Cover Laporan Praktikum Asf1

Click here to load reader

  • date post

    17-Jan-2016
  • Category

    Documents

  • view

    243
  • download

    0

Embed Size (px)

description

jhguiry,

Transcript of Cover Laporan Praktikum Asf1

TUGASBIOTEKNOLOGI

DISUSUN OLEH :

Anggota: 1. NANDA SURYANING ROHMA122210101032 2. YASMIN122210101034 3. MIA RISWANI122210101042 4. GALUH SINOARSIH122210101050Dosen : Evi Umayah Ulfa, S.Si., M.Si., Apt.

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS JEMBER2014

SOAL1. Sebutkan macam-macam vektor!2. Gambarkan 1 macam contoh vektor dan beri penjelasannya!3. Bagaimana cara memasukkan vektor dan DNA sisipan yang sudah bersatu kedalam inang?4. Bagaimana cara seleksi?5. Bagaimana cara deteksi?JAWABAN1. Vektor adalah Media untuk dan memperbanyak dan mentransformasi fragmen DNA. Persyaratan suatu vektor yaitu : Replikasi autonom dalam inang Berpenanda untuk seleksi Berposisi kloning tunggal Berberat molekul kecil Memiliki beberapa kopi pada setiap sel Tidak berkonjugasiContoh dari vektor yaitu :a. PLASMID Plasmid adalah dna ekstrakromosomal berbentuk sirkular tertutup, berpita ganda.Karakteristik plasmid yaitu : Replikasi (autonom) Ekstra kromosom Stabil Ukuran 1-300 kbJenis-jenis plasmid yaitu : F-plasmid: F adalah singkatan dari fertility, Plasmid ini mengandung perangkat gen-gen tra (fertilitaskonjugasi) R-plasmid: R adalah singkatan dari resistance (resistensiantibiotika) Col-plasmid, adalah plasmid yang mengandung gen yang mengkode produksi senyawa bakteriosin (ColE1 dari E.coli) Degradative plasmid, plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak umum seperti toluene atau asam salisilat (TOL dari Pseudomonas putida) Virulence plasmid, adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid :Tumour inducing plasmide)b. FAGEFage (bakteriofage) merupakan virus yang menginfeksi bakteri, tersusun atas molekul DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus). Fage Bentuk: kepala dan ekor Siklus hidup: (1) lisis, (2) lisogeni Ukuran genom: 49 kb, utas ganda Kedua ujung: situs cos(1) sirkuler, (2) situs pemotongan Fage M13 Bentuk: batang/filamen Ukuran genom: 6,407 kb, linier Perbanyakan: tanpa lisis sel inangc. COSMIDCosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen Cos. Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa bereplikasi didalam E. coli. Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan Hohn (1978). Karakteristik cosmid yaitu : Sekuen cos berasal dari phage yang merupakan sekuen berpita tunggal. Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri. Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA dengan ukuran 37 sampai 57 kb Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb.d. YAC (Yeast Artificial Chromosome) Kromosom buatan dari khamir Butuh kloning dengan kapasitas besar: Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi (pembekuan) darah pada jenis hemopilia A, memiliki ukuran 190 kb sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb. Dikembangkan oleh Burke et al (1987) Karakteristik penting plasmid YAC yaitu : Dikembangkan dari plasmid pBR322 Memiliki komponen gen yeast : SUP4, 7RP1, HIS3 dan URA3. Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin) Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeaste. BAC (Bacterial Artificial Chromosome) Kromosom buatan dari bakteri Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F Mengandung: oriS, repE F: replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel inang. parA and parB: pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas insersi Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb) Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar Konstruksi pustaka genom2. Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan plasmid sirkular terbuka, memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan terhadap ampisilin (Amp). Plasmid ini mengandung multy cloning site. Karena memiliki kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang), plasmid ini sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu. Plasmid pGEM-T Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert dalam suatu inang (Kendrew & Lawrence 1994). Selain itu, pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp. Ukuran tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar. Vektor berukuran kecil lebih mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al. 1991).

Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy.Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan bereplikasi sendiri di dalam sel. DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri. Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap. Ciri-ciri plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen, membawa informasi genetik, terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi dengan DNA kromosom, dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri. Ciri lain plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of replication) (Nicholl 1994) Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus). Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid. Hal ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid. Tersedianya promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik monokotil maupun dikotil. Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti pollen (Tzfira & Citovsky 2002). Selain itu, pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA. Gen gusA (-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira & Citovsky 2002).

Peta restriksi pCAMBIA 13033. Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu : Transformasi, ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks. Proses ini pertama ditemukan Frederick Griffith tahun 1982. Contoh : Streptococcus pnemoniaeu, Haemophillus, Bacillus. Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan sifatnya ke bakteri lain. Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi. Transduksi, pemindahan materi genetik dengan perantara virus. Virus dapat menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag. Ketika terbentuk virus baru, di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang diinfeksinya. Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel transduksi (transducing particle). Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan Jashua Lederberg. Konjugasi, merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke bakteri lain melalui suatu kontak langsung. Artinya, terjadi transfer DNA dari sel bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus. Ujung pilus akan melekat pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut. Kemampuan sel donor memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )4. Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putihatau blue-white screening adalah salah satu metode untuk mengidentifikasi keberhasilankloningdantransformasi. Metode ini merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi berdasarkan warna. Untuk proses seleksi ini, digunakan enzim-galaktosidase. -galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi genlacZ.Gen ini diatur ekspresinya olehoperon lac. Aktivatoruntuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya genlacZ.Mekanisme :Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim -galaktosidase, yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit, yaitu peptida dan peptida . Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional, enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal.Gen penyandi peptida biasanya terdapat padakromosom, sedangkan gen penyandi peptida terdapat pada plasmid.Bila hanya adapeptida yang diekspresikan oleh gen pada kromosom, maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal.Namun bila terjadi komplementasi olehpeptida , makalaktosaatauX-galdapat dipecah oleh enzim -galaktosidase yang terbentuk sempurna.Oleh karena itu, komplementasi dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi. Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase. DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih.X- GAL biruX GAL tidak diuraikan putih5. Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain:Elektroforesis gel (analisis migrasi, analisis restriksi , PCR) dan penentuan urutan DNA. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reactin (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara hibridisasi