Enzim Biosensor untuk Deteksi Residu Pestisida Organofosfat Berdasarkan Screen Printed Carbon Electrode (SPCE) - Bovine Serum Albumin (BSA)Abstrak Tingkat maksimum residu pestisida organofosfat beras adalah 0,1 mg / kg dan 0,5 mg / kg dalam sayuran. Kontrol residu pestisida pada produk pertanian diperlukan metode analisis cepat dan akurat. Penelitian ini dikembangkan biosensor untuk mendeteksi residu pestisida organofosfat dalam produk pertanian. Penelitian mempelajari diamobilisasi massa organofosfat hidrolase (OPH) dan karakterisasi biosensor. Pengukuran larutan konduktivitas dalam sel konduktivitas terdiri dari sepasang elektroda 1 5 mm2 screen printed carbon electrode (SPCE). Instrumen tersebut adalah konduktometer lokal yang dikonversi. Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa kinerja optimal dari biosensor itu diperoleh dari OPH 105 mg, pada pH 8,5 dengan waktu respon dari 45 detik. Dalam kondisi bahwa sensitivitas biosensor adalah 28,04 mikrodetik / ppm dan 0,18 ppm batas deteksi dan konsentrasi maksimum pestisida yang dapat diukur adalah 1 ppm. Biosensor telah diterapkan untuk mengukur residu pestisida pada beberapa sampel sayuran.Kata kunci : Biosensor konductometri; Pestisida organofosfat; Organofosfat hidrolase; Elektroda karbon layar cetak (Screen Printed Carbon Electrode)

Introduction Dua kelas pestisida untuk buah-buahan dan sayuran adalah insektisida dan fungisida. Tiga jenis insektisida secara luas yan digunakan adalah dizinon, dimethoate dan klorpirifos; mereka adalah kelas organofosfat. Pestisida organofosfat yang direkomendasikan oleh Departemen Pertanian karena pestisida organofosfat mudah hilang dalam alam. Namun demikian residu pestisida organofosfat pada manusia dapat menyebabkan keracunan baik yang akut maupun kronis; hal itu disebabkan oleh sifat akumulatif dari residu pestisida organofosfat [1]. Batas maksimum residu pestisida pada padi adalah 0,1 mg / kg dan sayuran 0,5 mg / kg [2]. Oleh karena itu, kita perlu beberapa tingkat kontrol yang baik dari senyawa beracun, karena meskipun tidak mematikan namun dapat terakumulasi dalam tubuh, yang dapat menyebabkan penyakit berbahaya.Metode konvensional untuk analisis residu pestisida organofosfat adalah kromatografi gas (GC) dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Namun, kedua metode memiliki kelemahan bahwa sampel uji dan prasyarat membutuhkan waktu yang relatif lama, dan kurang akurat jika tidak semua pestisida dapat dianalisis secara bersamaan [3]. Solusi yang tepat untuk mengatasi kurangnya GC dan HPLC adalah biosensor. Biosensor menawarkan berbagai manfaat; memiliki selektivitas yang sangat tinggi dan pengujian cepat, dapat digunakan berulang kali, dan sangat mudah untuk digunakan pada penentuan langsung dalam sampel yang nyata [4].Biosensor pestisida organofosfat dibuat berdasarkan hidrolisis organofosfat oleh hidrolase organofosfat (OPH) sebagai biokatalis. Hidrolisis menghasilkan ion H3O+ yang dapat dideteksi dengan potensiometrik, amperometri [5] [6], dan konductometri. Penelitian ini menggunakan transduser konduktometri, karena memiliki beberapa keuntungan; menggunakan elektroda kecil, dan membutuhkan tegangan dan produksi yang murah [7]. Menggunakan transduser konductometri telah dikembangkan berdasarkan penghambatan reaksi acetilcholinesterase pada kolesterol [8] [9]. Biosensor konductometri menggunakan elektroda Pt - nata de coco yang dimodifikasi juga telah dikembangkan untuk mendeteksi asam urat [10]. Kinerja biosensor dipengaruhi oleh pH dan jumlah enzim, sehingga penelitian ini dilakukan oleh jumlah enzim dan optimasi pH. Kinerja biosensor dipengaruhi oleh pH dan jumlah enzim, sehingga penelitian tersebut dilakukan oleh jumlah enzim dan optimasi pH.Pengukuran konduktivitas berdasarkan reaksi [11]:

R dan R 'kelompok aromethoxy, Z adalah kelompok fenoksi, dan X adalah O atau S

Konsentrasi awal R2XPOH berbanding lurus dengan konsentrasi organofosfat sehingga:

Konduktivitas larutan yang dihasilkan oleh hidrolisis organofosfat, dapat dihitung sesuai dengan persamaan berikut:

Karena OPH berkinerja optimal pada pH 7,5-9,5, pestisida organofosfat dilarutkan dalam tris-HCl penyangga yang memiliki konduktivitas yang sangat rendahExperimental Section

Material Hidrolase organofosfat diisolasi dari Speudomonas putida. Bovine serum albumin (BSA), Tris, dan diazinon yang purchace dari Sigma Aldrich (USA). Tris-HCl buffer dibuat di dalam air steril destilat. Larutan stok segar dibuat di Tris-HCl penyangga. Diazinon (O, O-Diethyl O- [4-metil-6- (propan-2-yl) il-pyrimidin-2] fosforotioat; CAS [333-41-5]; Mw = 304,35 digunakan sebagai insektisida organofosfat standar . Layar Dicetak Carbon Electrode (SPCE) adalah purchace dari QUASENSE Thailand.

The Design of Biosensors OrganophosphatePada 1 5 mm2 dari SPCE tetes permukaan 10 mL BSA (bovine serum albumin) 5%, dan 0,1% glutaraldehid 10 uL. Kemudian, dikeringkan pada 40C selama 1 jam. Selain itu, 5, 10; 15; 20 dan 25 uL larutan OPH (7 mg / mL) disuntikkan pada permukaan SPCE-BSA dan yang disimpan selama 24 jam pada 4C. Sebelum digunakan, SPCE dicuci dengan Tris-HCl pH buffer 8.Measurement of Solution Organophosphate ConductivityBiosensor direndam dalam larutan Tris-HCl penyangga (pH 7,5; 8,0, 8,5, 9,0 dan 9,5) untuk mendapatkan konduktivitas readeble. Itu diulang setiap pengukuran larutan konduktivitas. Kemudian, biosensor direndam ke dalam larutan diazinon (pH yang tepat) dan konduktivitas dicatat setelah layar menunjukkan nilai readeble.Results and DiscussionOptimization of Organophosphate HydrolaseKonsentrasi enzim merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi terhadap laju reaksi, sehingga mempengaruhi terhadap kinerja biosensor. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sensitivitas tertinggi biosensor pada OPH 70 dan 105 (g, tetapi koefisien korelasi terbaik adalah di 105 (g OPH (Tabel 1). OPH lebih dari 10 (g, sensitivitas dan koefisien korelasi adalah menurun. Hal ini disebabkan oleh keterbatasan luas permukaan SPCE. Dengan ukuran 1 5 mm, permukaan SPCE hanya menampung 105 (g OPH, karena enzim tidak dapat diamobilisasi sama sekali. Permukaan SPCE telah dilapisi oleh BSA-glutaraldehida, yang memiliki ukuran pori bervariasi, Gambar 1. Ukuran pori yang dapat melumpuhkan enzim yang memiliki ukuran cocok dengan OPH, sehingga OPH diamobilisasi tidak dapat ditingkatkan dengan massa OPH. Kemungkinan lain, OPH diakumulasi pada permukaan elektroda dan menghalangi migrasi ion.

Sensitivitas biosensor pada 70 (g OPH cukup baik tetapi koefisien korelasi masih belum memadai, itu mungkin disebabkan oleh OPH dari pada permukaan SPCE yang tidak merata, sehingga terdapat perbedaan dalam kecepatan migrasi ion. Jika OPH kurang dari 70 (g, sensitivitas biosensor sangat tidak memadai, sinyal hanya dihasilkan oleh migrasi ion dari larutan buffer. Berdasarkan hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa massa optimum enzim tergantung pada daerah elektroda. Dengan demikian, penelitian lebih lanjut harus dilakukan optimasi daerah SPCE.

Biosensor CharacterizationDalam penelitian ini, tujuan karakterisasi biosensor adalah penyelidikan kondisi kerja biosensor untuk mendapatkan performa maksimal. Penelitian mempelajari karakter biosensor pH dan waktu respon. PH optimum biosensor dipengaruhi oleh pH enzim. PH optimum OPH di kisaran 7,5-9,5, tergantung pada sumber OPH, media diamobilisasi, jenis dan konsentrasi buffer. Response time adalah ukuran dari laju reaksi antara enzim dan substrat, jika waktu respon terlalu panjang, yang menunjukkan kemurnian enzim rendah.

Effect of pH SolutionPersamaan korelasi konsentrasi pestisida dan konduktivitas pada berbagai pH ditunjukkan pada Tabel 2. Sensitivitas tertinggi biosensor dihasilkan pada pH 9, tetapi korelasi konsentrasi dan sinyal tidak mencukupi. Hal ini menunjukkan bahwa meskipun ion pada permukaan bagian dalam SPCE tinggi, tapi tidak sebanding dengan konsentrasi pestisida dalam larutan. Sensitivitas biosensor pada pH 8,5 lebih rendah dari pada pH 9, tetapi korelasi sekitar 1, sehingga dapat disimpulkan bahwa pH optimum biosensor adalah pada pH 8,5.Kinerja biosensor pada pH 7,5 dan 8 yang sangat rendah, karena OPH tidak bekerja secara optimal sehingga pestisida terhidrolisis tidak relevan dengan konsentrasi pestisida yang sebenarnya, hal ini terlihat dari korelasi kurang baik. Meskipun secara teoritis, pH optimum OPH pada kisaran 7,5-9, namun pembentukan ion dari pestisida terhidrolisa juga tergantung pada pH. Hidrolisis organofosfat oleh OPH ini menghasilkan asam lemah, sehingga ionisasi sangat dipengaruhi oleh pH pada pH> pKa. Hal ini belum pasti nilai-nilai pKa pestisida dihidrolisis tetapi itu tergantung pada jenis pestisida.Kinerja OPH pada pH 8,5 sampai 9,5 diperkirakan sama, tetapi jumlah atau jenis pestisida dihidrolisis muatan ion yang berbeda. Dalam penelitian ini, diazinon ini sebagai larutan uji. Struktur Diazinon lebih rumit dari pada pestisida organofosfat lainnya, dan menghasilkan dua senyawa sederhana yang mungkin untuk ionisasi sempurna pada pH yang berbeda. Kemungkinan lain, jumlah maksimum ion terbentuk pada pH 9, tapi itu tidak sesuai dengan ukuran pori-pori yang dapat dilalui oleh ion, sehingga probabilitas menjadi tidak merata. Kinerja biosensor ini seperti biosensor dengan membran kitosan yang memiliki kinerja optimal pada pH 9. Hal ini dimungkinkan ada sedikit perbedaan dalam jenis imobilisasi. Selain itu pori-pori kitosan memiliki ukuran yang berbeda dengan pori-pori BSA.

Response TimeWaktu respon didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan oleh perangkat untuk berinteraksi dengan sampel yang akan menghasilkan sinyal yang dapat dibaca. Waktu respon biosensor hanya beberapa detik, karena jika terlalu lama akan memungkinkan pelepasan bioaktif diamobilisasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu respon dipengaruhi oleh konsentrasi pestisida, Gambar 2. Pada tahap ini, konsentrasi larutan pestisida 0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7, dan 1 ppm, sesuai dengan berbagai konsentrasi yang dapat memberikan hubungan linier terhadap sinyal.

Pada Gambar 2, dapat dilihat bahwa waktu respon lebih cepat dicapai pada konsentrasi yang lebih tinggi dari pestisida. Itu menunjukkan laju reaksi pestisida berbanding lurus dengan konsentrasi [12]. Dari data ini dapat dilihat bahwa berbagai konsentrasi pestisida yang dapat diukur dengan biosensor kurang dari Km [13]. Hal ini penting karena sebuah biosensor analitis akan memiliki sensitivitas yang baik jika kisaran konsentrasi yang dapat diukur lebih kecil dari Km. Menentukan waktu respon yang tepat dari Gambar 1 sangat sulit karena sinyal untuk semua konsentrasi cenderung naik dari waktu ke waktu. Oleh karena itu, persamaan regresi dilakukan di semua waktu pengukuran, Tabel 3.Pengukuran waktu adalah efek pada kepekaan biosensor meskipun semua data menunjukkan sensitivitas yang baik dan koefisien korelasi yang baik, ada kecenderungan peningkatan sensitivitas. Dalam pengukuran sensitivitas biosensor 45 dan 60 detik tidak berbeda secara signifikan. Dengan demikian dapat digunakan waktu respon 45 detik. Para peneliti merekomendasikan bahwa pengukuran sampai 15 detik dapat dilakukan, tetapi pada kondisi waktu pengukuran adalah sama untuk semua sampel, ini bisa dilakukan untuk memperpanjang umur biosensor.Dari hasil karakterisasi, dapat disimpulkan bahwa biosensor dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi pestisida organofosfat di kisaran 0 hingga 1 ppm. Kisaran konsentrasi lebih kecil dari Km, sehingga sudah memenuhi syarat analitis. Kinerja optimal dari biosensor dihasilkan jika sampel dilarutkan dalam larutan penyangga Tris-HCl pada pH 8,5 dan pengukuran dilakukan pada 45 detik.Biosensor PerformanceKinerja biosensor ditunjukkan dengan batas deteksi analitis dan sensitivitas. Persamaan regresi terbuat dari rata-rata Data pengulangan. Persamaan regresinya adalah y = 28.04x + 75,85, sehingga diperoleh sensitivitas biosensor adalah 28,04 ps / ppm. Secara statistik ditentukan juga batas deteksi 0,18 ppm. Ini berarti bahwa biosensor dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi pestisida lebih besar dari 0,18 ppm. Menurut peraturan pemerintah, batas maksimum residu pestisida pada padi sebesar 0,1 ppm dan 0,5 ppm untuk sayuran. Dengan demikian pestisida biosensor dapat diterapkan hanya untuk mengukur residu pestisida pada sayuran. Oleh karena itu, biosensor yang belum disempurnakan untuk mendapatkan batas deteksi yang lebih rendah kurang dari 0,1 ppm.Penelitian ini juga aplikasi untuk sampel nyata, tingkat diukur dari residu pestisida dalam sayuran, seperti selada, kubis, dan bayam. Namun, karena jumlah setiap sampel sayuran cukup tidak mewakili sehingga hasil ini tidak bisa dihubungi. Melalui laporan ini hanya menginformasikan bahwa mengembangkan biosensor yang dapat diterapkan untuk menentukan tingkat residu pestisida dalam sayuran. Untuk pengembangan lebih lanjut diperlukan biosensor lebih pengujian sampel produk baik buah dan sayuran pertanianConclusion Dari hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa biosensor optimum dihasilkan pada 105 (g OPH ukuran SPCE 1 5 mm2. Kinerja optimal dari biosensor dihasilkan pada pH 8,5 dengan mengukur waktu respon 45 detik. Dalam kondisi optimal sensitivitas biosensor adalah 28,04 (S/ppm dengan limit deteksi 0,18 ppm. Untuk mendapatkan biosensor yang dapat diproduksi secara massal perlu beberapa pengembangan baik dari segi sel konduktivitas dan instrumen.

References[1] Alegantina, S., Raini, M. and Lastari, P. (2005) Penelitian Kandungan Organofosfat Dalam Tomat Dan Slada Yang Beredar Di Beberapa Jenis Pasar Di DKI. Ministry of Health Republic of Indonesia, Jakarta.

[2] Ministry of Health and Agriculture Ministry Republic of Indonesia (1996) Batas Maksimum Residu Pestisida Pada Hasil Pertanian, Jakarta.

[3] Schulze, H., Scherbaum, E., Anastassiades, M., Vorlova, S., Schmiddan R.D. and Bachmann, T.T. (2002) Development, Validation, and Application of An Acetylcholinesterase-Biosensor Test for the Direct Detection of Insecticide Residues in Infant Food. University of Stuttgart, Stuttgart.

[4] Garcia, M.N.V. and Mottram, T. (2003) Biosensor Technology Addressing Agricultural Problems. Biosystems Engineering, 84, 1-12. http://dx.doi.org/10.1016/S1537-5110(02)00236-2

[5] Pohanka, M., Jun, D. and Kuca, K. (2008) Amperometric Biosensors for Real Time Assays of Organophosphates.Sensors, 8, 5303-5312. http://dx.doi.org/10.3390/s8095303

[6] Lee, J.H., Park, J.Y., Min, K., Cha, H.J., Choi, S.S. and Yoo, Y.J. (2010) A Novel Organophosphorus Hydrolase-Based Biosensor Using Mesoporous Carbons and Carbon Black for the Detection of Organophosphate Nerve Agents. Biosensors and Bioelectronics, 25, 1566-1570. http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2009.10.013

[7] Chouteau, C., Dzyadevych, S., Chovelon, J.M. and Durrieu, C. (2004) Development of Novel Conductometric Biosensors Based on Immobilised Whole Cell Chlorella Vulgaris Microalgae. Biosensors and Bioelectronics, 19, 1089-1096. http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2003.10.012

[8] Jaffrezic-Renault, N. and Dzyadevych, S.V. (2008) Conductometric Microbiosensors for Environmental Monitoring,

Sensors, 8, 2569-2588. http://dx.doi.org/10.3390/s8042569

[9] Gan, N., Yang, X., Xie, D., Wu, Y. and Wen, W. (2010) A Disposable Organophosphorus Pesticides Enzyme Biosensor Based on Magnetic Composite Nano-Particles Modified Screen Printed Carbon Electrode. Sensors, 10, 625-638.

http://dx.doi.org/10.3390/s100100625

[10] Mulyasuryani, A. and Srihardyastutie, A. (2011) Conductimetric Biosensor for the Detection of Uric Acid by Immobilization Uricase on Nata de Coco MembranePt Electrode. Analytical Chemistry Insight, 6, 47-51.

http://dx.doi.org/10.4137/ACI.S7346

[11] Jaffrezic-Renault, N. (2001) New Trends in Biosensors for Organophosphorus Pesticides. Sensors, 1, 60-74.

http://dx.doi.org/10.3390/s10100060

[12] Egins, B.R. (2002) Chemical Sensors and Biosensors. John Wiley & Sons, LTD, Singapore.

[13] Wang, J. (2001) Analytical Electrochemistry. 2nd Edition, VCH Publisher, Inc., New York, 133-160.