CSS OSOleh : KEMALA HERMITANPM : 0910070110055

Efek Fluoride pada Proses Perbaikan Tulang Alveolar pada

Tikus: Evaluasi Kegiatan MMP-2 dan 9

Mileni da Silva Fernandes1, 2Gisele Miyamura Martins3Lucas Makoto Shimoraha2Flávia Godoy Iano2Marcela Mitsuko Yanai4Tânia Mary Cestari2Marília Afonso Rabelo Buzalaf2Rodrigo Cardoso de Oliveira2

Penulis:Rodrigo Cardoso de OliveiraAlameda Octávio Pinheiro Brisolla, 9-75 – Departamento de Ciências BiológicasFaculdade de Odontologia de Bauru – Universidade de São PauloCEP 17012-101 – Bauru – SP – BrasilE-mail: rodrigocardoso@usp.br

¹ University of São Carlos – São Carlos – SP – Brazil.² School of Dentistry of Bauru, University of São Paulo – Bauru – SP – Brazil.3 Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo – São Paulo – SP – Brazil.4 Private practice.

Dikirim untuk publikasi: November 4, 2011. Diterima untuk publikasi: December 19,2011.

Abstrak

Tujuan: Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi relatifnya efek fluoride (F)

pada aktivitas matriks metalloproteinase 2 dan9 (MMP-2 dan MMP-9) yang terlibat

dalam proses perbaikan tulang alveolar.Bahan dan cara: Penelitian ini menggunakan 4

kelompok tikus Wistar dengan80 hari hidup (n = 160) yang mendapat air minum yang

mengandung dosis yang berbeda dari fluoride (NaF): 5, 15, 50 ppm dan air deionisasi

(kontrol) seluruh percobaan. Hewan ini memiliki gigi seri atas kanan dicabut. Setelah

ekstraksi, hewan-hewan itu eutanasia pada 7, 14, 21 dan 30 hari dan hemi-maksila

dikumpulkan untuk analisis mikroskopis (Hematoksilin dan Eosin dan imunohistokimia

untuk MMP-9) dan zimografi (MMP-2 dan 9). Hasil: Mikroskopis proses perbaikan

tulang adalah serupa pada semua kelompok, adanya catatan hanya penundaan dari

resorpsi bekuan darah dan pembentukan tulang pada kelompok 50 ppm F. Pernyataan

untuk MMP-9 menunjukkan perbedaan antara kelompok hanya selama perbaikan awal (7

hari). Namun, zimografi menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan antara

perlakuan dan kelompok kontrol. Kesimpulan: Hasil kita menunjukkan efek dari fluorida

pada aktivitas MMPs 2 dan 9 pada periode awal perbaikan alveolar yang dapat dikaitkan

dengan proses gumpalan darah remisi dan keterlambatan dalam perbaikan tulang. Studi

lebih lanjut diperlukan untuk membangun hubungan antara proses awal resorpsi bekuan

darah, dan keterlibatan MMPs 2 dan 9 dan regulator / inhibitor jaringan.

Kata kunci: perbaikan tulang; matriks metaloproteinase; fluor

Pengantar

Proses perbaikan tulang merupakan kejadian diatur dengan hdfalus dan ditandai

dengan fase yang berbeda dengan dominasi jenis sel tertentu, bertujuan pembentukan

jaringan di daerah yang terkena. Tahap perbaikan melibatkan migrasi, proliferasi,

diferensiasi, dan aktivasi berbagai jenis sel [16, 22]. Di antara model studi yang berbeda

dari perbaikan tulang, model perbaikan tulang dalam soket gigi sudah sangat memadai

karena memungkinkan evaluasi kronologis proses perbaikan, merinci pokok perihal yang

berhubungan pada setiap tahap [31].

Secara kronologis, empat tahap dasar dapat dianggap dalam evolusi proses

perbaikan alveolar [30, 37]: 1) tahap eksudatif, ditandai dengan pengisian soket gigi oleh

gumpalan darah (1-7 hari setelah pencabutan gigi, di alveolus tikus);2) tahap proliferatif,

ditandai dengan intens ion Ferat proli seluler, pengembangan ion maturat nd dari jaringan

ikat (7-14 hari setelah pencabutan gigi, di alveolus tikus); 3) tahap reparatif, di mana

terjadi reposisi bertahap dari jaringan ikat oleh trabekula tulang (14-21 hari setelah

pencabutan gigi, di alveolus tikus); 4) tahap renovasi, yang ditandai dengan proses

substitusi penggantian primer dengan jaringan tulang sekunder (21 hari setelah

pencabutan gigi, di alveolus tikus) [1].

Mengingat dari tahap awal pembentukan gumpalan darah ke tahap terakhir

renovasi baru terbentuk jaringan tulang, beberapa sel dan molekul sinyal yang terlibat

yang mengatur (dan juga diatur) selama pengembangan proses ini. Beberapa molekul

terlibat dalam beberapa tahap dari proses perbaikan alveolar, misalnya matriks meta

lloproteinases (MMP) [2], antara lain. MMPs adalah keluarga penting dari metal-

dependent endopeptidases dan mewakili kelas utama enzim yang bertanggung jawab

untuk degradasi atau resorpsi semua komponen ekstra-seluler matri x (ECM) [38]. Target

mereka termasuk proteinase lainnya, inhibitor proteinase, faktor bekuan darah, molekul,

faktor pertumbuhan laten, pertumbuhan factor binding protein, reseptor permukaan sel,

molekul chemotactic, adhesi sel [29]. MMPs dapat diklasifikasikan menurut struktur atau

substrat khusus mereka, yang mengakibatkan 25 jenis MMPs [15].

Banyak tanggapan penting pada tahap perbaikan, seperti infiltrasi inflamasi,

angiogenesis (degradasi membran, invasi, proliferasi dan kapiler formasi basal) [15], dan

reepitelisasi yang dipengaruhi oleh MMPs; juga molekul-molekul ini mungkin penanda

penting dari perbaikan jaringan, terutama MMPs dikenal sebagai gelatinases (MMP-2 e

MMP-9) [39]. Mereka terlibat dalam perbaikan tulang alveolar tikus [1], osteogenesis

[13], dan mereka berpartisipasi dalam tahap terakhir dari penulangan [41].

Dalam pengetahuan saat ini pada biologi perbaikan tulang, diketahui bahwa

fluoride (F) telah digunakan sebagai alternatif untuk merangsang mitosis osteoblas, dan

telah diteliti sebagai agen anabolik di jaringan tulang untuk pengobatan osteoporosis [35].

Beberapa penelitian telah menunjukkan efek fluoride dalam osteoblas [4, 8, 9, 23, 31] dan

molekul aktin, enzim (alkali fosfatase) [32] dll. Namun, rincian tentang efek fluoride

pada beberapa molekul yang terlibat dalam tulang proses perbaikan, di antaranya MMP,

belum sepenuhnya dipahami namun [19]. Sejak fluoride telah digunakan sebagai

mengukur kesehatan masyarakat di Brazil (dalam pasokan air), perlu menyelidiki

beberapa efek yang mungkin pada perbaikan jaringan tulang, khususnya mengenai MMP.

Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh fluoride pada

aktivitas MMPs 2 dan 9 yang terlibat dalam proses perbaikan tulang alveolar.

Bahan dan metode

Hewan

Penelitian ini sebelumnya telah disetujui oleh Ethical Committee in Teachingand

Research pada hewan dari Sekolah Kedokteran Gigi Bauru - University dari São Paulo.

Male Wistar rates (Rattus norvegicus), yang berasal dari Central Vivarium dari Sekolah

Kedokteran Gigi dari Bauru, telah dipakai. Hewan-hewan (n = 160) dibagi menjadi4

kelompok eksperimen (0 ppm, 5 ppm, 15 ppm dan 50 ppm F) dan diperlakukan dengan

menelan dikendalikan dari fluoride selama 60 hari (air minum dan makanan) setelah

ablactation. Air disiapkan dengan konsentrasi F berbeda sesuai dengan kelompok

tersebut: 0 ppm (air deionisasi); 5 ppm (air dengan 5 ppm dari f luoride); 15 ppm (air

dengan 15 ppm dari f luoride); 50 ppm (air dengan 50 ppm dari f luoride).

Selama studi (pra dan pasca operasi), makanan yang terkandung rendah

kandungan fluoride [33].

Prosedur bedah

Setelah masa pengobatan (60 hari), hewan-hewan itu disampaikan kepada

ekstraksi gigi insisivus kanan atas, dilakukan dengan anestesi umum dengan ketamin dan

xylazine (1: 1), dihitung sesuai dengan massa tubuh hewan (0,14 ml / 100 g berat), oleh

intramuskular melalui [26]. Jahitan dicapai melalui benang sutra hitam (4/0 Ethicon,

Johnson& Johnson, São José dos Campos, SP, Brazil), menurut prosedur yang telah

dijelaskan sebelumnya oleh Okamoto dan Russo [26].

Pengumpulan dan pengolahan histotechnical sampel untuk mikroskopi

Periode eksperimental berlalu, hewan-hewan itu eutanasia sesuai dengan

pedoman dari Brasil College of Animal Eksperimentasi (Cobea pendek) dengan dosis

berlebihan obat bius, dan maxila kanan dikumpulkan. Setengah dari potongan-potongan

yang dikumpulkan diperuntukkan untuk pengolahan histotechnical dan setengah lainnya

untuk zimografi. Untuk histologis dan analisis immun-histokimia, potongan diperoleh (n

= 5) diserahkan ke fiksasi dalam 10% buffer formalin, selama 48 jam; berikutnya, mereka

diradiografi, demineral di0,05 M etilendiamin asam tetraacetic (EDTA) solution, pH 7,4,

[27], dan diaphanized untuk dimasukkan dalam parafin. Mengikuti, 4 luka µm-tebal

dilakukan di mikrotom (mikroM, Model HM 340 E, Jerman), termasuk dalam lamina

konvensional dan Super-es Ditambah silanized (Erviegas, São Paulo, SP, Brazil), yang

masing-masing diwarnai oleh hematoxylin- eosin (HE) teknik dan immunostained

terhadap antigen tertentu.

Analisis mikroskopis dari lamina ternoda oleh HE

Lapisan tipis berwana dari hematoxylin-eosin teknik kita periksa di bawah

mikroskop cahaya. Soket gigi dievaluasi dalam apikal dan pertiga menengah . Respon

biological dianalisis sesuai dengan tahapan proses perbaikan: adanya bekuan darah,

proliferasi fibroblastik dan neoformation tulang.

Imunohistokimia

Untuk mandeteksi protein MMP-9, potongan diserahkan ke teknik

immunostaining langsung melalui metode peroksidase SABC. Tiga lamina per hewan

disiapkan dan di masing-masing sepuluh bidang dari 6.300 mm2 yang jelas untuk

menentukan penghitungan sel immunostained untuk antibodi spesifik. Pemotongan

jaringan yang diaphanized (3 baths dari 5 menit di silol) dan direhidrasi dalam

menurunkan konsentrasi etanol (100%, 95% dan 70%) selama 5 menit masing-masing

dan kemudian dalam air suling. Inaktivasi dari peroksidase endogen dilakukan di3%

hidrogen peroksida (2 baths dari 10 menit). Berikutnya, itu dieksekusi cuci PBS (2x),

eksposisi antigen oleh pepsin enzimatik pencernaan (S3002, Dakocytomation Carpinteria,

USA) selama 20 menit, dicuci 3 baths dari PBS (3x), penyumbatan protein serum

dilakukan dalam 10% larutan susu skim (Molico, Nestlé Brasil Ltd, Araçatuba, São

Paulo, Brasil) di PBS selama 40 menit. Lamina diinkubasi dengan antibodi primer

terhadap MMP-9 (SC6840, Santa Cruz Bioteknologi Inc, USA; 1: 100) diencerkan dalam

pengencer antibodi (S3022, Dakocy tomation Carpinteira, USA) selama 1 jam dan 30

menit pada suhu lingkungan. Pemotongan kontrol negatif diinkubasi dalam larutan PBS.

Setelah, semua pemotongan jaringan dicuci di PBS (3x). Inkubasi dengan antibodi

sekunder (E0466 - Dakocytomation Carpinteira, EUA; 1: 500) dilakukan selama 1 jam.

Setelah periode ini pemotongan diserahkan ke baths dari PBS. Deteksi kompleks antibodi

primer-sekunder dilakukan dengan inkubasi di HRP estreptavidine- (StrptABComplex /

HRP®, LSAB2 -X0909 atau K0675 - DakoCytomation Carpinteria, USA) selama 30

menit. Berikut, baths PBS (3x), visualisasi dari antigen-antibody bereaksi dengan DAB+

(K3468-DakoCytomation Carpinteria, USA) selama 45 s, diikuti oleh PBS dan suling

cuci air (5 menit, 3x) dieksekusi. Akhirnya, counterstaining oleh hematoxylin selama 45s,

cuci air selama 10 menit, etanol dehidrasi, silol diaphanization dan adhesi dari coverslip

dalam pemotongan dengan Enterlan® Resi n (Merck KGAA, Frank furter, Darmstadt,

Jerman) dilakukan .

Sel-sel immunostained untuk MMP-9 protein dianalisis di x100 tujuan

pembesaran, dengan integrasi reticular, digabungkan ke x8 pembesaran okular. Hasil

yang diperoleh dalam jumlah sel / mm2.

Analisis zimografi

Sampel yang dikumpulkan untuk analisis zymographic (n = 5) yang triturated dan

dihomogenisasi pada suhu rendah (-170 ° C) dengan menggunakan pabrik penggilingan

kriogenik (6770 Freezer / Mill, Spex Certiprep, Metuchen, NJ, USA). Untuk extrak

protein, sekitar 1 g tulang alveolar dihomogenisasi di triton X100 pada 25% dan gelisah.

Sampel disentrifugasi selama 20 menit pada 15.000 rpm, pada+ 4 ° C. Pada akhirnya,

supernatant membuang dan 200 µL buffer extraksi Tris 50 mM CaCl2 dan 100 mM, pH

7,4 dan 1 µL PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) ditambahkan kelapian endapan.

Sampel yang tersisa di bak air di50 ° C selama 2 jam, dan pada setiap 10 menit agitasi

penyinaran dilakukan; setelah itu, sampel disentrifugasi selama 15 menit pada 15.000

rpm. Supernatan dikumpulkan dan disimpan dalam freezer (-20 ° C) untuk mengikuti

kuantifikasi dengan menggunakan metode yang dijelaskan oleh Lowry et al. [21].

Dalam elektroforesis, itu diterapkan 60 µg protein dari sampel soket gigi. Itu

digunakan gel pemisahan sebesar 11% sodium dodesil sulfat poliakrilamida (SDS-PAGE)

dengan 0,5% gelatin sebagai substrat. Pola berat molekul yang digunakan untuk MMP-2

dan 9 (Calbiochem, EMD, Biosciences Inc, La Jolla, CA, USA).

Pada akhir elektroforesis (sekitar 2 jam) gel diinkubasi dalam 50mm Buffer Tris

HCl, 2,5% Twenn 80, 0,02% NaN3, pH 7,5, dan dibiarkan selama 30 menit; selanjutnya

digantikan oleh50 mM Tris HCl Buffer, 2,5% Twenn 80, 0,02% NaN3, 1 pM ZnCl2, 5

mM CaCl2 dan dibiarkan selama lebih30 menit. Kemudian, digantikan untuk

50mmBuffer Tris HCl, 5mm CaCl2, 0,02% NaN3, 1 pM ZnCl2 (pH 7,5), di mana gel

yang tersisa selama 18 jam pada suhu 37 ° C. Pada akhir periode ini, gel diwarnai dengan

Coomassie Biru G-250 (0,5%) dan diputihkan oleh larutan 10% metanol dan 5%asam

asetat. Analisis gel dilakukan oleh densitometri melalui Kodak Molecular Pencitraan

Software (Rochester, NY, USA).

Analisis statistik

GraphPad Instat software versi 3.0 untukWindows dan GraphPad Prism versi

perangkat lunak4.0 untuk Windows (Grafik Pad Software, San Diego, USA) digunakan.

Data disajikan normal dan distribusi homogen, dan dianalisis dengan Anova. Uji Tukey

diaplikasikan sebagai post hoc untuk Anova. Tingkat signifikansi diadopsi pada 5%,

untuk semua kasus.

Hasil

Analisis mikroskopis

Di semua kelompok belajar, proses perbaikan tercatat sesuai dengan waktu yang

telah berlalu selama periode percobaan (7, 14, 21 dan 30 hari). Pada 7 hari, soket gigi

terisi terutama oleh gumpalan darah dan jaringan ikat, tanpa perbedaan besar di antara

kelompok-kelompok. Pada 14 dan 21 hari, ada bertahap penurunan bekuan darah,

perubahan dalam jaringan ikat disusun oleh fibroblas, makrofag, dan beberapa sel-sel

inflamasi ke jaringan penghubung disusun oleh fibroblas dan fibrocytes, parallelly

dengan penggantian jaringan tulang baru ( primer), tumbuh dari dinding soket untuk

pusatnya. Pada periode waktu ini, (14 dan 21 hari), formasi jaringan tulang yang lebih

besar tercatat pada kelompok kontrol dibandingkan dengan kelompok yang diobati

dengan fluoride; juga, ada lebih tinggi kehadiran dari sisa-sisa bekuan darah pada

kelompok yang diobati dengan 50 ppm F. Pada 30 hari, pembentukan jaringan tulang

yang menutupi sebagian besar dari soket terlihat di semua kelompok; Namun, ada

pembentukan tulang lebih tinggi pada kelompok kontrol dibandingkan dengan kelompok

perlakuan 50 ppm F.

MMP-9: immunostaining dan histomorfometri

Secara umum, sel immunostained untuk MMP-9 yang mirip dengan sel-sel

makrofag mononucleated, di periode awal (7 dan 14 hari), ditemukan di semua

kelompok. Pada periode berikutnya, 21 dan 30 hari, pewarnaan itu terutama di osteoblas,

sel-sel mirip dengan fibroblas dan osteoklas (gambar 1) mononucleated, ditemukan di

semua kelompok belajar.

Gambar 1 – Area tulang dari alveolus menunjukkan sel immunostained (MMP-9), yang baru terbentuk (NB),

jaringan penghubung (CT)A) Kelompok I (0 ppm) 7 hari; B) Kelompok I (0 ppm) 30 hari; C) Kelompok IV

(50 ppm) 7 hari; D) Kelompok IV (50 ppm) 30 hari; E) Kelompok I (7hari), kontrol negatif (tidak adanya

antibodi primer). X40 perbesaran

• apikal ketiga: Ekspresi MMP-9 terdaftar pada semua kelompok, baik eksperimen dan

kontrol, (gambar 1). Ekspresi MMP-9 meningkat pada 0 ppm dan 15 ppm kelompok,

sesuai dengan periode waktu yang telah berlalu (7-30 hari). Namun, dalam 5 ppm dan 50

ppm kelompok F ada penurunan jumlah sel immunostained untuk MMP-9. Tidak ada

perbedaan signifikan secara statistik dalam ekspresi MMP-9 antara kelompok eksperimen

(tabel I);

• Medium ketiga: Ekspresi MMP-9 meningkat sebagai waktu berlalu (7-30 hari) di 0

ppm, 5 ppm dan 15 ppm kelompok F. Ada penurunan 50 ppm kelompok F. Pada periode

percobaan 7 hari, ada perbedaan signifikan secara statistik antara 0 ppm dan 50 ppm

kelompok F dan antara 15 ppm dan 50 ppm F (tabel I).

Tabel I - Jumlah sel / mm2 yang menyatakan MMP-9, di pertiga apikal dan menengah,

di beberapa periode eksperimental

Experimental groupTime (days)

0 ppm 5 ppm 15 ppm 50 ppm

apical medium apical medium apical medium apical medium

7 114⃰Aa

(34)93Aa

(16)193Aa

(73)158Aab

(44)111Aa

(41)118Aa

(29)195Aa

(53)247 Ab

(66)14 149Aa

(51)172Aa

(35)185Aa

(122)206Aa

(141)142Aa

(37)160Aa

(30)165Aa

(17)180Aa

(53)21 170Aa

(42)139Aa

(46)182Aa

(51)170Aa

(43)159Aa

(40)181Aa

(51)166Aa

(31)217Aa

(48)30 134Aa

(35)180Aa

(45)136Aa

(57)179Aa

(83)140Aa

(65)125Aa

(19)145Aa

(11)168Aa

(38)* Berarti dari jumlah sel berwarna; () Deviasi standar untuk setiap variabel, huruf kecil yang berbeda pada

baris yang sama; untuk setiap variabel, huruf besar yang berbeda dalam kolom yang sama

Kegiatan MMPs 2 dan 9 dan proenzymes

Aktivitas metaloproteinase 2 dan 9 dan proenzymes masing-masing dinyatakan

dalam kaitannya dengan daerah yang diperoleh di zymogram (analisis band: jumlah pixel

per mm2). Aktivitas pro-MMP-9 dan MMP-9 lebih tinggi pada kelompok perlakuan

dengan 5 ppm F pada 30 hari dibandingkan kelompok lain (grafik 1). Di sisi lain,

kelompok yang diobati dengan 15 ppm F diperoleh aktivitas tertinggi pro-MMP-9 dan

MMP-9 pada 7 hari.50 kelompok ppm F diperoleh nilai terkecil dari aktivitas MMP-9

(pro dan aktif) bila dibandingkan dengan kelompok lain.

Grafik 1 - Perwakilan dari aktivitas pro-MMP-9 (A) dan MMP-9 (B) di daerah band di gel zymogram,

mengendalikan, 5, 15 dan 50 ppm kelompok F

Mempertimbangkan untuk pro-MMP-2 dan MMP-2, nilai-nilai yang sangat mirip

antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol pada 7 dan 30 hari (grafik 2).

Pengecualian terjadi sehubungan dengan kelompok perlakuan dengan 15 ppm F, yang

diperoleh kegiatan lebih kecil daripada kelompok lain di 30 hari, baik untuk proenzim

dan aktif MMP-2.

Grafik 2 - Perwakilan dari aktivitas pro-MMP-2 (A) dan MMP-2 (B) di daerah band di gel zymogram,

mengendalikan, 5, 15 dan 50 ppm kelompok F

Diskusi

Beberapa studi dalam literatur telah menggambarkan hal perbaikan alveolar

setelah pencabutan gigi pada tikus [25, 37], anjing [5] dan manusia [11, 12]. Dalam hal

ini, perbaikan tulang di alveolus setelah ekstraksi gigi telah diadopsi sebagai model yang

sangat menarik untuk studi tahapan proses perbaikan tulang, dari peristiwa awal (jam dan

hari) untuk periode akhir (bulan) untuk identifikasi / kuantifikasi sel dan molekul, selain

pernyataan gen ini [6, 25]. Beberapa molekul-molekul ini terlibat dalam perbaikan

alveolar yang MMPs [1, 3]. Secara khusus, MMPs 2 dan 9 yang terkait dengan tahap

perbaikan alveolar pada tikus dan juga untuk jenis selular hadir dalam setiap tahap [1].

Hasil studi ini berada dalam perjanjian dengan yang dijelaskan sebelumnya [1], yang juga

melaporkan pertukaran pewarnaan MMPs2 dan 9 dan seluler jenis mengekspresikan

merekadalam berbagai tahap perbaikan alveolar. Pernyataan ini / kegiatan MMPs

dibenarkan karena MMP fungsi hadir dalam proses invasi seluler / migrasi [28],

membantu fenomena angiogenesis [10, 15, 34], yang membawa dukungan cukup darah

untuk kebutuhan gizi proses regenerasi [18]. Selain itu untuk invasi sel dan migrasi,

MMPs akan hadir dalam tahap berikut untuk melanjutkan proses degradasi [24] dan

renovasi dari matriks di daerah perbaikan tulang [1, 7]. Namun, hasil penelitian ini hadir

mengenai ke MMPs 2 dan 9 pada kelompok yang diobati dengan F, berbeda dari yang

dijelaskan oleh Accorsi-Mendonca et al. [1], di samping perbedaan sudah dijelaskan

sehubungan dengan kelompok kontrol dari studi tersebut. Ini mungkin menyarankan

gangguan langsung atau tidak langsung dari F di MMPs 2 dan 9 kegiatan.

Hal ini diketahui bahwa MMP dapat diatur dalam fase yang berbeda, dari

transkripsi ke zymogen aktivasi [14], serta penghambatan menjalani oleh molekul lain

sebagai TIMPs (inhibitor jaringan MMPs) [1, 17] atau RECK (reversi-inducing- sistein-

kaya protein dengan Kazal motif) protein [40, 42]. Oleh karena itu, immunostaining dari

MMP-2 dan MMP-9 itu sendiri tidak menjamin bahwa enzim berwarna memiliki

aktivitas dalam jaringan karena antibodi anti-MMP akan dihubungkan ke area yang hadir

enzim dalam kedua bentuk pro-aktif dan aktif [1, 20]. Meskipun demikian, analisis

dengan immunostaining dari MMPs dapat menunjukkan distribusi ruang waktu-enzim,

yang merupakan fakta yang sangat menarik. Dengan demikian, kuantifikasi aktivitas

MMPs oleh zimografi dianggap metode yang paling memadai [20]. Mengingat

pembahasan tersebut di atas, dapat dipahami perbedaan dalam hasil penelitian ini hadir

antara immunostaining MMP-9 dan aktivitasnya diukur dengan zimografi. Hasil tersebut

tidak bertentangan; namun mereka saling melengkapi.

Peraturan dan penghambatan MMPs 2 dan 9 terkait dengan proses resorpsi

bekuan darah, serta penggantian dengan jaringan ikat dan berikut dengan pembentukan

jaringan tulang [10]. Penelitian In vitro telah menunjukkan regulasi aktivasi MMP-2

aktivasi pada awal osteogenesis [1] dan diferensiasi osteoblastik [42] melalui molekul

lain seperti MMPs 9 dan 14, Reck dan TIMP-2. Studi lain, yang dilakukan dengan tikus

KO, pada MMP-2 dan MMP-9, masing-masing, menunjukkan pentingnya kedua enzim

dalam sifat struktural jaringan tulang [24]. Temuan ini mungkin membenarkan perbedaan

yang ditemukan dalam pewarnaan untuk MMP-9 dan akibatnya perbedaan dalam

perbaikanproses antara kelompok perlakuan dan kontrol. Studi lainnya menguatkan kita

adalah bahwa dari Basi dkk. [3], di mana penulis dijelaskan penundaan dalam proses

perbaikan alveolar tikus yang diobati dengan asam zoledronic terkait dengan peningkatan

ekspresi MMP-9. Dalam penelitian yang sama ini [3] penulis menyarankan peningkatan

aktivitas MMP-9 dan meningkatnya jumlah clasts atau bahkan dalam kegiatan clasts ini,

mengetahui bahwa MMP-9 terutama diekspresikan pada permukaan osteoklas dan di

neoformation situs [29, 36]. Temuan juga menunjukkan pewarnaan sel mirip dengan

clasts untuk MMP-9, membenarkan tersangka dari beberapa penulis [3, 29,

36].Pewarnaan MMP-9 dalam sel yang sama dengan makrofag, yang diperoleh dalam

penelitian ini, dalam perjanjian dengan studi De Jong et al. [10], yang melalui

imunohistokimia dikonfirmasi ekspresinya dalam makrofag.

Kesimpulan

Hasil penelitian menunjukkan efek dari fluorida dalam kegiatan MMPs 2 dan 9 di

periode awal perbaikan alveolar, yang mungkin terkait dengan proses penggantian bekuan

darah dan akibatnya untuk keterlambatan dalam perbaikan tulang.

Pengakuan

Kami berterima kasih kepada kolaborasi Silvana Pasetto (DDS, MsC, PhD), dari

Danielle Ceolin (teknisi laboratorium), Aline L. Leite dan Tatiana Furlani (mahasiswa).

Juga, kami berterima kasih kepada dukungan dari FAPESP (Hibah 06 / 06430-3, # 07 /

00494-2 dan# 08 / 09926-5) dan CNPq (Grant 472.798 / 2008-1).

Referensi

1. Accorsi-Mendonça T, Paiva KB, Zambuzzi WF, Cestari TM, Lara VS, Sogayar MC et al. Expression of matrix metalloproteinases-2 and -9 and RECK during alveolar bone regeneration in rat. J Mol Histol. 2008 Apr;39(2):201-8.

2. Allori AC, Sailon AM, Warren SM. Biological basis of bone formation, remodeling, and repair– part I: biochemical signaling molecules. TissueEng Part B Rev. 2008 Sep;14(3):259-73.

3. Basi DL, Hughes PJ, Thumbigere-Math V, Sabino M, Mariash A, Lunos SA et al. Matrix metalloproteinase-9 expression in alveolar extraction sockets of zoledronic acid-treated rats. J Oral Maxillofac Surg. 2011 Nov;69(11):2698-707.

4. Boivin G, Chavassieux P, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Skeletal fluorosis: histomorphometric f i n d i n g s . J B o n e a n d M i n e r a l R e s . 1 9 9 0Mar;5(1):185-9.

5. Cardaropoli G, Araujo M, Lindhe J. Dynamics of bone tissue formation in tooth extraction sites. An experimental study in dogs. J Clin Period. 2003Sep;30(9):809-18.6. Cardoso CL, Ferreira Júnior O, Carvalho PS, Dionísio TJ, Cestari TM, Garlet GP. Experimental dry socket: microscopic and molecular evaluation of two treatment modalities. Acta Cir Bras. 2011Oct;26(5):365-72.

7. Cerri PS, Pereira-Júnior JA, Biselli NB, Sasso- Cerri E. Mast cells and MMP-9 in the lamina propria during eruption of rat molars: quantitative and immunohistochemical evaluation. J Anat.2010 Aug;217(2):116-25.

8. Cheng K, Weng W, Wang H, Zhang S. In vitro behavior of osteoblast-like cells on fluoridated hydroxyapatite coatings. Biomaterials. 2005Nov;26(32):6288-95.

9. Cooper LF, Zhou Y, Takebe J, Guo J, Abron A, Holmén A et al. Fluoride modification effects on osteoblast behavior and bone formation at TiO2 grit-blasted c.p. titanium endosseous implants. Biomaterials. 2006 Feb;27(6):926-36.

10. De Jong PT, Tigchelaar W, Van Noorden CJ, Van der Vis HM. Polyethylene wear particles do not induce inflammation or gelatinase (MMP-2 and MMP-9) activity in fibrous tissue interfaces of loosening total hip arthroplasties. Acta Histochem.2011 Sep;113(5):556-63.

11. Devlin H. Early bone healing events following rat molar tooth extraction. Cells Tissues Organs.2000;167(1):33-7.

12. Devlin H, Sloan P. Early bone healing events in the human extraction socket. Int J Oral Maxillofac Surg. 2002;31(6):641-5.

13. Filanti C, Dickson GR, Di Martino D, Ulivi V, Sanguineti C, Romano P et al. The expression of metalloproteinase-2, -9, and -14 and of tissue inhibitors-1 and -2 is developmentally modulated during osteogenesis in vitro, the mature osteoblastic phenotype expressing metalloproteinase-14. J Bone Miner Res. 2000;15(11):2154-68.

14. Fridman R, Toth M, Peña D, Mobashery S. Activation of progelatinase B (MMP-9) by gelatinase A (MMP-2). Cancer Res. 1995 Jun;55(12):2548-55.

1 5 . G h a j a r C M , G e o r g e S C , P u t n a m A J . Matrix metalloproteinase control of capillary morphogenesis. Crit Rev Eukaryot Gene Expr.2008;18(3):251-78.

16. Gittens SA, Uludag H. Growth factor delivery for bone tissue engineering. J Drug Target.

2001;9(6):407-29.17. Hatori K, Sasano Y, Takahashi I, Kamakura S, Kagayama M, Sasaki K. Osteoblasts and osteocytes express MMP2 and -8 and TIMP1, -2, and -3 along with extracellular matrix molecules during appositional bone formation. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 2004 Apr;277(2):262-71.

18. Hing KA, Best SM, Tanner KE, Bonfield W, Revell PA. Mediation of bone ingrowth in porous hydroxyapatite bone graft substitutes. J Biomed Mater Res A. 2004 Jan;68(1):187-200.

19. Kebsch M, Wilkinson M, Petocz P, Darendeliler MA. The effect of fluoride administration on rat serum osteocalcin expression during orthodontic movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2007Apr;131(4):515-24.

20. Kupai K, Szucs G, Cseh S, Hajdu I, Csonka C, Csont T et al. Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography. J Pharmacol Toxicol Methods. 2010 Mar-Apr;61(2):205-9.

21. Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(1):265-75.

22. Mandracchia VJ, Nelson SC, Barp EA. Current concepts of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 2001 Jan;18(1):55-77.

23. Mohr H. Fluoride effect on bone formation – an overview. Tandlaegebladet. 1990 Dec;94(18):761-3.

24. Nyman JS, Lynch CC, Perrien DS, Thiolloy S, O’Quinn EC, Patil CA et al. Differential effects between the loss of MMP-2 and MMP-9 on structural and tissue-level properties of bone. Journal of Bone and Mineral Research. 2011;26(6):1252-60.

25. Okamoto T, Okamoto R, Alves Rezende MC, Gabrielli MF. Interference of the blood clot on granulation tissue formation after tooth extraction. Histomorphological study in rats. Braz Dent J.1994;5(2):85-92.

26. Okamoto T, Russo MC. Wound healing following tooth extraction. Histochemical study in rats. Rev Fac Odontol Araçatuba. 1973;2(2):153-69.

27. Oliveira RC, Zambuzzi WF, Zambolin A, Silva TL, Cestari TM, Taga R et al. Marcadores bioquímicos e microscópicos como ferramentas investigativas da resposta tecidual envolvidas com a associação de osso cortical bovino/colágeno em subcutâneo de ratos. Innov Implant J. 2008Sep;3(6):17-22.

28. Opdenakker G, Van Damme J. Chemotactic factors, passive invasion and metastasis of cancer cells. Immunol Today. 1992 Nov;13(11):463-4.

29. Page-Mccaw A, Ewald AJ, Werb Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue r e m o d e l l i n g . N a t R e v M o l C e l l B i o l . 2 0 0 7Mar;8(3):221-33.

30. Perri de Carvalho AC, Okamoto T, Garcia Jr IR. Empregos de membranas de teflon para a reparação guiada em exodontia. Rev Gaúcha Odont. 1998;46(3):127-31.

31. Qu H, Wei M. The effect of fluoride contents in fluoridated hydroxyapatite on osteoblast behavior. Acta Biomater. 2006 Jan;2(1):113-9.

32. Qu WJ, Zhong DB, Wu PF, Wang JF, Han B. Sodium fluoride modulates caprine osteoblast proliferation and differentiation. J Bone Miner Metab. 2008;26(4):328-34.

33. Reeves PG, Nielsen FH, Fahey Jr GC. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr. 1993 Nov;123(11):1939-51.

34. Reich A, Jaffe N, Tong A, Lavelin I, Genina O, Pines M et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. J Appl Physiol.2005 Jun;98(6):2381-9.

35. Reid IR, Cundy T, Grey AB, Horne A, Clearwater J, Ames R et al. Addition of monofluorophosphate to estrogen therapy in postmenopausal osteoporosis: a randomized controlled trial. J Clin Endocrinol Metab. 2007 Jul;92(7):2446-52.

36. Reponen P, Sahlberg C, Munaut C, Thesleff I, Tryggvason K. High expression of 92-kD type IV collagenase (gelatinase B) in the osteoclast lineage during mouse development. J Cell Biol. 1994Mar;124(6):1091-102.

37. Sato H, Takeda Y. Proliferative activity, apoptosis, and histogenesis in the early stages of rat tooth extraction wound healing. Cells Tissues Organs. 2007;186(2):104-11.

38. Souza AP, Line SRP. The biology of matrix metalloproteinases. Rev FOB. 2002;10(1):1-6.

3 9 . S t e r n l i c h t M D , W e r b Z . H o w m a t r i x metalloproteinases regulate cell behavior. Annu Rev Cell Dev Biol. 2001;17:463-516.

40. Takahashi N, Yamana H, Yoshiki S, Roodman GD, Mundy GR, Jones SJ et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 1988 Apr;122(4):1373-82.

41. Vu TH, Shipley JM, Bergers G, Berger JE, Helms JA, Hanahan D et al. MMP-9/gelatinase B is a key regulator of growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes. Cell. 1998May;93(3):411-22.

4 2 . Z a m b u z z i W F , Y a n o C L , C a v a g i s A D , Peppelenbosch MP, Granjeiro JM, Ferreira CV. Ascorbate-induced osteoblast differentiation recruits distinct MMP-inhibitors: RECK and TIMP-2. Mol Cell Biochem. 2009 Feb;322(1-2):143-50.