I. DASAR TEORI

Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun

1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, yang mana fase diamnya berupa lapisan

yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca,

plat aluminium atau plat plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan

bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik

(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun

(descending) (Rohman, 2007).

Kromatografi lapis tipis (disingkat KLT) atau dalam bahasa inggris disebut thin layer

chromatography (TLC) merupakan salah satu contoh kromatografi planar disamping

kromatografi kertas. Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fase diamnya dikemas

dalam kolom, maka pada kromatografi lapis tipis (TLC), fase diamnya adalah berupa lapisan

seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium,

atau pelat plastik (Rohman, 2007). Metode ini dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-

senyawa yang tidak volatil atau senyawa yang sifat volatilitasnya rendah, senyawa dengan

polaritas rendah hingga tinggi, bahkan untuk memisahkan senyawa-senyawa ionik (Hahn-

Deinstrop, 2007).

Fase gerak atau pelarut pengembang akan bergerak naik sepanjang fase diam karena

adanya gaya kapilaritas pada sistem pengembangan menaik (ascending). Pemilihan fase

gerak baik untuk TLC maupun HPTLC didasarkan pada keterpisahan senyawa-senyawa

dalam analit yang didasarkan pada nilai Rf atau hRf (100Rf). Nilai Rf diperoleh dari

membagi jarak pusat kromatografik dari titik awal dengan jarak pergerakan pelarut dari titik

awal. Penghitungan nilai hRf ditunjukkan dengan persamaan dibawah ini.

KLT digunakan secara luas untuk analisis solut-solut organik terutama dalam bidang

biokimia, farmasi, klinik dan forensik, baik untuk analisis kualitatif dengan cara

membandingkan nilai Rf solut dengan nilai Rf senyawa baku atau untuk analisis kualitatif.

Penggunaan KLT dapat berupa analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Pada analisis

kualitatif, KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT

yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika

mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Untuk meyakinkan

identifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan lebih dari 1 fase gerak dan jenis pereaksi

semprot (Rohman, 2007).

Untuk analisis kuantitatif pada KLT dapat digunakan dua cara. Pertama, bercak pada plat

KLT diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik

densitometri. Cara kedua adalah dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa

yang terdapat dalam bercak tersebut dengan metode analisis yang lain, misalkan dengan

metode spektrofotometri (Rohman, 2007).

Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT biasanya

dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT (atau secara in situ).

Densitometer dapat bekerja secara serapan atau flouresensi, dimana kebanyakan

densitometer mempunyai sumber cahaya yang diarahkan menuju monokromator (untuk

memilih rentang panjang gelombang yang cocok antara 200-800), sistem untuk

memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton, dan rekorder (Rohman, 2007).

Suatu campuran zat dapat dipisahkan dengan teknik KLT berdasarkan perbedaan afinitas

masing-masing komponen terhadap fase gerak dan fase diamnya. Komponen yang telah

terpisah, besar serapannya dapat diukur dengan spektrofotodensitometer. Kadar dari sampel

dapat ditentukan dari perbandingan antara serapan dan bakunya (Widjaja dan Laksmiani,

2010).

Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi

elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat. Radiasi

elektromagnetik yang datang pada plat diabsorpsi oleh analit, ditransmisi atau diteruskan jika

plat yang digunakan transparan. Radiasi elektromagnetik yang diabsorpsi oleh analit atau

indikator plat dapat diemisikan berupa flouresensi dan fosforesensi (Sherma and Fried 1994).

Pemadaman flouresensi indikator F-254 dapat terjadi akibat adanya noda pada plat sehingga

teramati di bawah lampu UV sebagai noda hitam (Mulja dan Sukarman, 1995).

Analisis KLT dengan menggunakan spektrofotodensitometri dapat dilakukan dengan

menggunakan mode absorbsi atau flouresensi. Pada umumnya yang paling sering digunakan

adalah mode absorbsi dengan menggunakan sinar UV pada λ 190-300 nm. Oleh karena

kebanyakan plat KLT menggunakan silika gel yang bersifat opaque (tidak tembus cahaya),

maka pengukuran dengan mode transmitan tidak cocok digunakan. Penentuan absorpsi analit

pada plat KLT opaque didasarkan pada rasio intensitas antara radiasi elektromagnetik yang

datang dengan intensitas radiasi elektromagnetik yang dipantulkan/direfleksikan. Pengukuran

flouresensi merupakan metode pengukuran langsung yang peka untuk senyawa dalam daerah

ultraviolet dapat ditentukan melalui emisi penyinaran sekunder. Intensitas cahaya flouresensi

setelah dipancarkan melalui suatu monokromator, diukur secara selektif dalam kondisi yang

sesuai, berbanding lurus dengan berat senyawa yang ada dalam noda (Sherma and Fried,

1994).

Densitometer dapat bekerja secara serapan atau flouresensi. Kebanyakan densitometer

mempunyai sumber cahaya monokromator (rentang panjang gelombang 190 s/d 800 nm)

untuk memilih panjang gelombang yang cocok, sistem untuk memfokuskan sinar pada

lempeng, pengganda foton, dan rekorder (Rohman, 2007). Output detektor dikonversikan

menjadi signal dan diamplifikasi. Sebagai tambahan untuk scanning instrumen densitometer

dilengkapi dengan digital konverter, dan data akan diproses secara digitalisasi oleh komputer.

Analis dapat bekerja dengan densitometri pada jangkauan panjang gelombang 190 s/d

800 nm. Terjadinya penyimpangan baseline yang disebabkan oleh variasi ketebalan dan

ketidakseragaman lapisan pada densitometer sangat kecil dan level signalnya relatif tinggi.

Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan TLC biasanya

dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng TLC (atau secara in situ).

.

Gambar 2. Skema instrumen spektrofotodensitometer

Keterangan: L (light); SL (slit); MC (monokromator); PM (photomultiplier); FF (filter

fluorescens); P (plat); SCS (sistem for circular scanning).

Gambar 3. Spektrofotodensitometer yang dihubungkan ke PC (Camag, 1999)

Metode TLC/HPTLC-Spektrofotodensitometri dapat digunakan untuk analisis kualitatif,

yaitu dengan membandingkan Rf senyawa analit dengan Rf pada literatur atau dengan Rf

standar yang ikut ditotolkan.

Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan TLC/HPTLC

biasanya dilakukan dengan densitometri langsung pada plat TLC/HPTLC secara in situ. Alat

ini digunakan untuk menentukan kadar suatu senyawa sampel (Schunack et al., 1990). Hal

ini dapat dilakukan dengan cara noda-noda yang telah terpisah pada pelat TLC/HPTLC

dimasukkan ke dalam alat ini, kemudian ditentukan kadarnya berdasarkan hubungan antara

Area Under Curve (AUC) noda dengan konsentrasi senyawa dalam noda.

Beberapa keunggulan metode kromatografi lapis tipis atau lebih dikenal dengan TLC

(thin layer chromatography) maupun kromatografi lapis tipis kinerja tinggi yang dikenal

dengan HPTLC (high performance thin layer chromatography) dengan kombinasi

spektrofotodensitometri dibandingkan dengan metode HPLC maupun GC (Sherma and Fried,

2003) diantaranya adalah:

1. Cepat, karena penggunaannya biasanya tidak membutuhkan preparasi khusus.

2. Dapat digunakan untuk analisis sampel dengan jumlah mencapai 30 sampel pada satu

pelat dan dapat memisahkan sampel-sampel tersebut secara bersamaan.

3. Adanya instrumen scanning modern yang dikontrol dengan komputer, instrumen

aplikasi sampel semi otomatis maupun otomatis, serta instrumen pengembangan dapat

membantu memberikan akurasi dan presisi yang setara dengan metode HPLC maupun

GC.

4. Terdapat berbagai pilihan pelarut pengembang (fase gerak) untuk memisahkan sampel

seperti basa, asam, aqua-organik.

5. Setiap sampel dapat dipisahkan dengan pelat baru sehingga dapat menghindari

masalah kontaminasi silang sampel dan tidak perlu melakukan regenerasi sorben.

6. Dalam hal konsumsi pelarut pengembang, metode TLC maupun HPTLC tergolong

hemat, sehingga dapat meminimalkan biaya untuk pembelian pelarut.

7. Kombinasi TLC/HPTLC dengan densitometer adalah dapat dilakukan pengulangan

pada tahap scanning tanpa mengkhawatirkan gangguan pada proses lanjutan, ini

dikarenakan semua proses berjalan secara independen.

DAFPUS :

Camag. 1999. Welcome to the CAMAG Wincats tutorial: Wincats planar chromatography. Switzerland: CAMAG.

Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Analisis Farmasi . Yogyakarta : Pustaka Pelajar.

Hahn-Deinstrop,E. 2007. Applied Thin-Layer Chromatography Best Practice and Avoidance of Mistakes, Second, Revised and Enlarged Edition. New York: John Wiley and Sons.

Kusmardiyani, S. dan A. Nawawi. 1992. Kimia Bahan Alam. Jakarta: Universitas Bidang Ilmu Hayati.

Mulja, M. dan Sukarman. 1995. Analisis Instrumental. Surabaya: Airlangga University Press.

Schunack, W., Mayer K., and Haaeke M. 1990. Buku Pelajaran Kimia Farmasi Edisi 2. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Sherma, J. and B. Fried. 1996. Handbook of Thin-Layer Chromatography. Third Edition. New York: Marcel Dekker Inc. P.147-149.

Widjaja,I.N.K. dan N.P.L.Laksmiani. 2010. Petunjuk Praktikum Kimia Analisis. Bukit-Jimbaran : Jurusan Farmasi F.MIPA Unud.