BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Maksud Percobaan

a) Mengetahui prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam.

b) Melakukan uji bioassay dengan menggunakan metode Brine

Shrimp Lethality Test (BST).

I.2 Tujuan Percobaan

a) Untuk mengetahui prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam.

b) Untuk melakukan uji bioassay dengan menggunakan metode Brine

Shrimp Lethality Test (BST).

I.3 Prinsip Percobaan

Pengujian toksisitas dalam penelusuran senyawa bioaktif yang

toksik dari bahan alam dengan hewan uji Brine Shrimp (udang laut)

dimana berdasarkan LD50 dan LC50 yaitu dosis dan konsentrasi yang dapat

mematikan hewan uji sebanyak 50%.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Teori Umum

Brine Shrimp Lethality Test (BST) merupakan salah satu metode uji

toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif

yang toksik dari bahan alam. Metode ini menunjukkan aktifitas

farmakologis yang luas, tidak spesifik dan dimanifestasikan sebagai

toksisitas senyawa terhadap larva udang Arternia salina Leach. (1)

Metode ini dapat dilakukan dengan cepat, murah, mudah dan

cukup reproducible sehingga dapat digunakan sebagai Bioassay Guided

Isolation yaitu isolasi komponen kimia berdasarkan aktifitas yang

ditunjukkan oleh bioassay tersebut. Dengan mengetahui aktifitas dari

suatu kelompok komponen kimia (fraksi), dapat dilakukan isolasi senyawa

sehingga diperoleh senyawa tunggal aktif. (1)

Toksisitas ilah efek berbahaya dari satu bahan obat pada organ

target. Uji toksisitas dilakukan untuk mengetahui tingkat keamanan dan

keberbahayaan zat yang akan diuji. Adapun sumber zat toksik dapat

berasal dari bahan alam maupun sintetik. (1)

Toksisitas diukur dengan mengamati kematian hewan percobaan.

Kematian dari hewan percobaan di anggap sebagai respon dari pengaruh

senyawa yang diuji, sehingga hubungan dari respon dengan

menggunakan kematian sebagai jawaban toksis adalah titik awal untuk

mempelajari toksisitas. (1)

Angka kematian dari hewan percobaan dihitung sebagai Median

Letal Dose (LD 50) atau Median Concentration (LC 50). Penggunaan LC

50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap

hewan coba secara inhalasi atau dengan media air. (1)

Median Letal Dose (LD 50) adalah dosis dari sampel yang diuji

yang mematikan 50% dari hewan uji sedangkan Median Letal

Concentration (LC 50) adalah konsentrasi sampel yang diuji yang dapat

mematikan 50% dari hewan uji. (1)

Senyawa bioakti sering toksis terhadap larva Arternia salina Leach.

Oleh karena itu, uji letal secara “in vitro” terhadap larva udang Arternia

salina Leach dapat digunakan sebagai monitor yang bekerja dengan cepat

dan sederhana untuk senyawa bioaktif selama isolasi dari bahan alam.

Telur larva udang Arternia salina Leach ketika ditempatkan pada air laut,

telur akan menetas setelah 48 jam, menghasilkan larva dalam jumlah

banyak. (2)

Pada percobaan BST, digunakan hewan uji yaitu Larva udang. Hal

ini disebabkan karena larva udang sebelumnya telah digunakan dalam

bermacam-macam uji hayati seperti uji pestisida, mikotoksin,

kekarsinogenikan dan toksikan dalam air laut. Uji dengan organisme ini

sesuai untuk aktifitas farmakologi dalam ekstrak tanaman yang bersifat

toksik. Penelitian menggunakan larva udang memiliki beberapa

keuntungan antara lain cepat, mudah, murah dan sederhana. Penelitian

dengan larva udang telah digunakan oleh Pusat Kanker Purdue

Universitas Purdue di Lafavette untuk senyawa akti tanaman secara

umum dan tidak spesifik untuk zat antikanker. Namun demikian,

hubungan yang signifikan dari sampel yang bersifat toksik terhadap larva.

Larva udang juga mempunyai aktifitas sitotoksik. Berdasarkan hal tersebut

maka larva udang dapat digunakan untuk uji toksisitas. (2)

Hubungan kanker dengan BST adalah, metode Brine Shrimp Test

(BST) dengan menggunakan larva udang sebagai hewan uji merupakan

salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa

antikanker baru yang berasaldari tanaman. Hasil uji toksisitas dengan

metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksis senyawa

antikanker. Selain itu metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat dan

cukup akurat. Lebih dari itu larva udang ini juga digunakan untuk

praskrining terhadap senyawa-senyawa yang diduga brkhasiat sebagai

antitumor. Dengan kata lain, uji ini mempunyai korelasi yang positif

dengan potensinya sebagai antikanker. (2)

Suatu senyawa bahan alam dapat dikatakan memiliki aktivitas

sebagai antikanker jika nilai LC50nya kurang dari 1000 ppm atau sekitar

10-100 ppm.

BAB III

METODE KERJA

III.1 Alat Percobaan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan adalah mikropipet,

lampu pijar, wadah penetas, aerator, pipet tetes.

III.2 Bahan Percobaan

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan adalah ekstrak

daun kemangi (Occinum sanctum), kloroform, methanol, larva Arternia

salina Leach, suspense ragi, air suling, air laut.

III.3 Cara Kerja

A. Penetasan Larva

1. Ambil telur udang secukupnya dan direndam dalam air suling

selama 10 menit.

2. Pisahkan telur udang yang terapung dan yang tenggelam. Telur

udang yang terapung dibuang karena tidak berisi, sedangkan

yang tenggelam digunakan untuk penetasan.

3. Telur tersebut dimasukkan dalam wadah plastic berbentuk

kerucut, lalu ditambahkan air laut.

4. Masukkan aerator ke dalam wadah penetas dan berikan cahaya

lampu pijar.

5. Setelah 48 jam larva siap digunakan untuk pengujian.

B. Pembuatan Konsentrasi Uji

1. Larutkan ekstrak dalam pelarut kloroform : methanol (1 : 1) atau

pelarut yang sesuai.

2. Buat seri kadar dengan konsentrasi 10 ppm, 100 ppm, dan 1000

ppm, uapkan pelarutnya hingga kering dan tidak berbau pelarut

lagi kemudian ditambahkan air laut sebanyak 2 ml,

3. Selanjutnya diuji pada larva udang.

4. Sebagai control negative digunakan pelarut yang digunakan

pada pengenceran ekstrak.

C. Pelaksanaan Uji

1. Masukkan larva yang telah menetas dan telah diadaptasikan ke

dalam masing-masing vial sebanyak 10 ekor.

2. Cukupkan volume tiap vial sampai 5 ml (batas tanda) dengan air

laut.

3. Buat makanan larva yaitu suspense ragi dengan cara

menimbang 3 mg ragi (fermipan) dan dilarutkan dalam 5 ml air

laut.

4. Masukkan 1 tetes makanan (suspense ragi) ke dalam tiap-tiap

vial.

5. Biarkan selama 24 jam kemudian hitung jumlah larva yang mati.

6. Hitung presentase jumlah larva yang mati dan tentukan LC 50

dengan analisis probit.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN

IV.1 Data Pengamatan

KelompokPerlakuan

KonsentrasiEkstrak (mg/ml)

Jumlah awal larva

udang

Jumlah mati tiap replikasi Rata-rata KematianR1 R2 R3 R4 R5

I 10.000 10 10 9 7 8 8 8,4

II 5000 10 5 6 4 7 3 5

III 2400 10 4 3 2 2 3 2,8

IV 1200 10 1 2 1 0 1 1

V 600 10 0 1 0 1 0 1,4

K (-) 0 0 0 0 0 0 0 0

Log Konsentrasi % Kematian Probit

4 84 5,99

3,69 50 5

3,38 28 4,42

3,08 10 3,72

2,77 14 3,92

- - -

% Kematian = x 100

IV.2 Perhitungan

a = -1,366

b = 1,766

r = 0,935

Nilai LC50 yaitu Y = 5

Y = a + bx

5 = -1,366 + 1,766(x)

5 + 1,366 = 1,766x

6,366 = 1,766x

X = 3,605

Sehingga nilai LC50 = antilog 3,605

= 4027,17 µg/ml

BAB V

PEMBAHASAN

Uji BST digunakan sebagai uji permulaan untuk mengetahui

aktivitas dari suatuzat atau senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak

atau suatu isolat murni. Pada uji BSLT digunakan larva udang Artemia

salina yang telah berumur 48 jam.Pada saat penetasan setelah 24 jam

larva udang yang telah menetas di pindahkanketempat lain hal ini

bertujuan agar umur dari larva udang yang digunakan sama.Ditakutkan

bila tidak dipindahkan ada larva udang yang baru menetas setelah 24 jam.

Dan terbawa dalam percobaan sehingga usia dari larva udang tidak

seragam. Pada pengujian BSLT dibuat larutan dengan konsentrsi yang

berbeda-beda mulau dari 1000,100,dan 10μg/ml. Ini bertujuan untuk

melihat pengaruh konsentrasi dari ektrak terhadap aktivitasnya(LC50).

Dari hasil data pengamatan diatas, berdasarkan regresi yang

telah dilakukan didapatkan nilai LC50nya yaitu 4027,17 µg/ml. Hal ini

menunjukkan bahwa ekstrak dari tanaman ini memiliki > 1000 µg/ml, jadi

tidak memenuhi syarat sebagai anti kanker dimana batas konsentrasi

suatu ekstrak dapat dikatakan sebagai antikanker apabila ≤ 10 µg/ml.

BAB VI

PENUTUP

VI.1 Kesimpulan’

Dari pengamatan di atas, dapat disimpulkan:

LC50 = 4027,17 µg/ml

Tidak memenuhi syarat sebagai antikanker yang baik karena >10

µg/ml.

VI. Saran

Alat-alat dan bahan di laboratorium harap dilengkapi lagi guna

memperlancar praktikum.

Skema Kerja

Telur udang

Air Suling (10 menit)

Tampung Tenggelam

Plastik Kerucut

(air laut + aerator + lampu pijar) 48 jam

Uji larva 10 ekor + ekstrak

Vial

Air laut (5 ml)

+suspense ragi (1 tetes)

Diamkan (24 jam)

Larva mati (hitung)

Ekstrak

Kloroform = MeOH

K = 1

1000 ppm

100 ppm

10 ppm

kontrolnegatif

Uapkan Air laut (2 ml)

Uji

Tabel Probit

PROSENTASEPROBIT

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0

10

20

-

3,72

4,17

2,67

3,77

4,19

2,95

3,82

4,23

3,12

3,87

4,26

3,25

3,92

4,29

3,36

3,95

4,33

3,45

4,01

4,36

3,52

4,05

4,39

3,59

4,08

4,42

3,66

4,12

4,45

30

40

50

60

70

80

90

4,48

4,75

5,00

5,25

5,52

5,84

6,28

4,50

4,77

5,03

5,28

5,55

5,88

6,34

4,53

4,80

5,05

5,31

5,58

5,92

6,41

4,56

4,82

5,08

5,33

5,61

5,95

6,48

4,59

4,85

5,10

5,36

5,64

5,99

6,55

4,61

4,87

5,13

5,39

5,67

6,04

6,64

4,64

4,90

5,15

5,41

5,71

6,08

6,75

4,67

4,92

5,18

5,44

5,74

6,13

6,88

4,69

4,95

5,20

5,47

5,77

6,18

7,05

4,72

4,97

5,23

5,50

5,81

6,23

7,33

990,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,66 7,75 7,88 8,09