Dalam sistem klasifikasi 5 kingdom, tumbuhan berbiji digolongkan menjadi dua golongan, yaitu tumbuhan berbiji terbuka (Gymnospermae) dan tumbuhan berbiji tertutup (Angiospermae). Semua Angiospermae digolongkan dalam divisio tunggal, yaitu Anthophyta. Divisio ini terdiri atas dua kelas yaitu Monocotyledonae (monokotil) dan Dicotyledonae (dikotil)

MTT assay merupakan metode yang jamak digunakan dalam penelitian mengenai agen antikanker. Metode ini digunakan untukmenguji aktivitas sitotoksik sampel penelitian pada kultur sel yang digunakan.

Prinsip metode ini adalahreaksi redoks yang terjadi di dalam sel. MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) direduksi menjadi garam formazan oleh enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat di dalam mitokondria sel hidup. Reaksi dibiarkan terjadi selama 4 jam kemudian ditambahkan reagen stopper. Reagen stopper tersebut akan melisis membran sel sehingga garam formazan dapat keluar dari sel, serta melarutkan garam formazan tersebut. Garam formazan yang terbentuk dikuantifikasi dengan spektrofotometer dan diukur dalam bentuk absorbansi. Semakin tinggi absorbansi, semakin banyak sel yang hidup (viabilitas sel tinggi)Bagaimana reaksi yang terjadi dalam sel?

Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, MTT akan direduksi oleh enzim dehidrogenase (merupakan suatu enzim oksidoreduktase, karena terlibat dalam reaksi redoks) yang terdapat dalam mitokondria sel hidup, menjadi garam formazan. Enzim suksinat dehidrogenase ini merupakan enzim yang terlibat dalam respirasi sel, yaitu dalam siklus krebs.Enzim suksinat dehidrogenase merupakan enzim yang mengubah suksinat menjadi fumarat

Zat yang dapat digunakan sebagai reagen stopper adalah surfaktan. Hal ini dimaksudkan agar zat tersebut dapat melisis membran sel serta melarutkan kristal formazan yang sebenarnya tidak larut dalam media kultur. Terdapat beberapa jenis zat yang dapat digunakan, antara lain SDS dalam HCl, isopropanol, dan DMSO.Apa titik krusial dalam melakukan MTT assay?1. Penanaman sel dalam 96 well plateUntuk 1 konsentrasi sampel, digunakan triplo well (3 well) untuk mendapatkan validitas penelitian. Oleh karena itu, penanaman sel dilakukan dengan memasukkan 4 triplo terlebih dahulu berurutan, kemudian wadah berisi kultur sel disuspensikan kembali, dan ditanam lagi 4 triplo berikutnya. Hal ini dilakukan agar jumlah sel di setiap triplo seragam sehingga menghindari deviasi data yang besar.2. Pengamatan sel sebelum dilakukan treatment menggunakan sampelSebelum dilakukan treatment menggunakan sampel, lihat sel terlebih dahulu dan pastikan kepadatan sel dalam tiapwellsekitar 70-80% (konfluen). Jika terlalu rendah, dikhawatirkan seluruh sel akan mati akibat perlakuan sampel bahkan dalam konsentrasi rendah sehingga absorbansi yang didapatkan tidak valid. Sementara jika terlalu padat, jumlah sel dalamwellkontrol sel akan terlalu padat.3. Selalu memastikan wadah berisi MTT kedap cahayaMTT merupakan zat yang peka terhadap cahaya sehingga harus selalu terlindung dari cahaya (dapat menggunakan alumunium foil untuk membungkus wadahnya), walaupun sudah diencerkan menggunakan media kultur.4. Garam formazan yang terbentuk harus benar-benar larutsebelum dibaca menggunakanelisa reader,pastikan garam formazan yang terbentuk telah larut sempuran (tidak ada kristal lagi di dalam well). Hal ini dikarenakan adanya kristal akan mempengaruhi pembacaan larutan oleh spektrofotometer sehingga absorbansi yang didapatkan tidak valid. Pelarutan garam formazan ini sangat ditentukan oleh ketepatan komposisi reagen stopper serta dapat dibantu pelarutannya menggunakanshaker.intensitas warna ungu ditentukan oleh sel yang hidup, semakin intens warna ungu, semakin tinggi jumlah sel yang hidup

1. Tujuan :

Menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis1. Teori Singkat :

Asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid. PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) pada manusia disintesis dari MUFA (Mono Unsaturated Fatty Acid ), melalui penambahan ikatan rangkap antara ikatan rangkap yang sudah ada (D9) dan gugus karboksil menghasilkan asam lemak w-9.Peroksidasi lipid adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi secara alami di dalam tubuh yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen dari proses metabolisme di dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti radikal anion superoksida, radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh (Halliwell & Gutteridge 1999).Peroksida lipid selanjutnya mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA produk akhir proses peroksidasi lipid dan yang paling sering digunakan untuk mengukur proses peroksidasi lipid. Pengujian MDA dilakukan dengan TBA (Asam tiobarbiturat) yaitu akan membentuk senyawa warna merah muda dan diukur serapan pada panjang gelombang 532 nm, juga dapat diukur dengan HPLC (High Performance Liqiud Chromatography )

Proses peroksidasi lipidAkibat serangan ROS terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) pada membran 3 tahap:

Metode Uji Aktivitas Antioksidan Radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH)ByedhisambadaMetode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan tanaman obat adalah metode uji dengan menggunakan radikal bebas DPPH. Tujuan metode ini adalah mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal ini dapat dicapai dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode tersebut. DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak.Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Perubahan absorbansi akibat reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas.Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva, van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002; Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2010).

Gambar 1. Gugus kromofor dan auksokrom DPPHGambar 2. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan antioksidan (Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010)Berikut adalah contoh gambar dari aplikasi metode DPPH:

Gambar 3. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif, B = kontrol positif [rutin], dan C = larutan uji [fraksi air ekstrak etanolik daun selasih])Untuk penentuan nilaiIC50suatu sampel jangan lupa untuk mengoptimasi dan memvalidasi metode yang Anda pakai. Optimasi metode berupa penentuanOTdan lambda maksimum. Validasi metode dengan parameter akurasi, presisi, linearitas, range, dan spesifisitas.Menurut Ariyantocit. Armala (2009), tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji menggunakan metode DPPH dapat digolongkan menurut nilaiIC50(Tabel I).Tabel I. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPHIntensitasNilaiIC50

Sangat kuat< 50 g/mL

Kuat50-100 g/mL

Sedang101-150 g/mL

Lemah> 150 g/mL

PUSTAKAArmala, M. M., 2009, Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir (Cosmos caudatusH. B. K.) dan Profil KLT,Skripsi, 39, Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition,Grasas Aceites, 60(4), 405-412.Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N., 2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A Comparative Study on Three Testing Methods,Phytochemical Analysis, 13, 8-17.Prakash, A., Rigelhof, F., dan Miller, E., 2010,Antioxidant Activity,http://www.medallionlabs.com, diakses tanggal 14 September 2010.Witt, S., Lalk, M., Hager, C., dan Voigt, B., 2010, DPPH-Test: Determination ofScavenger Properties,http://www.baltic-analytics.de/index. php?id=7&L=1, diakses tanggal 14 September 2010.