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Año 8. Número 44 • Enero-Febrero 2017 • www.labinlab.com

Dr. Daniel Vargas Ramírez

Dengue, Chikungunya y Zika: diagnóstico molecular

mediante RT-PCR múltiple.

Virus transmitidos por artrópodos

Los virus transmitidos por artrópo-dos (arbovirus) representan uno de

los problemas de salud pública más importantes en las regiones tropicales y subtropicales alrededor del mundo. Los virus Chikungunya y Zika, recien-temente introducidos en las Américas, así como el virus del Dengue, son actualmente los arbovirus más pre-valentes en el continente americano. Estos se caracterizan por presentar vectores en común, los mosquitos Ae-

des aegypti y Aedes albopictus, por lo que no es de extrañar que ocurra una co-circulación de estos virus e incluso puedan presentarse infecciones simul-táneas con dos o tres arbovirus.1 Los pacientes afectados por estas in-fecciones virales presentan manifesta-ciones clínicas similares (Cuadro 1); sin embargo el manejo clínico y las posi-bles consecuencias son diferentes, por lo que se requiere de una identifica-ción temprana y precisa del virus cau-sante. Mediante la técnica de PCR en Tiempo Real (RT-PCR) múltiple para la detección simultánea de estos tres virus es posible realizar el diagnóstico temprano y diferencial de estas tres enfermedades.1

El Dengue es la virosis humana trans-mitida por artrópodos más importante, cuyo agente causal es un virus perte-neciente a la familia Flaviviridae. En

Costa Rica, para 2016, se reportaron 20456 casos de Dengue hasta la se-mana epidemiológica 44, con una tasa de incidencia de aproximadamente 420 casos por cada 100000 habitantes, siendo esta la enfermedad transmitida por artrópodos más importante en el país en términos de morbilidad y mor-talidad.3,4,5 Esta es una enfermedad febril exantemática con progresión y presentación clínica variable, que pue-de cursar de manera asintomática o sintomática en el caso de la fiebre del dengue y el dengue grave.3

La fiebre de Chikungunya es, a su vez, una enfermedad causada por un virus miembro de la familia Togaviridae, la cual se caracteriza por una fiebre sú-bita acompañada de erupciones cutá-neas y dolores articulares. La mayoría

de los pacientes se recuperan com-pletamente, aunque en ocasiones los dolores en las articulaciones pueden durar de meses a años.6 En Costa Rica, se reportaron un total de 3215 casos de Chikungunya entre la sema-na epidemiológica 1 y 44 del año 2016, con una tasa de incidencia de aproxi-madamente 66 casos por cada 100000 habitantes.4

La fiebre del Zika es generada por un virus que se clasifica dentro de la familia Flaviviridae y se caracteri-za clínicamente por la presencia de fiebre, exantema y conjuntivitis no purulenta. Los síntomas son autolimi-tados y la mayoría de los pacientes son asintomáticos; sin embargo, su asociación con microcefalia y el sín-drome de Guillain-Barré es preocu-

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Dengue, Chikungunya y Zika: diagnóstico molecular mediante RT-PCR múltiple.

Detección de mutaciones de riesgo trombótico

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pante para las autoridades sanitarias de los países con transmisión activa.2 Además de la transmisión a través de vectores artrópodos, se ha confirma-do la transmisión sexual y la transmi-sión intrauterina.7 En Costa Rica, se reportaron 1453 casos de Zika entre la semana 1 y 44 de 2016, siendo esta la que, de las tres virosis menciona-das, presentó un menor número de casos en este período. En este mis-mo período se confirmaron 2 casos de síndromes neurológicos y 1 caso de microcefalia asociados a Zika.4

Diagnóstico de LaboratorioTradicionalmente se han detectado anticuerpos (IgG, IgM) para el diag-nóstico de laboratorio de estas tres virosis. Los anticuerpos IgM contra el virus pueden ser detectables lue-go de 4 días después del inicio de la sintomatología. Sin embargo, el suero recolectado dentro de los primeros 7 días de la aparición de los síntomas podría no tener anticuerpos IgM es-pecíficos de virus en niveles detecta-bles. Además, los anticuerpos contra el virus Zika, los virus del dengue y otros flavivirus (por ejemplo, la fiebre amarilla y el virus del Nilo Occidental) tienen una fuerte reactividad cruza-da, posiblemente generando resulta-dos positivos falsos en las pruebas serológicas, por lo que se dificulta el diagnóstico diferencial de estas en-fermedades mediante pruebas sero-lógicas.2,8

El Centro para el control y prevención de enfermedades (CDC) recomienda hacer hincapié en la evaluación mo-lecular, por lo que la detección del genoma viral mediante RT-PCR es la prueba de elección durante las eta-pas agudas de estas enfermedades.La muestra de suero para realizar esta prueba se debe recolectar du-rante los días 0 a 7 a partir del inicio

de los síntomas, por lo que permite el diagnóstico temprano de la enfer-medad y evita la toma de muestras pareadas para la confirmación del diagnóstico.2,3,8 Solamente para el virus Zika está autorizado el uso de una muestra de orina, incluso hasta menos de 14 días luego de la apari-ción de los síntomas, para la detec-ción del ARN viral mediante RT-PCR.9 El diagnóstico temprano y diferencial de estas virosis es de gran importan-cia para ofrecer un control y trata-miento oportuno, especialmente en embarazadas, debido a la asociación entre la infección por el virus Zika y la presencia de resultados adversos del embarazo y de perjuicios en el feto. Adicionalmente, el diagnóstico permi-te que las personas infectadas por el virus Zika tomen las medidas necesa-rias para evitar la transmisión sexual.7

RT-PCR múltiple para el dengue, Chikungunya y ZikaLa RT-PCR múltiple para los virus del Dengue, Chikungunya y Zika es una innovadora prueba permite la detec-ción cualitativa del genoma viral a partir de muestras de suero, plasma e incluso de orina durante la fase aguda de la infección.10 En LABIN Laborato-rios se realiza esta prueba utilizando la plataforma ELITe InGeniusTM, un sistema de diagnóstico molecular que realiza de manera automatizada las tareas de extracción y purificación de ácidos nucleicos, amplificación y detección del ácido nucleico extraído por RT-PCR y análisis de resultados.11Con el objetivo de ofrecer una detec-ción temprana, eficaz y simultánea de los virus del dengue, Chikungunya y Zika, en LABIN Laboratorios se ofre-ce la prueba de RT-PCR múltiple de la casa comercial Fast-track Diagnos-tics®. Esta prueba ha sido sometida satisfactoriamente a ensayos de va-lidación y ensayos clínicos que per-

miten asegurar la confiabilidad de la prueba para el diagnóstico de estas enfermedades virales. Para asegurar la especificidad de la prueba, mues-tras negativas de plasma, muestras negativas de orina y muestras clínicas con diferentes patógenos fueron eva-luadas durante los ensayos de valida-ción. Ningún otro patógeno generó un resultado positivo al implementar esta prueba, obteniendo una especifi-cidad del 100%. También se evaluó la sensibilidad analítica y se determinó que la técnica permite detectar in-cluso trazas virales en las muestras, observando límites de detección de aproximadamente 1000 copias vira-les/mL.10

Referencias:1 Calvo EP, Sánchez-Quete F, Duran S, Sandoval I, Castellanos JE. Easy and inexpensive molecular detection of dengue, chikungunya and zika viruses in febrile patients. Acta Trop, 2016; 163: 32-37.

2. Beltrán-Silva SL, Chacón-Hernández SS, Moreno-Palacios E, Pereyra-Molina JA. Clinical and differential diagnosis: Dengue, chikungunya and Zika. Rev Med Hosp Gen Méx, 2016. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.hgmx.2016.09.011

3. Organización Panamericana de Salud, Organización Mundial de la Salud. Dengue: Guías para la atención de enfermos en la región de las Américas. Segunda edición. Washington D.C. 2015. Disponible en: http://iris.paho.org/xmlui/handle/123456789/28232

4. Ministerio de Salud de Costa Rica. Boletín epidemiológico N° 38 – 2016: Zika, Chukungunya y Dengue. San José. 2016. Disponible en: http://www.ministeriodesalud.go.cr/index.php/vigilancia-de-la-salud/analisis-de-situacion-de-salud?limit=20&limitstart=0

5. Calderón-Arguedas O, Avendaño A, López-Sanchez W, Troyo A. Expansion of Aedes albopictus skull in Costa Rica. Rev Ibero-Latinoam Parasitol, 2010; 69: 220-222.

6. World Health Organization. Chikungunya: Notas descriptivas. Disponible en: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs327/es/

7. Oduyebo T. Update: interim guidelines for health care providerscaring for pregnant women and women of reproductive age with possible Zika virus exposure United States, 2016. MMWR, 2016; 65: 122-127.

8. CDC. Memorandum: Updated diagnostic testing for Zika, chikungunya, and dengue viruses in US Public Health Laboratories. 2016. Disponible en: https://www.aphl.org/Materials/CDCMemo_Zika_Chik_Deng_Testing_011916.pdf

9. Villanueva JM, Powers AM. Zika Diagnostic Tools, Testing Algorithms, and Interpretation Guidance: ZAP Summit Follow-up Teleconference. CDC. 2016. Disponible en: https://www.cdc.gov/zika/pdfs/zap_webinar_lab_06062016.pdf

10. Fast-track DIAGNOSTICS. FTD Zika/Dengue/Chik. 2016. Disponible en: http://www.fast-trackdiagnostics.com/products/ftd-zikadenguechik/

11. ELITech. Producto: ELITe InGenius™. 2016. Disponible en: http://www.elitechgroup.com/product/elite-ingenius/

Dr. Daniel Vargas

Ramírez, M.Q.C.

Regente de la sucursal de

LABIN Barreal de Heredia

Cuadro 1. Comparación clínica de Dengue, Chikungunya y Zika.2

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Dra. Marycruz Sandí Gamboa

Detección de mutaciones de riesgo trombótico

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte a

nivel mundial. En el 2015 murieron por este motivo 17,5 millones de personas,1 siendo la trombosis venosa (TV) es una de las principales manifestaciones. Exis-ten factores genéticos y adquiridos que, en conjunto, predisponen a la aparición de eventos trombóticos.2 Dentro de los factores genéticos destacan las muta-ciones en los siguientes factores:

Factor V (FV): Sobresalen la 1691 G>A (Factor V Leiden) y la H1299R (HR2). Estas son responsables de aproxima-damente un 60% de las TV. El riesgo trombótico para un FV Leiden homoci-goto es 11 veces mayor que para uno heterocigoto y hasta 80 veces mayor que para un individuo con FV normal.2

El HR2 por sí solo provoca un riesgo dos a tres veces mayor de provocar trom-boembolismo venoso.3

Factor II: La principal es la G20210A. Quienes presentan esta alteración en combinación con mutaciones en el gen del FV, tienen 2 veces más riesgo de presentar enfermedades tromboembóli-cas venosas de manera recurrente, en comparación con quienes portan única-mente mutaciones en el FV Leiden.2

Enzima Metilentetrahidrofolato reduc-tasa: La MTHFR 677C>T y 1298A>C son los más frecuentes. La presencia

de ambas mutaciones se asocia con un aumento en el riesgo de eventos trom-bóticos; incluso en algunos pacientes con trombosis se ha determinado la co-existencia de estos polimorfismos como único factor genético asociado. Además el polimorfismo 677C>T incrementa de 2 a 8 veces el riesgo de trombosis cere-bral infantil.4

Inhibidor del activador de plasminógeno (PAI-1): Uno de los polimorfismos más estudiados es el 4G/5G, este confiere un riesgo 6 veces mayor de presentar TV. El alelo 4G además se asocia a pre-eclampsia severa, tromboembolis-mo pulmonar y trombosis arterial.5

Receptor endotelial de la proteína C (EPCR): La mutación A4600G (haploti-po A3) se asocia a un fuerte incremento en el receptor soluble, predisponiendo a eventos trombóticos.6 Por otro lado, también existen polimorfismos que se asocian a protección contra eventos trombóticos. De éstos, los más fre-cuentes son el V34L del Factor XIII y el G4678C del EPCR.7

En LABIN Laboratorios detectamos estas nueve variaciones genéticas, utili-zando el perfil CVD StripAssay ® T de la casa Vienna Lab, que incluye tres pa-sos: aislamiento del ADN, amplificación de las secuencias relevantes de los ge-nes y marcado con biotina y finalmente una hibridización selectiva con sondas de oligonucléotidos alelo-específicas.

Las secuencias biotiniladas unidas son detectadas mediante estreptavidina uni-da a fosfatasa alcalina y substratos de color. Esta técnica es altamente sensible y cuenta con controles que aseguran la correcta identificación de cada polimor-fismo, brindándole al médico y al pacien-te la posibilidad de tomar las medidas profilácticas y terapéuticas adecuadas.

Referencias:1. Organización Mundial de la Salud. New initiative launched to tackle cardiovascular disease, the world´s number one killer. Obtenida de http://www.who.int/cardiovascular_diseases/en/

2. Castañeda M, et al. Marcadores de trombosis en pacientes con trombofilia. Revista Cubana de Medicina, 2014; 53: 14-24.

3. López M, Salazar L, Porras J. Trombofilia Primaria: Mejoran-do el Diagnóstico Basado en Evidencia. Revista Costarricense de Cardiología, 2013; 15: 25-30.

4. Hoteit R, et al. Significance of the use of the ViennaLab “Cardiovascular Disease panel” (CVD) Assay as a reflex test for the “Factor V/II/MTHFR Assay”. Meta Gene, 2013; 1: 76-81.

5. Parra I, et al. Coexistencia de las mutaciones C677T y A1298C en la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa en pacientes pediátricos con trombosis. Boletín médico del Hospital Infantil de México, 2009; 66: 229-233.

6. Ozyurek E. Significance of factor V, Prothrombin, MTHFR, and PAI-1 genotypes in childhood cerebral thrombosis. Clin Appl Trhrom Hemost, 2007; 13: 154-160.

7. Balta G, Cigdem A, Aytemiz G. PAI-1 Gene 4G/5G Genotype: A Risk Factor for Thrombosis in Vessels of Internal Organs, American Journal of Hematology. 2002; 71: 89-93.

Dra. Marycruz Sandí

Gamboa

Regente de la sucursal de

LABIN Santa Ana

Cuadro 1. Heredabilidad de componentes de la hemostasia.

Andrea Ramírez

En LABIN Laboratorios nos caracte-rizamos no solamente por estar a

la vanguardia a nivel tecnológico sino también por brindar siempre una sa-tisfactoria experiencia de servicio al cliente y para esto desarrollamos re-uniones periódicas, contando con la presencia de la mayoría de nuestros profesionales Microbiólogos.

En nuestra última reunión, llevada a cabo a finales del mes de Noviembre, se impartió una charla de Ética por parte del Lic. José Fernández, Asesor Legal de LABIN, donde nos expone la importancia de analizar el impacto de cada toma de decisión en el proceso de atención, para aplicar la premisa de que nuestro conjunto de valores es el respaldo que nos permite llamarnos “Éticos”. Se desarrolló también una capacitación en el tema de Calidad, por parte de la Ing. Adriana Castri-llo, Gerente del departamento, quien presentó la Política de Calidad de la organización:

También se presentó el sistema “SFD” (Smart Flow for Docs), el cual es un pilar en el proceso de gestión docu-mental, de cara al proceso de Acredi-tación bajo la Norma INTE/ISO 15189.Nuestro Gerente General, Sr. Edwin de la Cruz, rindió un pequeño home-naje a su madre, invitada especial, la Dra. Donna de la Cruz, Microbióloga fundadora de LABIN Laboratorios, quién nos recordó cómo “siempre hay que trabajar en lo que sea necesario para el Cliente”. Ambos hicieron una reseña sobre los inicios de la empresa y los principales valores instaurados por el también fundador, don Enrique de la Cruz, Microbiólogo y académico ejemplar.

El Sr. Edwin de la Cruz presentó tam-bién una serie de temas, ejemplifica-dos con algunos videos, acerca de la importancia del Cliente Interno y la relevancia de su proceso de atención, en donde se generaron recomenda-ciones para favorecer y fortalecer las relaciones entre compañeros y jefes, con el trabajo en equipo como base fundamental en la empresa. El tema final se basó en la presentación del informe de gestión por parte de los directores de diferentes áreas del Laboratorio, tales como Hematolo-gía, Química, Inmunología, Bacterio-logía, y Biología Molecular, cerrando la presentación el Dr. Alberto Bonilla, Director Técnico, con el tema de au-tomatización de las fases Pre y Post

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Andrea Ramírez

Gerente de Capital Humano,

LABIN Laboratorios

La ciencia desde una óptica humana

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Equipo editor: Edwin de la Cruz Redmond • Dr. Alberto Bonilla Sequeira • Ruth Coto Grijalba

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analítica y con el análisis del proceso de mejora en los tiempos de respues-ta, así como el informe de estado de avance en los proyectos que se están desarrollando en el área técnica. La gestión de estos espacios de interac-ción entre los profesionales de LABIN son oportunidades valiosas que nos permiten seguir creciendo personal y profesionalmente y que seguiremos abriendo periódicamente.

LABIN Laboratorios se comprome-

te a ofrecer resultados confiables y un servicio de excelencia, con el

fin de satisfacer las necesidades del cliente a partir de las labores

del personal competente, la apli-

cación de técnicas innovadoras y

moderna tecnología.

Para ello se ha propuesto desarro-

llar un Sistema de Gestión de la

calidad para cumplir los requisitos

de la Norma INTE/ISO 15189:2014

que garantice la mejora continua

de la calidad de los servicios.

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“Selvamicin, an atypical antifungal polyene from two

alternative genomic contexts”

Referencia: Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 15;113(46):12940-12945. Epub 2016 Nov 1.