Enzim Kelompok 6

48
BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis. Adanya enzim membuat reaksi kimia terjadi menjadi lebih cepat dari normalya. Enzim dapat meningkatkan laju terjadinya reaksi dengan cara menurunkan energi aktivasi. Enzim di dalam tubuh manusia terdapat bermacam- macam yang membantu kerja sel dan organ di dalam tubuh. Contoh yang mudah adalah enzim amylase yang terdapat di dalam mulut. Enzim amylase merubah amilum menjadi glukosa. Nasi yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat mengandung banyak amilum yang tidak dapat langsung diolah oleh tubuh. Adanya enzim ini dapat merubah karbohidrat kompleks menjadi struktrur karbohidrat yang lebih sederhana yaitu glukosa. Akhir-akhir ini juga banyak sekali penelitian tentang enzim yang melibatkan beberapa sektor, mulai dari sektor industry, pertanian, dan lain-lain. Penelitian ini membuat adanya temuan baru tentang enzim yang dapat diisolasi melalui bakteri karena dengan adanya enzim reaksi kimia yang kompleks dan rumit dapat diamati. Percobaan ini akan mempelajari tentang isolasi dan produksi enzim. 1.2 Rumusan Masalah

description

enzim

Transcript of Enzim Kelompok 6

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangEnzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis. Adanya enzim membuat reaksi kimia terjadi menjadi lebih cepat dari normalya. Enzim dapat meningkatkan laju terjadinya reaksi dengan cara menurunkan energi aktivasi. Enzim di dalam tubuh manusia terdapat bermacam-macam yang membantu kerja sel dan organ di dalam tubuh. Contoh yang mudah adalah enzim amylase yang terdapat di dalam mulut. Enzim amylase merubah amilum menjadi glukosa. Nasi yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat mengandung banyak amilum yang tidak dapat langsung diolah oleh tubuh. Adanya enzim ini dapat merubah karbohidrat kompleks menjadi struktrur karbohidrat yang lebih sederhana yaitu glukosa. Akhir-akhir ini juga banyak sekali penelitian tentang enzim yang melibatkan beberapa sektor, mulai dari sektor industry, pertanian, dan lain-lain. Penelitian ini membuat adanya temuan baru tentang enzim yang dapat diisolasi melalui bakteri karena dengan adanya enzim reaksi kimia yang kompleks dan rumit dapat diamati. Percobaan ini akan mempelajari tentang isolasi dan produksi enzim.

1.2 Rumusan MasalahAdapun rumusan masalah dalam percobaan ini adalah :1. Bagaimana menentukan aktivitas enzim xilanolitik?2. Berapa berat molekul enzim Endo--1,4-D-Xilanase ?3. Berapa energi aktivasi enzim kasar (crude) ?4. Berapa energi aktivasi enzim dengan fraksinasi bertingkat 40-50 ?5. Berapa kadar protein yang dihasilkan oleh enzim ?

1.3 TujuanAdapun tujuan dalam percobaan ini adalah :1. Menentukan aktivitas enzim xilanolitik.2. Menentukan berat molekul relatif enzim Endo--1,4-D-Xilanase.3. Menentukan energi aktivasi enzim kasar (crude).4. Menentukan energi aktivasi enzim dengan fraksinasi bertingkat 40-50.5. Menentukan kadar protein yang dihasilkan oleh enzim

1.4 Manfaat Adapun manfaat yang akan didapatkan dalam percobaan ini adalah1. Mahasiswa dapat menentukan aktivitas enzim xilanolitik.2. Mahasiswa dapat menentukan berat molekul relatif enzim Endo--1,4-D-Xilanase.3. Mahasiswa dapat menentukan energi aktivasi enzim kasar (crude).4. Mahasiswa dapat menentukan energi aktivasi dengan fraksinasi bertingkat 40-50.5. Mahasiswa dapat menentukan kadar protein yang dihasilkan oleh enzim.

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Enzim Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel yang bekerja dengan urutan yang teratur. Enzim mengkatalisis reaksi bertahap yang menguraikan melekul nutrient, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makro molekul sel dari perkusor sederhana. Pemakaian enzim memiliki banyak keunggulan seperti menghemat energi, mengurangi kebutuhan bahan kimia (Thenawijaya, 1992). Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organik. Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk. Jenis produk yang akan dihasilkan bergantung pada suatu kondisi/zat, yang disebut promoter. Semua proses biologis sel memerlukan enzim agar dapat berlangsung dengan cukup cepat dalam suatu arah lintasan metabolisme yang ditentukan oleh hormon sebagai promoter (Anonim, 2014).Enzim umumnya merupakan protein globular dan ukurannya berkisar dari hanya 62 asam amino pada monomer 4-oksalokrotonat tautomerase, sampai dengan lebih dari 2.500 residu pada asam lemak sintase. Terdapat pula sejumlah kecil katalis RNA, dengan yang paling umum merupakan ribosom. Jenis enzim ini dirujuk sebagai RNAenzim ataupun ribozim. Aktivitas enzim ditentukan oleh struktur tiga dimensinya (struktur kuaterner). Walaupun struktur enzim menentukan fungsinya, prediksi aktivitas enzim baru yang hanya dilihat dari strukturnya adalah hal yang sangat sulit (Anonim, 2014).

2.2 Enzim Xilanolitik Xilan adalah komponen utama hemiselulosa yang memiliki tulang punggung rantai D-xilopiranosa dengan ikatan glikosidik -1,4. Xilan memiliki residu O-asetil, arabinosil dan 4-O-metil-D-asam glukoronat yang terikat pada tulang punggungnya. Hidrolisa lengkap xilan menjadi monomernya memerlukan kerja sinergi beberapa enzim xilanolitik (Subramaniyan dan Prema, 2002).Enzim xilanolitik merupakan enzim kompleks yang terdiri atas 1,4--endoxilanase, -xilosidase, -L-arabinofuranosidase, -glukuronidase, asetil xilan esterase dan asam fenolat (asam ferulat dan asam fumarat) esterase (Collins et al., 2005). Xilanase mikroba memiliki aplikasi yang luas. Enzim ini dapat digunakan untuk biobleaching pada industri kertas, penjernihan dan meningkatkan aroma jus dan anggur, meningkatkan kualitas roti dan pakan ternak, pengolahan limbah serta pengomposan (Meryandini et al., 2008).Enzim xilanolitik dihasilkan oleh bakteri xilanolitik. Bakteri xilanolitik mampu memproduksi enzim endo--1,4-xilanase, -xilosidase, -L-arabinofuranosidose, -L-glukoronidase dan asetil xilan esterase. Hidrolisis total xilan membutuhkan beberapa enzim yang berbeda yaitu : endo-1,4- -xilanase yang menghidrolisis struktur dasar xilan secara acak menjadi xilooligosakarida; 1,4- -xilosidase yang memutus xilooligosakarida menjadi xilosa. Gugus samping yang menyusun xilan akan dibebaskan oleh -L-arabinofurosidase, -L-glukorosidase, galaktosidase dan asetil xilan esterase menjadi arabinosa, glukuronat, galaktosa dan asetat (Subramaniyan dan Prema., 2002).

2.3 Enzim XilanaseXilanase merupakan enzim ekstraseluler yang mempunyai kemampuan menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi xilo-oligosakarida dan xilosa. Enzim ini terdiri dari endo--xilanase (EC 3. 2. 1. 8) dan -xylosidases (EC 3. 2. 1.37). Xilanase dapat dihasilkan oleh mikroba melalui proses fermentasi. Enzim xilanase diperlukan oleh beberapa industry antara lain industri pangan, pakan ternak, pemutih bubur kertas/pulp, dan biokonversi lignoselulosa untuk bahan bakar (Kimet al. 2000; Rifaat et al. 2005). Hal yang dilakukan untuk mempercepat proses pada umumnya industri menggunakan suhu tinggi. Salah satunya pada industri kertas proses pembuatan bubur kertas dilakukan dengan pemanasan (Sirait 2003), agar enzim xilanase dapat ditambahkan tanpa harus dilakukan proses pendinginan maka diperlukan enzim xilanase termostabil. Hal ini dikarenakan enzim termostabil mampu mempertahankan aktivitasnya pada suhu tinggi.

Xilanase adalah salah satu enzim yang memiliki prospek yang besar sebagai enzim penghidrolisis hemiselulosa. Beberapa industri memerlukan xilanase yang tahan pada suhu tinggi. Proses di industri memerlukan enzim yang aktif dan stabil pada suhu tinggi, sehingga memudahkan pencampuran, substrat mudah larut, mempercepat reaksi, dan mencegah kontaminasi. Salah satunya adalah mencari enzim termostabil yang dihasilkan oleh mikroorganisme termofilik. Mikroorganisme tersebut umumnya hidup di sumber air panas. Tujuan dari eksperimen ini adalah untuk mengisolasi dan menyeleksi bakteri yang dapat menghasilkan xilanase tinggi, serta menentukan kondisi produksi enzim. Seleksi dilakukan dengan penapisan semikuantitatif menggunakan deteksi pada plat agar mengandung substrat xilan dan penapisan kuantitatif dengan mengukur aktivitas enzim. Kondisi optimal produksi enzim dipelajari dengan menentukan jenis dan jumlah substrat, pH serta suhu (Susilowati et al., 2002).Xilanase dimurnikan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dan penukar ion. Matrik Sephadex G-100 dikembangkan dalam 10 mM bufer fosfat pH 6,0. Matrik DEAE-Sephadex A50 dikembangkan dengan 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Protein yang tidak terikat matrik dibilas dengan bufer yang sama, sedangkan protein yang terikat matrik dibilas dengan gradien linier larutan NaCl (0-0,5 M NaCl dalam bufer yang sama) dan 1 M NaCl. Pembilasan dilakukan dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit (Meryandini et al., 2008).

BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan3.1.1 Alat Gelas ukur Alat sentrifugasi Tabung reaksi Beaker gelas Erlenmeyer Pipet volume Ball pipet Kantung dialisis Lempengan kaca sandwich Penangas air Set alat elektroforesis Power supply Spektrofotometer

3.1.2 Bahan 1 loop jarum ose bakteri positif xilanolitik MELB cair Enzim Endo--1,4-D-Xilanase Substrat oat-speltxylan 0,5% Buffer fosfat-sitrat Reagen DNS (Na-K tartrat, NaOH, DNS, C6H5OH, Na2SO3) Aquades D-xilosa Ammonium sulfat Buffer Tris-HCl 50 mM Reagen kerja Bradford (100 mg CBB G250, 100 mL H3PO4 85%, 50 mL C6H5OH 95%, aquades 1000 mL) Larutan standar BSA Enzim SDS-PAGE SDS 10% Gliserol -merkaptoetanol BPB 1% Glisin CH3OH CH3COOH

3.2 Alur Percobaan3.2.1 Inokulasi/Produksi Bakteri XilanolitikBakteri positif xinanolitikHasil

Diinokulasikan 1 loop bakteri ke dalam 5,0 mL medium MELB cair yang disuplementasi xilan. Dikocok (dishaker) inkubasi selama 12 jam. Diambil sebanyak 1% dari volume medium produksi yang akan dibuat. Diinokulasikan ke dalam medium MELB yang displementasikan xilan (medium produksi). Dishaker inkubasi pada suhu 37oC selama 12 jam.

3.2.2 Pemanenan Sel dan Isolasi Ekstrak Kasar Enzim XilanolitikInokulum hasil inkubasiHasil

Disentrifuse pada kecepatan 1,0x104rpm selama 15 menit. Ditentukan aktivitas supernatan ekstrak enzim kasar xilanolitik.

3.2.3 Penentuan Aktivitas Enzim Xilanolitik (Enzim Endo--1,4-D-Xilanase)Enzim Endo--1,4-D-XilanaseHasil

Diambil 100 l dan ditambahkan pada 100l suspensi substrat oat-speltxylan 0,5% dalam buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 5,0). Dibuat kontrol dengan mencampurkan 100 l enzim inactive yang dipanaskan pada suhu 100oC selama 5 menit, 600 l reagen DNS dan 100 l suspensi substrat oat-speltxylan. Diinkubasi hasil langkah 1 bersama kontrol selama 60 menit pada suhu 40oC. Ditambahkan 600 l reagen DNS (Na-K tartrat, NaOH, DNS, C6H5OH, Na2SO3). Direinkubasi bersama dengan kontrol dalam air mendidih selama 15 menit dan didinginkan secara langsung dalam air es selama 20 menit. Ditentukan absorbansi warna yang dihasilkan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. Dibuat standar dengan menggunakan D-xilosa yang diperlakukan sama dengan sampel dan kontrol. Diganti D-xilosa dengan aquades sebagai blanko.

3.2.4 Purifikasi Parsial Enzim Endo--1,4-XilanaseEndo--1,4-XilanaseHasil

Ditambahkan (NH4)2SO4 jenuh 0-100% dengan rentang 10% untuk proses fraksinasi ammonium sulfat. Dijenuhkan dalam keadaan dingin sambil diaduk perlahan. Disentrifugasi pada kecepatan 8x103rpm selama 15 menit dengan suhu 4oC hingga diperoleh supernatan dan pellet-pellet protein. Diresuspensi ke dalam buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 7,5). Ditentukan aktivitas protein seperti prosedur 3.2.3 dan kadar protein. Didialisis supernatan hasil langkah 5 yang aktivitas spesifiknya tinggi selama 12 jam dalam buffer Tris-HCl 50mM (pH 7,5) menggunakan kantung dialisis pada suhu 4oC. Dilakukan penggantian buffer pada 2, 4, 6 jam setelah dialisis dimulai. Ditentukan aktivitas dan kadar protein untuk enzim Endo--1,4-Xilanase hasil dialisis.

3.2.5 Penentuan Kadar Protein Enzim Endo--1,4-XilanaseEndo--1,4-XilanaseHasil

Diambil 20 l dan dicampur dengan buffer. Ditambahkan sebanyak 1000 l reagen kerja Bradford (100 mg CBB G250, 100 ml H3PO4 85%, 50 ml C2H5OH 95%, aquades hingga 1000 ml) hingga volumenya 100 l. Diinkubasi selama 2-5 menit. Ditentukan absorbsivitas dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan standar larutan BSA. Digunakan aquades sebagai blanko.

3.2.6 Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim Endo--1,4-Xilanase Endo--1,4-XilanaseHasil

Diestimasi dengan elektroforesis protein SDS-PAGE melalui metode Bollag. Ditentukan berat molekul relatifnya dengan membandingkan pita migrasi protein dengan pita migrasi marker. Ditentukan absorbsivitas dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan standar larutan BSA.

3.2.7 Tahapan Elektroforesis untuk Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim Endo--1,4-Xilanase3.2.7.1 Preparasi Gel SDS-PAGESampelHasil

Dilakukan pencucian untuk seluruh perangkat elektroforesis. Dibersihkan lempengan kaca sandwich untuk pembuatan gel dengan etanol dan dikeringkan. Dirangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk. Diisi lempengan kaca pencetak gel dengan aquades di atas gel. Diinjeksikan formulasi gel ke dalam pencetak gel dan segera dilakukan pemasangan sisir cetakan dan dilepas apabila gel telah berpolimerisasi. Dibilas sumur yang terbentuk dengan aquades.

3.2.7.2 Preparasi Sampel SDS-PAGEEnzimHasil

Diambil 40 l yang telah ditambahkan bufer sampel (2 ml SDS 10%, 5 ml gliserol 50%, 0,5 ml -merkaptoetanol, 1 ml BPB 1% dan 0,9 ml aquades dicampurkan ke dalam 0,6 ml Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)) sebagai campuran untuk SDS-PAGE. Dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit untuk mendenaturasi.

3.2.7.3 Running SDS-PAGEProtein

Hasil

Dirangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk. Diisi kompartemen dengan larutan buffer elektrode (running buffer; 25 mM Tris, 250 mM glisin dan 0,1% SDS/ stok 5x15,1 g Tris Base, 94 g glisin, 50 ml 10% SDS ditambahkan aquades hingga volume 100 ml) hingga memenuhi kompartemen atas dan bawah. Diinjeksikan sampel protein ke dalam masing-masing sumur yang terbentuk pada gel. Ditutup kompartemen yang telah dibuat. Dihubungkan elektrode pada kompartemen atas dan bawah pada power supply dengan voltase 40-100 V dan arus listrik 5,0 A. Dihentikan elektroforesis jika warna biru tracking dye (BPB) telah mencapai sekitar 0,5 cm dari bagian bawah gel.

3.2.7.4 Staining dan Destaining SDS-PAGEGel elektroforesisHasil

Diambil gel dari lempeng kaca pencetak gel dengan hati-hati. Direndam dalam wadah berisi larutan pewarna (staining solution; 1 g CBB R250, 450 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingga 100 ml). Digojok secara perlahan hingga larutan pewarna dapat diikat oleh protein. Dicuci dengan larutan pelepas warna (destaining solution; 100 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingg 100 ml) jika protein tidak terikat pada larutan pewarna hingga pita-pita protein tampak jelas. Dilakukan penggoyangan untuk mempercepat pelepasan larutan warna.

3.3 Prosedur Kegiatan3.3.1 Inokulasi/Produksi Bakteri XilanolitikInokulasi 1 loop bakteri ke dalam 5,0 mL medium MELB cair yang disuplementasi xilan. Kocok (shaker) inkubasi selama 12 jam. Ambil 1% dari volume medium produksi yang akan dibuat. Inokulasikan ke dalam medium MELB yang disuplementasikan xilan (medium produksi). Kocok (shaker) lagi inkubasi pada suhu 37oC selama 12 jam.3.3.2 Pemanenan Sel dan Isolasi Ekstrak Kasar Enzim XilanolitikSentrifuse inokulum hasil inkubasi pada kecepatan 1,0x104rpm selama 15 menit. Tentukan aktivitas supernatan ekstrak enzim kasar xilanolitik.3.3.3 Penentuan Aktivitas Enzim Xilanolitik (Enzim Endo--1,4-D-Xilanase)Ambil 100 l enzim Endo--1,4-D-Xilanase dan tambahkan pada 100l suspensi substrat oat-speltxylan 0,5% dalam buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 5,0). Buat kontrol dengan mencampurkan 100 l enzim inactive yang dipanaskan pada suhu 100oC selama 5 menit, 600 l reagen DNS dan 100 l suspensi substrat oat-speltxylan. Inkubasi hasil langkah 1 bersama kontrol selama 60 menit pada suhu 40oC. Tambahkan 600 l reagen DNS (Na-K tartrat, NaOH, DNS, C6H5OH, Na2SO3). Reinkubasi bersama dengan kontrol dalam air mendidih selama 15 menit dan dinginkan secara langsung dalam air es selama 20 menit. Tentukan absorbansi warna yang dihasilkan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. Buat standar menggunakan D-xilosa yang diperlakukan sama dengan sampel dan kontrol. Ganti D-xilosa dengan aquades sebagai blanko.3.3.4 Purifikasi Parsial Enzim Endo--1,4-XilanaseTambahkan (NH4)2SO4 jenuh 0-100% dengan rentang 10% untuk proses fraksinasi ammonium sulfat dalam enzim Endo--1,4-Xilanase. Jenuhkan dalam keadaan dingin sambil aduk perlahan. Sentrifugasi pada kecepatan 8x103rpm selama 15 menit dengan suhu 4oC hingga diperoleh supernatan dan pellet-pellet protein. Resuspensi ke dalam buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 7,5). Tentukan aktivitas protein seperti prosedur 3.2.3 dan kadar protein. Dialisis supernatan hasil langkah 5 yang aktivitas spesifiknya tinggi selama 12 jam dalam buffer Tris-HCl 50mM (pH 7,5) menggunakan kantung dialisis pada suhu 4oC. Lakukan penggantian buffer pada 2, 4, 6 jam setelah dialisis dimulai. Tentukan aktivitas dan kadar protein untuk enzim Endo--1,4-Xilanase hasil dialisis.3.3.5 Penentuan Kadar Protein Enzim Endo--1,4-XilanaseAmbil 20 l enzim Endo--1,4-Xilanase dan campur dengan buffer. Tambahkan sebanyak 1000 l reagen kerja Bradford (100 mg CBB G250, 100 ml H3PO4 85%, 50 ml C2H5OH 95%, aquades hingga 1000 ml) hingga volumenya 100 l. Inkubasi selama 2-5 menit. Tentukan absorbsivitas dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan standar larutan BSA. Gunakan aquades sebagai blanko.3.3.6 Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim Endo--1,4-XilanaseEstimasi berat molekul enzim Endo--1,4-Xilanase dengan elektroforesis protein SDS-PAGE melalui metode Bollag. Tentukan berat molekul relatifnya dengan membandingkan pita migrasi protein dengan pita migrasi marker. Tentukan absorbsivitas dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan standar larutan BSA.

3.3.7 Tahapan Elektroforesis untuk Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim Endo--1,4-Xilanase3.3.7.1 Preparasi Gel SDS-PAGELakukan pencucian untuk seluruh perangkat elektroforesis. Bersihkan lempengan kaca sandwich untuk pembuatan gel dengan etanol dan keringkan. Rangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk. Isi lempengan kaca pencetak gel dengan aquades di atas gel. Injeksikan formulasi gel ke dalam pencetak gel dan segera lakukan pemasangan sisir cetakan dan lepas apabila gel telah berpolimerisasi. Bilas sumur yang terbentuk dengan aquades.3.3.7.2 Preparasi Sampel SDS-PAGEAmbil 40 l enzim yang telah ditambahkan bufer sampel (2 ml SDS 10%, 5 ml gliserol 50%, 0,5 ml -merkaptoetanol, 1 ml BPB 1% dan 0,9 ml aquades dicampurkan ke dalam 0,6 ml Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)) sebagai campuran untuk SDS-PAGE. Panaskan dalam air mendidih selama 5 menit untuk mendenaturasi.3.3.7.3 Running SDS-PAGERangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk. Isi kompartemen dengan larutan buffer elektrode (running buffer; 25 mM Tris, 250 mM glisin dan 0,1% SDS/ stok 5x15,1 g Tris Base, 94 g glisin, 50 ml 10% SDS ditambahkan aquades hingga volume 100 ml) hingga memenuhi kompartemen atas dan bawah. Injeksikan sampel protein ke dalam masing-masing sumur yang terbentuk pada gel. Tutup kompartemen yang telah dibuat. Hubungkan elektrode pada kompartemen atas dan bawah pada power supply dengan voltase 40-100 V dan arus listrik 5,0 A. Hentikan elektroforesis jika warna biru tracking dye (BPB) telah mencapai sekitar 0,5 cm dari bagian bawah gel.3.3.7.4 Staining dan Destaining SDS-PAGEAmbil gel dari lempeng kaca pencetak gel dengan hati-hati. Rendam dalam wadah berisi larutan pewarna (staining solution; 1 g CBB R250, 450 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingga 100 ml). Gojok secara perlahan hingga larutan pewarna dapat diikat oleh protein. Cuci dengan larutan pelepas warna (destaining solution; 100 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingg 100 ml) jika protein tidak terikat pada larutan pewarna hingga pita-pita protein tampak jelas. Lakukan penggoyangan untuk mempercepat pelepasan larutan warna.

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil 4.1.1 Penentuan Energi Aktivasi Enzim endo--1,4-D-xilanasea. SampelPerlakuanHasil

Sampel 300 L+ xylan 300 L (2 tabung eppendorf) Diinkubasi pada suhu 40C (30 menit) Ditambah 300 L reagen nelson Dipanaskan pada suhu 100C (10 menit) Ditambahkan arseno Diukur absorbansi (=540 nm)Pengenceran : 400 L pada 3600 L airSampel : berwarna kuningXylan : tidak berwarna Berwarna kuningBerwarna biruBerwarna kuning kehijauan

Berwarna biru kehijauan Absorbansi sampel 1 = 0,150Absorbansi sampel 2 = 0,253

b. KontrolPerlakuanHasil

Sampel 300 L dimasukkan dalam eppendorf dan dipanaskan Ditambah xylan 300 L Diinkubasi pada suhu 40C (30 menit) Ditambah 300 L reagen nelson Dipanaskan pada suhu 100C (10 menit) Ditambahkan arseno Diukur absorbansi (=540 nm)

Berwarna kuning pucat

Tidak berubah Tidak berubah Berwarna biru Berwarna biru lebih pudar

Larutan berwarna biru tua Absorbansi kontrol 1 = 0,292Absorbansi kontrol 2 = 0,394

c. Pembuatan Kurva Standar XilosaPerlakuan Hasil

Larutan xilosa (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5) + reagen nelson Dipanaskan dalam air 100C selama 10 menit Ditambah arsenomolybdat Diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UVBerwarna biru

Berwarna kekuningan

Berwarna biru pekat, meletupA0,02 = 0,136A0,04 = 0,159A0,06 = 0,168A0,08 = 0,267A0,10 = 0,394

4.1.2 Fraksinasi Bertingkat 40-50Absorbansi Uji bradfordKontrol Uji nelson

Sampel fraksinasi 40%0,3930,1720,173

Sampel fraksinasi 40-50% 0,1430,2110,215

4.2 PembahasanPercobaan pertama yaitu unuk menentukan energi aktivasi enzim endo--1,4-D-xilanase dengan mengenakan perlakuan yang berbeda antara sampel dan kontrol. Sampel dan kontrol diletakkan pada tabung yang berbeda. Tabung pertama berisi sampel 300L berwarna kuning dan ditambahkan xylan 100 L. Tabung berisi sampel bertujuan untuk mengetahui xilosa enzim, substrat dan aktifitas enzim xilanase. Tabung yang berisi sampel tersebut kemudian diinkubasi selama 30 menit dengan suhu sekitar 40C. Proses inkubasi ini digunakan untuk memberikan waktu kepada enzim untuk menurunkan energi aktivasi. Setelah 30 menit diinkubasi, larutan ditambahkan 300 L reagen nelson. Penentuan aktivitas enzim dilakukan dengan mengukur konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan dari aktivitas enzim menggunakan metode Nelson ini. Penambahan arseno kemudian dilakukan, hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada larutan agar dapat teranalisis ketika diukur menggunkan spektrofotometer UV. Hal tersebut sesuai dengan salah satu syarat larutan dapat diukur menggunakan spektrofotometer UV yaitu harus berwarna. Pengukuran absorbansi sampel tersebut dilakukan pada panjang gelombang 540 nm. Nilai adsorbansi yang dihasilkan oleh dua sampel adalah sebesar 0,160 dan 0,253. Perlakuan pada tabung kedua yaitu membuat kontrol yang bertujuan untuk mengetahui uji xilosa enzim dan xilosa substrat. Hal yang pertama dilakukan adalah sampel sebanyak 300 L dipanaskan dalam eppendorf, dihasilkan warna sampel berupa kuning pucat. Tujuan pemanasan ini adalah untuk menonaktifkan enzim dalam sampel agar tidak dapat bekerja dengan substratnya. Selanjutnya ditambahan dengan 300 L substrat xylan, dan dipanaskan pada suhu 40C selama 30 menit. Reagen nelson sebanyak 300 L ditambahkan ke dalam eppendorf yang berisi sampel dan xylan. Penambahan ini membuat campuran yang mulanya berwarna kuning pucat menjadi berwarna biru. Campuran kemudian dipanaskan selama 10 menit dalam air panas dengan suhu 100C dan membuat campuran menjadi biru yang memudar. Campuran tersebut kemudian ditambahkan reagen arseno sebanyak 300 L dan campuran berubah menjadi biru tua. Kontrol dibuat sebanyak 2 kali (dilakukan duplo). Selanjutnya, diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 540 nm. Absorbansi yang dihasilkan adalah 0,292 dan 0,394. Hasil yang didapat memberikan perbedaan yang signifikan pada masing-masing tabung yaitu dengan melihat warna larutan dari tiap tabung. Perbedaan warna tersebut membuat pengukuran absorbansinyanya berbeda pula. Pada tabung sampel warna larutannya adalah kuning sedangkan tabung kontrol larutannya berwarna kuning pucat. Perbedaan warna tersebut terjadi karena pengaruh dari penambahan enzim xilanase pada saat telah dan belum dipanaskan sehingga mempengaruhi hasil xilosa yang didapat pada masing-masing tabung. Penambahan enzim xilanase pada tabung kontrol kemudian dipanaskan membuat aktivitas enzim xilanase tidak melakukan reaksi-reaksinya, sedangkan pada tabung sampel sebelum inkubasi sudah ditambahkan enzim xilanase diawal percobaan dan tidak dilakukan pemanasan sehingga aktivitas enzim xilanase sudah terjadi dan telah melakukan reaksi hidrolisis terhadap substrat (xilan). Pemanasan pada kontrol dan sampel tanpa pemanasan dengan enzim xilanase di dalamnya sangat mempengaruhi warna sampel dan membuat xilosa yang dihasilkan juga berbeda yaitu dengan melihat warnanya yang kemudian dapat diukur dengan spektrofotometer. Enzim xilanase dapat memproduksi 1 mol xilosa per 1 menit, sehingga tabung sampel xilosa yang didapat lebih banyak dari pada pada tabung kontrol, hal ini disebabkan pada tabung sampel tidak dilakukan pemanasan dan membuat enzim yang merupakan protein tidak mengalami denaturasi dan tetap dapat melakukan aktifitasnya.Pembuatan larutan sampel dan kontrol tersebut digunakan untuk menentukan energi aktivasi enzim dengan membuat kurva standar xilosa. Pembuatan kurva standar xilosa dengan membuat larutan xilosa pada konsentrasi 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/mL. Masing-masing konsentrasi dari larutan xilosa kemudian ditambah reagen nelson, selanjutnya larutan dipanaskan selama 10 menit pada suhu 100C. Tahapan selanjutnya adalah purifikasi parsial enzim endo--1,4-xilanase. Proses purifikasi ini melalui beberapa tahapan yaitu fraksinasi amonium sulfat, dialisis yang selanjutnya diuji protein menggunakan metode bradford dan penentuan berat molekul menggunakan elektroforesis SDS-PAGE. Tahapan fraksinasi bertujuan untuk memekatkan enzim. Proses ini menggunakan ekstrak kasar enzim endo--1,4-D-xilanase yang ditambahkan amonium sulfat. Penambahan amonium sulfat ini dapat menarik molekul air yang pada awalnya mensolvasi pada permukaan protein enzim sehingga residu hidrofob pada permukaan protein terekspose dan menyebabkan protein mengendap. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya ikatan hidrogen antara protein dengan air. Semakin banyak jumlah garam yang ditambahkan maka ikatan hidrogen antara protein dengan air semakin kecil. Massa amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam sampel menggunakan perhitungan pada fraksinasi yang digunakan. Fraksinasi yang digunakan oleh kelompok 6 adalah fraksinasi bertingkat 40-50. Amonium sulfat yang ditambahkan merupakan 40% dari total sampel yakni 10 mL sehingga didapatkan jumlah amonium sulfat sebanyak 4 gram. Amonium sulfat ditambahkan sedikit demi sedikit agar cepat larut dan mengurangi kesedian air yang berinteraksi dengan protein. Pengadukan juga dilakukan dengan perlahan untuk menghindari terbentuknya busa yang menandakan bahwa enzim terdenaturasi. Perlakuan ini tetap dalam suhu rendah (4C) agar enzim endo--1,4-xilanase tidak terdenaturasi. Amonium sulfat yang telah larut kemudian disentrifugasi selama 15 menit. Proses ini tidak didapatkan pelet pada sampel sehingga dilakukan sentrifugasi kembali selama 2 kali 15 menit. Larutan yang telah disentrifugasi selama 45 menit tersebut menghasilkan volume 13 mL supernatan tanpa terbentuk pelet. Peningkatan volume sebanyak 3 mL dalam tabung tersebut disebabkan adanya pelarutan amonium sulfat dalam surfaktan. Supernatan selanjutnya diambil volume sebanyak 10 mL untuk ditambahkan amonium sulfat sebanyak 50% dari total volume supernatan yang digunakan untuk dilakukan fraksinasi bertingkat. Penambahan amonium sulfat ini dilakukan sedikit demi sedikit agar dapat larut dan mengurangi kesedian air yang berinteraksi dengan protein. Namun, pelarutan pada fraksinasi ini cukup sulit, dibutuhkan waktu yang lama agar amonium sulfat dapat larut. Amonium yang sudah larut kemudian disentrifugasi selama 25 menit. Supernatan yang sudah difraksinasi secara bertingkat (40-50) seharusnya dilakukan dialisis. Proses dialisis ini untuk mengantisipasi adanya aktivitas protease yang mungkin ada. Hal ini perlu dilakukan karena enzim protease mampu merusak struktur enzim dan dapat menurunkan energi aktivasinya. Proses ini dilakukan pada suhu 4C dengan memasukkan pelet yang dihasilkan pada proses fraksinasi kemudian dimasukkan ke dalam kantung dialisis. Kantung tersebut selanjutnya dimasukkan dalam larutan yang siap diaduk menggunakan pengaduk magnetik atau stirer. Namun, proses ini tidak dilakukan karena kantung dialisis yang tidak ada. Reaksi antara enzim endo--1,4-xilanase dengan substratnya (xilan) menghasilkan xilosa dan xilooligosakarida. Kemurnian enzim dapat dilakukan uji menggunakan bradford dan uji nelson. Uji bradford dilakukan untuk menguji kadar protein yang dihasilkan (xilosa) dan dilakukan uji menggunakan reagen nelson simogyi untuk menentukan gula pereduksinya (xilooligosakarida). Aktivitas enzimnya pada fraksinasi 40 dan fraksinasi bertingkat 40-50 diuji keesokan harinya. Pengujian aktivitas enzim ini dilakukan dengan mengukur absorbansi pada masing-masing fraksinasi dan didapatkan absorbansi pada fraksinasi 40 adalah 0,173 dan 0,215 pada fraksinasi 50. Pengukuran aktivitas enzim ini diperlukan kontrol sebagai pembanding sampel. Kontrol dibuat dengan menambahkan enzim pada tabung eppendorf yang kemudian dipanaskan pada suhu 100C untuk menonaktifkan enzim. Enzim yang sudah dipanaskan ini kemudian ditambahkan xylan sebagai substrat dan kemudian diinkubasi, selanjutnya sampel ditambah dengan reagen nelson. Penambahan nelson ini bertujuan untuk pengukuran gula pereduksi yang dihasilkan. Perlakuan selanjutnya sampel dipanaskan dan ditambah dengan arseno sebanyak 300L sampel teramati berwarna biru tua. Pengukuran dengan spektrofotometer dan didapatkan hasil absorbansi sebesar 0,712. Pengukuran absorbansi juga dilakukan setelah proses fraksinasi bertingkat 50, perlakuan untuk kontrol pada fraksinasi ini sama dengan perlakuan kontrol pada fraksinasi bertingkat 40 dan dihasilkan nilai absorbansi sebesar 0,211. Purifikasi enzim endo--1,4-xilanase ini diukur energi aktivasinya menggunakan cara yang sama seperti pada sampel crude. Aktivitas enzim yang didapatkan pada fraksinasi 40 adalah 2,701.10-5 unit/mL dan 2,91. 10-5 unit/mL pada fraksinasi 50. Uji yang dilakukan pada enzim adalah uji Bradford. Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi atau kadar protein total dengan metode kolorimetri dalam suatu larutan. Prinsip pengukuran kadar protein menggunakan metode Bradford adalah pengikatan pewarna Commassie Brilliant Blue G-250 yang terdapat dalam pereaksi Bradford dengan protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (Tirosin, Triptofan dan Fenilalanin) atau bersifat basa (Arginin, Histidin, dan Leusin) membentuk komplek berwarna biru yang dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometri (LambertBeer) pada panjang gelombang 465-595 nm (cahaya tampak).

Gambar 4.1. Struktur Commassie Brilliant Blue (Anam, 2010).

Langkah pertama yang dilakukan dalam pengujian bradford ini yaitu sampel diambil sebanyak 7 L kemudian ditambahkan dengan 25 L larutan buffer. Selanjutnya penambahan reagen bradford dilakukan sebanyak 1 mL, penambahan ini membuat perubahan warna pada sampel yang terdapat pada eppendorf, yaitu sampel menjadi berwarna biru tua. Perubahan warna ini didasarkan pada pergeseran absorbansi pewarna Commassie Brilliant Blue G-250 yang dalam kondisi asam bentuk merah pewarna diubah menjadi bentuk yang lebih biru untuk mengikat protein yang sedang diuji. Kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen Bradford terjadi sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil. Kestabilan warna biru Commassie Brilliant Blue G-250 ini karena adanya interaksi antara lapisan hidrofobik dari protein dengan bentuk anion dari zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250 yang menstabilkan bentuk anion tersebut, sehingga jumlah saat ini yang kompleks dalam larutan adalah ukuran untuk konsentrasi protein, dan dapat diperkirakan dengan menggunakan pembacaan absorbansi.Proses selanjutnya yaitu dilakukannya proses inkubasi selama 2-5 menit, proses ini merupakan tahap dimana enzim akan melakukan aktivitasnya, dengan kata lain hal ini merupakan pemberian waktu unutk enzim dalam melakukan aktivitas. Langkah berikutnya yaitu pengukuran absorbansi yang dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometer UV Vis, yaitu alat yang digunakan untuk analisis kuantitatif farmasi yang memiliki prinsip radiasi pada rentang panjang gelombang 200-700 nm yang dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron-elektron pada ikatan di dalam molekul menjadi tereksitasi sehingga menempati keadaan kuantum yang lebih tinggi dan dalam proses penyerapan sejumlah energi yang melewati larutan tersebut. Pengukuran dengan spektrofotometer dapat dilakukan karena larutan menghasilkan warna berupa biru tua sehingga dapat dideteksi oleh alat tersebut pada panjang gelombang 595 nm. Hasil absorbansi yang didapatkan pada sampel 1 dan 2 adalah 0,686 dan 0,653. Penentuan kadar protein xilanase dapat dilakukan dengan menggunakan kurva standar bovine serum albumin (BSA). Pembuatan bovine serum albumin (BSA) dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi BSA di dalam 50 mM larutan dapar Tris-HCl pH 9. Setiap variasi konsentrasi standar BSA diambil sebanyak 50 L kemudian dicampurkan dengan 2,5 mL larutan bradford dalam tabung reaksi. Larutan yang telah divampur kemudian dihomogenkan dengan vorteks, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. Kurva standar BSA adalah grafik hubungan konsentrasi protein standar (BSA dengan variasi konsentrasi) dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 595 nm. Persamaan garis dapat diperoleh dari hasil plot konsentrasi 0,01; 0,015; 0,02; 0,025; 0,03 terhadap nilai absorbansi dari masing-masing konsentrasi tersebut yaitu 0,345; 0,497; 0,571; 0,620; 0,677 yaitu y 15,74x + 0,2272 dengan nilai regresi sebesar 0,9387. Penentuan kadar protein dapat diperoleh dengan memasukkan nilai absorbansi dari sampel kedalam persaman garis, sehingga menghasilkan konsentrasi sampel 1 dan 2 yang telah dirata-rata absorbansinya yaitu 0,028 mg/mL. Keuntungan dari metode ini adalah pereaksi yang digunakan sangat sederhana dan mudah disiapkan, nilai akurasi dan presisi data yang didapatkan cukup tinggi serta untuk menjamin keakuratan data sampel yang berada di luar jangkauan dapat dilakukan uji ulang yang hanya membutuhkan beberapa menit saja. Hal itu membuat keefektifan kerja sangat cepat (Septiningrum dan Moeis, 2008).Perlakuan berikutnya yaitu melakukan uji nelson. Perlakuan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas enzim yang dapat dilakukan dengan mengukur gula pereduksi dari sampel. gula pereduksi yang dihasilkan pada reaksi antara enzim endo--1,4-D-xilanase dengan substrat xilan menghasilkan gula pereduksi xilooligosakarida. Sampel yang telah difraksinasi bertingkat 40%-50% diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV dan dihasilkan absorbansi pada fraksinasi 40% adalah 0,17 sedangkan absorbansi pada fraksinasi bertingkat 50% adalah 0,215. Hasil tersebut menunjukkan bahwa semakin besar gula pereduksi yang dihasilkan maka absorbansi yang dihasilkan juga semakin besar pula dengan kata lain gula pereduksi yang dihasilkan menggunakan fraksinasi bertingkat 50% lebih banyak dibandingkan pada fraksinasi 40%.Uji kemurnian selanjutnya adalah penentuan berat molekul enzim endo--1,4-D-xilanase dengan elektroforesis protein SDS-PAGE. Uji kemurnian bergantung terhadap aktifitas enzim xilanase yang optimum. Penentuan berat molekul enzim dilakukan dengan langkah-langkah berikut yaitu, enzim ditambahkan larutan buffer sampel sebagai campuran SDS-PAGE, lalu dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit untuk mendenaturasi enzim. Sampel tersebut lalu diletakkan pada sumur-sumur pada sisir yang terdapat pada lapisan gel atas, kemudian dirunning selama 5 jam (kira-kira 0,5 cm dari gel terbawah).Proses yang dilakukan setelah running adalah staining dan destaining. Proses staining ini adalah proses pewarnaan pada protein pada enzim agar garis pada gel yang dihasilkan pada proses staining dapat teramati. Proses destaining adalah pencucian warna yang telah dilakukan sehingga akan nampak bedanya antara garis yang menunjukkan berat molekul enzim dengan gelnya. Namun, hasil yang diperoleh menunjukkan tidak adanya garis pada gel-gel dalam sumur tersebut. Hal tersebut diakibatkan karena proses staining atau pewarnaan yang berlebih sehingga mengakibatkan pencucian (destaining) tidak dapat dilakukan secara optimal.

BAB 5. PENUTUP

5.1 Kesimpulan Adapun kesimpulan pada percobaan isolasi enzim adalah 1. Penentuan aktivitas enzim dapat dilakukan menggunakan crude dengan uji bradford menggunakan sampel dan xilosa terhadap kontrol. 2. Berat molekul enzim Endo--1,4-D-Xilanase tidak menunjukkan hasil yang seharusnya. 3. Kemampuan suatu senzim endo--1,4-D-xilanase menghasilkan 1,12.10-3 unit/mL xilosa pada suhu 40C dengan suhu 30 menit4. Energi aktivasi enzim pada fraksinasi 40% adalah 2,701. 10-5 unit/mL dan fraksinasi bertingkat 40-50% adalah 2,91. 10-5 unit/mL.5. Konsentrasi protein yang dihasilkan pada penentuan kadar protein enzim adalah 0,028 mg/mL.

5.2 SaranSaran yang dapat diberikan pada percobaan ini adalah praktikan dapat melakukan kegitan praktikum secara lengkap agar tahu dan paham proses yang seharusnya. Selain itu, pemberian warna pada proses staining seharusnya diberikan dalam jumlah yang tidak terlalu banyak.

DAFTAR PUSTAKA

Anam, Khoirul. 2010. Bioteknologi. Bandung : Institut Teknologi Bandung.Anonim. 2014. Kloning Dan Overekspresi Gen Beta-Endoxylanase Asal Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Dan Produksi Xilooligosakarida sebagai Produsen Prebiotik. [Serial Online].http://repository.unej.ac.id/ bitstream/handle/123456789/1042/hbAnak%20Agung%20Istri%20Ratnadewi. pdf?sequence=1. [diakses 12 November 2014].Collins, Gerday, dan Feller. Fems Microbiol. Rev. (2005) 29:3-23Kim, J., Kim, S.C & Nam, S.W. 2000. Constitutive overexpression of the endoxylanase gene in Bacillus subtilis. J Microbiol Biotechnol 10: 551-553.Meryandini, Widhyastuti, dan Lestari. 2008. Pemurnian Dan Karakterisasi Xilanase Streptomyces Sp. Skk1-8. Jurnal Natur Indonesia 14(3), Juni 2012: 199-204. ISSN 1410-9379.Rifaat, H.M., Nagieb, Z.A & Ahmed, Y.M. 2005. Production of xylanases by Streptomyces species and their bleaching effect on rice straw pulp. App Ecol env Res 4(1): 151-160.Septiningrum, Krisna Dan Moeis, Maelita. 2008. Isolasi Dan Karakterisasi Xilanase dari Bacillus Circulans. Bandung : ITB.Sirait, S. 2003. Bleaching Toba Samosir. Sumatera Utara : PT. Toba Pulp Lestari, Training and Development Centre.Subramaniyan, dan Prema. 2002. Biotechnol Critical Rev. 22(1):33-46. Susilowati, Raharjo, Kurniawati,Rahim, Sumarlin, dan Ardiansyah. 2002. Produksi Xilanase Dari Isolat Sumber Air Panas Sonai, Sulawesi Tenggara Menggunakan Limbah Pertanian. Sulawesi Tenggara : Universitas Haluoleo.Thenawijaya, Maggy. 1992. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta : Erlangga. Tim Penyusun. 2014. Penuntun Praktikum Biokimia. Jember : Universitas Jember.

Lampiran 1. Menghitung Energi Aktivasi a. CrudeKonsentrasiAbsorbansi

0,020,136

0,040,159

0,060,168

0,080,267

0,10,394

y = 3,12x + 0,037 R2 = 0,849Absorbansi sampel 1 = 0,160Absorbansi sampel 1 = 0,253Absorbansi rata-rata = = 0,2065Absorbansi kontrol = 0,343U/ml = = = 1,12. 10-3 unit/mL

2. Fraksinasi Bertingkat 40-50%a. Fraksinasi 40%Absorbansi kontrol = 0,172Absorbansi sampel = 0,173

U/ml = = = 2,701. 10-5 unit/mL

b. Fraksinasi bertingkat 50%Absorbansi sampel = 0,215Absorbansi kontrol = 0,211

U/ml = = = 2,91. 10-5 unit/mL

3. Menghitung Kadar Protein KonsentrasiAbsorbansi

0,010,345

0,0150,497

0,020,571

0,0250,62

0,030,677

Absorbansi sampel 1 = 0,686Absorbansi sampel 2 = 0,653Absorbansi rata-rata = = 0,670y = 15,74x + 0,2272R = 0,9387Konsentrasi protein yang didapatkan adalah y = 15,74x + 0,22720,670 = 15,74x + 0,22720,443 = 15,74xx = = 0,028 mg/mL