Ekspresi gen Ubiquitin Microsporum canis dan Trichophyton mentagrophytes Cultured dengan flukonazol

AbstrakEkspresi gen ubiquitin (Ub) dalam dermatofit diperiksa untuk hubungannya dengan perlawanan terhadap anti jamur obat flukonazol. Urutan nukleotida dan disimpulkan asam amino urutan gen Ub dalam Microsporum canis yang terbukti menjadi 99% mirip dengan gen Ub di Trichophyton mentagrophytes. Ekspresi mRNA UB M. canis dan T. mentagrophytes yang ditingkatkan ketika jamur yang berbudaya dengan flukonazol. Aktivitas anti jamur flukonazol terhadap dermatofit ini meningkat hadapan Ub proteasome inhibitor.

Degradasi protein selektif dalam sel-sel eukariotik terutama dilakukan oleh sistem ubiquitin (Ub). UB adalah sangat dilestarikan 76-residu protein yang didistribusikan di sel-sel eukariotik dan dikaitkan dengan berbagai macam protein. Sistem Ub memainkan peran penting dalam banyak fungsi selular, termasuk kontrol siklus sel, transduksi sinyal, transcriptional peraturan, proses nuklir transportasi, reseptor kontrol oleh endositosis, dll.

Beberapa Ubs telah diidentifikasi dalam jamur dan menganalisis fungsi biologi sel. Saccharomyces cerevisiae Ub gen, bernama UBI1, UBI2, UBI3, dan UBI4 yang menyatakan kondisi stres termasuk stres panas dan kelaparan. Aspergillus nidulans Ubs sangat diungkapkan dalam kehadiran obat-obatan anti jamur seperti Amfoterisin B dan miconazole. Oleh karena itu, kami mengeluarkan hipotesis bahwa Ubs jamur yang mungkin berhubungan dengan resistensi terhadap obat-obatan anti jamur.

Dermatophytoses adalah dermatofit infeksi di jaringan keratinized, yaitu epidermis, rambut, dan kuku. Dalam studi sebelumnya, gen Ub dari Trichophyton mentagrophytes, anamorph Arthroderma benhamiae, yang sering menyebabkan infeksi manusia dan hewan, kloning. Gen Ub dermatofit ini dikodekan dua mengulangi Ub.

Microsporum canis infeksi paling umum di anjing dan kucing, dan hewan-hewan ini kadang-kadang dapat menularkan penyakit ke manusia. Dengan demikian, M. canis dan T. mentagrophytes infeksi pada manusia dan hewan paling sering diperlakukandengan obat anti jamur.

Dalam penelitian ini, kami telah mengambil pendekatan genetik untuk mengulangi Ub dua M. canis dan T. mentagrophytes dalam hubungannya dengan peran yang mungkin dalam perlawanan terhadap obat-obatan anti jamur.

Bahan dan metode

Strain. Strain standar Arthroderma otae, (2) perkawinan jenis, VUT-77055, teleomorph M. canis dan standar strain Arthroderma benhamiae, jenis kawin, VUT-77011 (RV 26678) (1), salah satu teleomorphs T. mentagrophytes, yang digunakan dalam penelitian ini.

Persiapan cDNA.Mycelial sampel diperoleh dengan mengkultur dermatofit dalam Sabouraud dengan koloni berwarna 's dekstrosa kaldu pada 27° C selama 7 hari. Mycelia dikumpulkan oleh sentrifugasi 15.000 3 g selama 5 menit, dan kemudian mereka homogen dalam nitrogen cair. Total RNA diekstraksi dari 500-mg sampel dengan RNeasy total RNA kit (QIAGEN, Valencia, California). Membalikkan transkripsi (RT) Poli (A) 1 RNA dilakukan dengan Omniscript transkriptase kit (QIAGEN).

Kloning M. canis Ub gen.PCR primers disusun berdasarkan urutan dari T. mentagrophytes. Urutan primer yang digunakan untuk amplifikasi M. canis Ub yang 59-ATGCAAATCTTCGTGAAAAC-39 (primer UB1S; nukleotida [PB] 162 untuk 181 di T. mentagrophytes Ub, GenBank penaikan no. AB025792) dan 59-CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-39 [primer poly(dT)]. Dengan ini primers, fragmen 740-bp yang mengandung urutan pengkodean Ub diharapkan akan diperkuat. CDNA ini diperkuat oleh PCR dalam campuran reaksi (30 ml) mengandung 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, gelatin 0.001%, 200 mM konsentrasi setiap trifosfat deoxynucleoside, 1.0 polimerase U Taq (Takara, Kyoto, Jepang) dan 0,5 mg dari sepasang primer. PCR amplifikasi dilaksanakan untuk 35 siklus terdiri dari template denaturasi (1 menit pada 94° C), pelunakan primer (2 menit di 55° C) dan polimerisasi (2 menit pada 72° C). Kira-kira 740-bp PCR produk dianalisis oleh Elektroforesis dalam gel agarose 2% dan kemudian langsung kloning ke vektor pCRII (Invitrogen, Carlsbad, California). Plasmid DNAs diekstraksi dengan QIAGEN plasmid kit, dan mereka telah diurutkan dengan metode penghentian jaringan dideoxy menggunakan ABI Prisma 310 genetik Analyzer (Perkin-Elmer, Foster City, California).

RT-PCR assay dari Ub disebabkan oleh flukonazol.Kami pertama ditentukan MIC flukonazol terhadap M. canis dan T. mentagrophytes dalam Sabouraud dengan koloni berwarna 's dekstrosa kaldu. Sampel mycelial M. canis dan T. mentagrophytes yang berbudaya dalam Sabouraud dengan koloni berwarna 's dekstrosa kaldu yang mengandung 20 mg flukonazol (Diflucan untuk injection; Pfizer, Tokyo, Jepang) per ml. Ketika ini dermatofit yang berbudaya dalam medium yang mengandung lebih dari 20 mg flukonazol setiap ml, pertumbuhan jamur dihambat. Oleh karena itu, jumlah RNA diekstrak itu tidak cukup untuk penyelidikan oleh assay RT-PCR.

Setelah 5 hari budaya di 27° C, mycelia dikumpulkan oleh sentrifugasi di bawah kondisi diatas dan homogen dalam nitrogen cair. RT Poli (A) RNA dilakukan dengan Omniscript transkriptase kit (QIAGEN).

Sampel cDNA (100 ng) yang diperkuat oleh RT-PCR dengan UB1S dan poly(dT) primers. CDNA ini diperkuat oleh PCR dalam campuran reaksi (30 ml) mengandung 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, gelatin 0.001%, 200 mM konsentrasi trifosfat

deoxynucleoside masing-masing, polimerase U Taq 1.0 (Takara), dan 0,5 mg pair primer. PCR amplifikasi dilaksanakan untuk siklus 24, 27, dan 30 yang terdiri dari template denaturasi (1 menit pada 94° C), primer pelunakan (2 menit di 55° C), dan polimerisasi (2 menit pada 72° C).

Sebagai kontrol untuk ekspresi gen, mRNA A. benhamiae kitin sintase 1 (CHS1) gen ditentukan. Urutan-urutan primer yang digunakan untuk memperkuat A. benhamiaeCHS1 adalah 59-kucing CGA GTA CAT GTG CTC GC-39 (primer CHS1 Uni1S; nt 943 untuk 960 di A. benhamiae CHS1) dan 59-CTC GAG GTC AAA AGC ACG CC-39 (primer CHS1 Uni1R; nt 1368-1387 di A. benhamiae CHS1). Dengan ini primers, 410-bp fragmen yang mengandung urutan A. benhamiae gen CHS1 pengkodean diharapkan akan diperkuat.

PCR amplifikasi dilaksanakan untuk siklus 30 terdiri dari template denaturasi (1 menit pada 94° C), pelunakan primer (2 menit pada 63° C) dan polimerisasi (3 menit pada 72° C). PCR produk dianalisis oleh Elektroforesis dalam gel agarose 2%, diwarnai dengan ethidium bromida, dan divisualisasikan dengan sinar UV.

Budaya dengan inhibitor flukonazol dan proteasome. M. canis VUT-77055 dan T. mentagrophytes VUT-77011 berbudaya pada diencerkan Sabouraud dengan koloni berwarna 's dekstrosa agar (SDA) (2% glukosa, neopeptone 1%, 1% MgSO4 z 7H2O, 1% KH2PO4, dan 2% agar-agar) (9) selama 1 minggu di 24° C. M. canis dan T. mentagrophytes dipanen dari diencerkan SDA dan jamur setiap diskors dalam 500 ml air terionisasi steril. Sel (microconidia, arthroconidia, dan hyphae) mengaduk dan disentrifugasi pada 300 3 g untuk 3 menit. Sel-sel itu resuspended dalam air dan disebutkan oleh count mikroskopis langsung

Sekitar 1000 sel/10 ml M. canis atau T. mentagrophytes adalah diinokulasi ke pusat (spot diameter, 4 mm) piring (diameter, 3 cm) yang berisi SDA diencerkan dan SDA dengan flukonazol (20 mg/ml) dan/atau b-laktone (1 mM) (Ub proteasome inhibitor; MBL, Aichi, Jepang) (3). Karena 1 mM b-laktone inhibitor efektif untuk sel mamalia, b-laktone digunakan pada konsentrasi ini (3). Tiga piring dari setiap inoculum yang dibudidayakan selama 5 hari pada 27° C, dan kemudian diameter koloni jamur diukur. Rata-rata diameter koloni-koloni di SDA diencerkan dengan flukonazol sendiri dan pada media dengan flukonazol dan/atau b-laktone dianalisis oleh siswa dipasangkan dua-ekor t tes.

Nukleotida urutan nomor induk. Urutan untuk M. canis Ub dilaporkan dalam makalah ini telah disimpan dalam database GenBank di bawah aksesi tidak. AB035543.

HasilM. canis Ub gen. Menggunakan M. canis cDNA sebagai template, kami terisolasi M. canis Ub gen dengan PCR amplifikasi dengan primers UB1S dan poly(dT). Elektroforesis PCR produk memberikan sebuah band DNA tunggal dengan ukuran diharapkan dari kira-kira 740 bp. Setelah fragmen DNA ini adalah kloning ke pCRII plasmid vektor, urutan nukleotida klon cDNA PCRamplified [Ub1S-poly(dT)] diturunkan menjadi 740 bp dan ditampilkan lebih besar dari 99% kesamaan dengan T. mentagrophytes Ub gen. Nukleotida dan disimpulkan asam amino urutan M. canis Ub gen juga dikodekan dua Ub berulang dalam bp 1 untuk 460 (Fig. 1), sama seperti orang-orang dari T. mentagrophytes

Urutan asam amino yang disimpulkan M. canis Ub adalah identik dalam urutan yang T. mentagrophytes (GenBank penaikan no. AB025792)

UB mRNA disebabkan oleh flukonazol. Setelah siklus 27 amplifikasi oleh RT-PCR, Ub mRNA adalah terdeteksi di M. canis dan T. mentagrophytes apabila dikultur dengan flukonazol bukan tanpa flukonazol (Fig. 2 dan 3), menyatakan bahwa flukonazol mungkin merangsang ekspresi Ub mRNA di dermatofit.

Efek pada pertumbuhan sel jamur inhibitor flukonazol dan proteasome. Diameter berarti koloni M. canis dan T. mentagrophytes berbudaya pada SDA diencerkan sendiri atau dengan flukonazol dan/atau b-laktone yang dihitung (gambar 4 dan 5). Diameter berarti koloni-koloni M. canis diencerkan SDA dan SDA diencerkan dengan b-laktone (1 mM) yang 2.4 dan 2,5 cm, masing-masing. Diameter berarti koloni-koloni mentagrophytes T. diencerkan SDA dan SDA diencerkan dengan b-laktone (1 mM) yang 2.4 dan 2.3 cm, masing-masing.

Diameter berarti koloni koloni M. canis dan T.mentagrophytes pada SDA dengan flukonazol (20 mg/ml) yang 1.7 dan 1,5 cm, masing-masing. Diameter berarti jamur dua media dengan flukonazol (20 mg/ml) dan b-laktone (1 mM) yang 1.1 dan 1,2 cm, masing-masing. Analisis Statistik diameter berarti koloni di SDA diencerkan dengan flukonazol dan flukonazol dan b-laktone mengungkapkan perbedaan yang signifikan antara kelompok-kelompok (P, 0.01). Hasil ini menyarankan bahwa Ub proteasome inhibitor mungkin meningkatkan aktivitas anti jamur flukonazol terhadap M. canis dan T. mentagrophytes.