikan dengan faktor pembagi dan pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri perkiraan per mililiter atau gram.f. Jika dalam 1/8 bagian cawan petri terdapat lebih dari 200 koloni, maka jumlah koloni yang didapat = 8 x 200 (1600), dikalikan dengan faktor pengenceran dan nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri perkiraan per mililiter atau gram lebih besar dari jumlah yang didapat (lebih besar dari 1600 X faktor pengenceran).g. Jika tidak ada koloni yang tumbuh dalam cawan petri, nyatakan jumlah bakteri perkiraan lebih kecil dari 1 dikalikan degan pengenceran yang terendah (