Dna Squencing

download Dna Squencing

of 18

Transcript of Dna Squencing

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    1/18

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    2/18

    Informasi genetik pada suatu makhluk hiduptersimpan pada DNA-nya Secara molekuler, pengertian dari sebuah molekulDNA berasal dari penentuan sekuen nukeotida.Fungsi dari sebuah gen sering dapat ditentukanberdasarkan sekuen nukeotida, misalnya dengan caramembandingkan sekuens nukeotida dengan gen yangtelah diketahui fungsinya. Untuk mengetahui informasi genetik tersebutdigunakan teknik DNA Sequencing, yaitu metodeyang digunakan untuk menentukan urutan basa

    nukleotida (adenine, guanine, cytosine dan thymine)pada molekul DNA Miliaran basa nukleotida DNA dapat ditentukanurutannya dalam sekali run saja.

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    3/18

    DNA sequencing menggunakan metode PCR(Polymerase Chain Reaction) sebagaipijakannya.

    DNA yang akan ditentukan urutan basaACGT-nya dijadikan sebagai cetakan(template) untuk kemudian diamplifikasimenggunakan enzim dan bahan-bahan yang

    mirip dengan reaksi PCR, namun ada Penambahan beberapa pereaksi tertentu.

    Proses ini dinamakan cycle sequencing

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    4/18

    Berikut adalah hal membedakan cyclesequencingdengan PCR biasa adalah:

    Primer yang digunakan hanya satu untuk satu

    arah pembacaan, tidak dua (sepasang) sepertiPCR

    ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate)adalah modifikasi dari dNTPs denganmenghilangkan gugus 3-OH pada ribosa

    http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2009/08/dntp-ddntp.jpg
  • 7/30/2019 Dna Squencing

    5/18

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    6/18

    Metode yang pertama kali dikembangkanoleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitudengan melakukan reaksi cycle sequencingpada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yangdibutuhkan.

    Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkanhanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yangditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, Cjika ddCTP dan T jika ddTTP.

    http://en.wikipedia.org/wiki/Frederick_Sangerhttp://en.wikipedia.org/wiki/Frederick_Sangerhttp://en.wikipedia.org/wiki/Frederick_Sanger
  • 7/30/2019 Dna Squencing

    7/18

    Setelah reaksi cycle sequencing selesai,keempat hasil reaksi tersebut dilarikan padagel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah.

    Urutan basa DNA dapat ditentukan denganmengurutkan fragmen yang muncul dimulaidari yang paling bawah (paling pendek).

    Fragmen DNA dapat divisualisasi karenaprimer yang digunakan dilabel denganradioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain,bukan primer yang dilabel melainkan dNTP.

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    8/18

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    9/18

    Agar proses pemisahan fragmen pada gelelectrophoresisbisa digabung dalam 1 lajursaja, digunakanlah pelabel fluorescentdengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi

    cycle sequencing.

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    10/18

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    11/18

    Dengan teknik ini visualisasi dan penentuanurutan basa dapat dilakukan dengan lebihmudah karena keempat reaksi dipisahkandalam satu lajur electrophoresis dengan 4

    warna berbeda. Coba bandingkan cara inidengan cara sebelumnya, lebih mudah manamembacanya?

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    12/18

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    13/18

    Cara yang lebih simple akhirnya ditemukanjuga. Para ilmuwan cerdas menemukan carauntuk melabel ddNTP dengan 4 labelfluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP,

    ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian,reaksi cycle sequencing dapat dilakukandalam 1 tabung reaksi dan di run pada satulajur gel electrophoresis saja. Sangat simpledan cepat.

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    14/18

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    15/18

    Dengan ditemukannya mesin AutomatedCapillary Sequencer, proses pemisahanfragmen dan pembacaan urutan basa DNAdapat dilakukan dengan lebih simple, cepatdan terotomatisasi.

    Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi,mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapilerdalam satu mesin, semakin banyak jumlahkapiler, semakin banyak pula jumlahsampel DNA yang bisa ditentukan urutanbasanya.

    Hasil pembacaan mesin sequencer disebutelectropherogram, yaitu peak-peakberwarna yang menunjukkan urutan basaDNA-nya.

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    16/18

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    17/18

    Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragmentanalysis saat ini tidak hanya digunakan untukmenentukan urutan basa-basa DNA semata, Tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi,seperti : Penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), Analisa keragaman genetik seperti DNAMicrosatellite dan AFLP (Amplified FragmentLength Polymorphism), Community analysis seperti tRFLP (Terminal

    Restriction Fragment Length Polymorphism) dansegudang aplikasi lainnya

  • 7/30/2019 Dna Squencing

    18/18