Chapter 12E.8 Until End Terj.

29
Translated by NAJMIA RAHMA NIM 1005185 12E.8 Metode Representatif Metode 12.2 Penentuan Fluoxetine dalam Serum Deskripsi: Fluoxetine adalah nama lain dari obat antidepressant Prozac. Penentuan fluoxetine dan metabolisme norfluoxetine dalam serum merupakan bagian yang penting dari pengawasan penggunaannya dalam pengobatan. Ekstraksi padat diikuti oleh analisis HPLC menggunakan detektor fluoresens memberikan selektivitas dan batasan deteksi yang diperlukan. Gambar Struktur dari (a) fluoxetine dan (b) norfluoxetine. Langkah Kerja: Sejumlah antidepressant protriptyline ditambahkan ke dalam sampel serum sesuai dengan standar internal. 0,5 mL serum aliquot dilewatkan melalui selongsong ekstraksi fasa padat yang berisi partikel silika dengan fasa C 18 terikat. Setelah pencucian untuk menghilangkan pengotor dari sampel, unsur yang tersisa, mencakup kedua zat analit dan standar internal, dihilangkan dengan cara mencuci selongsong dengan 0,25 mL campuran HClO 4 0,1M dan asetonitril dengan perbandingan 25:75 v/v. 20 μL aliquot dimasukkan ke dalam kolom 15 cm × 4,6 mm dengan 5 μm C 8 yang terikat pada fasa diam. Campuran isokratik fasa gerak 37,5:62,5 v/v asetonitril dan air (berisi 1,5g tetrametilamonium perklorat dan 0,1 mL HClO 4 70% v/v) digunakan untuk mengelusi sampel. Digunakan detektor fluoresens untuk mendeteksi panjang gelombang eksitasi 235 nm dan panjang gelombang emisi 310 nm. Pertanyaan: 1. Apa maksud diikutsertakannya ekstraksi fasa padat di awal?

description

Chapter 12E.8 Until End Terj.

Transcript of Chapter 12E.8 Until End Terj.

Page 1: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Translated byNAJMIA RAHMA

NIM 1005185

12E.8 Metode RepresentatifMetode 12.2 Penentuan Fluoxetine dalam SerumDeskripsi: Fluoxetine adalah nama lain dari obat antidepressant Prozac. Penentuan fluoxetine dan metabolisme norfluoxetine dalam serum merupakan bagian yang penting dari pengawasan penggunaannya dalam pengobatan. Ekstraksi padat diikuti oleh analisis HPLC menggunakan detektor fluoresens memberikan selektivitas dan batasan deteksi yang diperlukan.

Gambar Struktur dari (a) fluoxetine dan (b) norfluoxetine.

Langkah Kerja: Sejumlah antidepressant protriptyline ditambahkan ke dalam sampel serum sesuai dengan standar internal. 0,5 mL serum aliquot dilewatkan melalui selongsong ekstraksi fasa padat yang berisi partikel silika dengan fasa C18 terikat. Setelah pencucian untuk menghilangkan pengotor dari sampel, unsur yang tersisa, mencakup kedua zat analit dan standar internal, dihilangkan dengan cara mencuci selongsong dengan 0,25 mL campuran HClO4 0,1M dan asetonitril dengan perbandingan 25:75 v/v. 20 μL aliquot dimasukkan ke dalam kolom 15 cm × 4,6 mm dengan 5 μm C8 yang terikat pada fasa diam. Campuran isokratik fasa gerak 37,5:62,5 v/v asetonitril dan air (berisi 1,5g tetrametilamonium perklorat dan 0,1 mL HClO4 70% v/v) digunakan untuk mengelusi sampel. Digunakan detektor fluoresens untuk mendeteksi panjang gelombang eksitasi 235 nm dan panjang gelombang emisi 310 nm.

Pertanyaan:1. Apa maksud diikutsertakannya ekstraksi fasa padat di awal?

Injeksi serum secara langsung tidak baik selama material partikulat dalam matriks sampel memungkinkan kolom tersumbat. Kemudian, beberapa konstitun sampel mungkin menghisap terlalu kuat ke fasa diam, hal demikian akan menyebabkan penurunan fungsi kolom. Jadi, meskipun HPLC mampu memisahkan dan menganalisis campuran kompleks, proses analisis masih kesulitan jika terdapat banyak konstituen untuk menyediakan zat analit yang cukup. Ekstraksi fasa padat berguna dalam membersihkan sampel sebelum menggunakan HPLC.

2. Satu keuntungan menggunakan analisis HPLC adalah injektor loop seringkali mengeliminasi kebutuhan standar internal. Mengapa standar internal digunakan dalam analisis ini? Asumsi apa yang harus digunakan mengenai standar internal?

Page 2: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Standar internal digunakan karena kesulitan pemasukkan dalam ekstraksi fasa padat. Sebagai contoh, volume serum yang diambil untuk ekstraksi fasa padat dan volume pelarut yang digunakan untuk menghilangkan analit dan standar internal sangat kecil (sekitar 0,5 mL dan 0,25 mL). Ketelitian dan akurasi dengan volume tersebut tidak dapat diukur sebaik ketika menggunakan volume yang lebih besar. Karena itu, analit dan standar internal pasti diasumsikan sebagai penahan untuk besaran yang sama selama mencuci selongsong, dan juga harus diasumsikan sebagai penyadap untuk besaran yang sama selama elusi terakhir.

3. Jika puncak fluoxetine dan protriptyline tidak cukup terpisahkan, apakah akan dilakukan pengubahan terhadap fasa gerak untuk meningkatkan pemisahan?Penurunan sejumlah asetonitril dan peningkatan sejumlah air dalam fasa gerak akan meningkatkan waktu retensi, dengan demikian, pengubahan untuk fasa gerak merupakan resolusi yang lebih baik.

12E.9 EvaluasiKetika digabungkan dengan kromatografi gas, HPLC hanya mendapatkan perbedaan dalam skala operasi; akurasi; presisi; sensitivitas; selektivitas; dan waktu, biaya, seta perlengkapan yang dibutuhkan. Injeksi volume dalam HPLC secara signifikan lebih luas dibanding pada GC karena kapasitas kolom HPLC yang lebih baik. Presisi HPLC seringkali lebih baik berkaitan dengan penggunaan loop injektor yang rutin karena HPLC tidak dibatasi untuk analit volatil, jarak senyawa yang dianalisis agak sedikit lebih lebar dibanding GC. Kolom kapiler GC memiliki plat teori yang tersedia lebih baik dalam memecahkan kekuatan campuran kompleks.

12F Kromatografi Adsorpsi Cair-PadatPada kromatografi adsorpsi cair-padat (LSC), packing kolom juga dapat digunakan senagai fasa diam. Pada Tswett, fasa diam berupa CaCO3, tapi kolom modern menggunakan pori-pori 3–10 μm partikel silika atau alumina. Karena fasa diamnya polar, maka fasa gerak biasanya pelarut nonpolar atau sedikit polar. Fasa gerak yang khas termasuk heksana, isooktana, dan metilen klorida. Urutan elusi dari waktu retensi yang pendek ke waktu retensi yang panjang adalah

olefin < hidrokarbon aromatik < eter < ester, aldehid, keton< alkohol, amina < amida < asam karboksilat

Untuk kebanyakan sampel kromatografi cair-padat tidak memberikan keuntungan spesial daripada kromatografi cair-cair (LLC). Satu pengecualian, untuk analisis isomer dimana LLC lebih unggul apabila digunakan. Gambar 12.32 memperlihatkan kekhasan pemisahan dengan LSC dari dua amfetamin pada kolom silika menggunakan campuran metilen klorida dan metanol dengan perbandingan 80:20 dan NH4OH 1% sebagai fasa gerak. Fasa diam yang digunakan biasanya bersifat nonpolar, seperti charcoal.

12G Kromatografi Penukar IonKromatografi penukar ion (IEC) memiliki fasa diam berupa penyilangan resin polimer, biasanya divinilbenzena disilangkan dengan polistirena, dengan gugus fungsi ionik. Ion yang berlawanan dengan muatannya dapat bergerak dan dapat dipindahkan oleh ion-ion yang

Page 3: Chapter 12E.8 Until End Terj.

berlawanan dengan baik untuk tempat penukaran. Resin penukar ion dibagi menjadi empat kategori: penukar kation asam kuat; penukar kation asam lemah; penukar anion basa kuat; dan penukar anion basa lemah.

Kolom: Silika adsorbosfer, 3 μm, 150 × 4,6 mmFasa Gerak: Metilen klorida:

Metanol dengan 1% NH4OH (80:20)Laju Aliran: 1,25 mL/minDetektor: UV pada 280 nm

Gambar 12.32 Contoh aplikasi kromatografi cair-cair dengan analisis amfetamin.

Penukar kation asam kuat termasuk gugus fungsi asam sulfonat yang berbentuk anion dan kapasitas penukar ionnya berada dalam pelarut-pelarut asam kuat. Gugus fungsi untuk penukar kation asam lemah diprotonasi pada pH kurang dari 4, dengan demikian gugus-gugus fungsi tersebut kehilangan kapasitas penukarnya. Penukar anion basa kuat menggunakan amina quartener, sehingga dapat menahan muatan positif dalam larutan basa kuat. Penukar anion basa lemah meninggalkan proton hanya pada pH yang hampir dasar. Dibawah kondisi basa lebih, penukar anion basa lemah kehilangan muatan positif dan kapasitas penukarnya.

Page 4: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Gambar 12.33 Struktur dari stirena, divinilbenzena, dan stirena-divinilbenzena co-polimer termodifikasi sebagai resin penukar ion. Tempat penukaran, diindikasikan dengan R, kebanyakan pada posisi para dan tidak terikat pada seluruh kesatuan stirena.

Tabel 12.5 Contoh Resin-Resin Penukar Ion yang Biasa DigunakanJenis Gugus Fungsi Contoh

penukar kation asam kuat asam sulfonat –SO3-

–CH2CH2SO3-

penukar kation asam lemah asam karboksilat –COO-

–CH2COO-penukar anion basa kuat amina quartener –CH2N(CH3)3

+

–CH2CH2N(CH2CH3)3+

penukar anion basa lemah amina – NH3+

–CH2CH2NH(CH2CH3)2+

Reaksi penukar ion kation monovalensi, M+, pada tempat penukar asam kuat adalah

–SO3-–H+(s) + M+ (aq) –SO3

-–M+(s) + H+(aq)

Konstanta kesetimbangan untuk reaksi penukar ion ini, dikenal dengan istilah koefisien selektivitas, yakni

K ={–SO3

-–M+}[H+]{–SO3

-–H+} + [M+]

dimana tanda {} menunjukkan konsentrasi permukaan. Perubahan persamaan 12.31 menunjukkan bahwa rasio distribusi untuk reaksi penukar adalah

D =jumlah M+ dalam fasa diamjumlah M+ dalam fasa gerak

={–SO3

-–M+}[M+]

= K{–SO3

-–H+}[H+]

12.31

Page 5: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Resin penukar ion disatukan ke dalam kolom HPLC sebagai manik-manik pori-pori polimer ukuran mikro atau oleh pelapis resin pada partikel pori-pori silika. Selektivitas agak bergantung pada resin, baik tempat penukar kuat atau lemah dan pada luas penyilangan. Luas penyilangan sangat penting karena berguna dalam mengontrol permeabilitas resin dan akses tempat penukaran. Urutan selsktivitas untuk resin penukar kation asam kuat dengan menurunnya D, adalah

AL3+ > Ba2+ > Pb2+ >Ca2+> Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+

> Ag+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+

Catatan, bahwa ion-ion muatan tinggi terikat lebih kuat daripada ion-ion muatan rendah. Di dalam kelompok ion-ion dengan muatan yang serupa, ion-ion dengan radius hidrat lebih kecil lebih terikat polar secara kuat. Urutan untuk penukar anion basa kuat adalah

SO42- > I- > HSO4

- > NO3- > Br- > NO2

- > Cl- > HCO3- > CH3COO- > OH- > F-

Ion-ion dengan muatan besar dan radius hidrat yang kecil, pH dan komposisi ioniklah yang menentukan waktu retensi zat terlarut. Gradien elusi memungkinkan apabila kekuatan ion atau pH fasa gerak berubah seiring dengan bertambahnya waktu. Sebagai contoh, pemisahan kation IEC dapat menggunakan larutan HCl sebagai fasa gerak. Kenaikan kecepatan laju elusi konsentrasi HCl untuk menahan kation secara kuat, karena konsentrasi H+ lebih tinggi, maka kation ini mengikuti HCl untuk berkompetisi tempat penukar ion secara sukses.

Kolom penukar ion dapat dimasukkan ke dalam instrumen HPLC. Detektor yang digunakan mengukur konduktivitas fasa gerak sebagai eluen dari kolom. Konsentrasi elektrolit yang tinggi dalam fasa gerak menjadi masalah karena ion-ion fasa gerak mendominasi konduktivitas. Sebagai contoh, jika larutan HCl encer digunakan sebagai fasa gerak, kehadiran konsentrasi yang tinggi dari H3O+ dan Cl- menghasilkan konduktivitas yang dapat mencegah deteksi elusi analit dari kolom.

Untuk meminimalisasi kontribusi fasa gerak untuk konduktivitas, kolom ion suppresor diletakkan diantara kolom analitik dan detektor. Kolom ini secara selektif menghilangkan ion-ion elektrolit fasa gerak tanpa menghilangkan ion-ion zat terlarut. Sebagai contoh, dalam kromatografi penukar ion kation menggunakan larutan HCl encer sebagai fasa gerak, kolom suppresor terdiri dari resin penukar anion. Reaksi penukaran ini

H+(aq) + Cl-(aq) + Resin+–OH- Resin+–Cl- + H2O(l)

menggantikan ion HCl dengan H2O. Katin analit terelusi sebagai garan hidroksida sebagai ganti garam klorida. Proses serupa digunakan dalam kromatografi penukar ion anion dimana resin penukar ion kation ditempatkan dalam kolom suppresor.

Ion suppresor dibutuhkan ketika menggunakan fasa gerak yang terdiri dari ion-ion dengan konsentrasi tinggi. Kromatografi ion kolom tunggal, dimana kolom ion suppresor tidak dibutuhkan, memungkinkan jika konsentrasi ion-ion dalam fasa gerak dapat diminimalisir. Biasanya hal ini berlangsung menggunakan resin fasa diam dengan kapasitas yang rendah untuk penukar ion dan fasa gerak dengan ion-ion konsentrasi kecil. Karena konduktivitas berkaitan dengan fasa gerak cukup kecil, maka memungkinkan untuk mengawasi perubahan dalam konduktivitas sebagai elusi analit dari kolom.

Detektor absorban UV/Vis dapat digunakan jika ion-ion zat terlarut menyerap radiasi ultraviolet atau sinar tampak. Alternatifnya, larutan yang tidak menyerap radiasi pada rentang UV/Vis dapat dideteksi secara tidak langsung jika fasa gerak terdiri dari UV/Vis jenis

Page 6: Chapter 12E.8 Until End Terj.

penyerap. Pada kasus ini, ketika zat terlarut melewati detektor, penurunan pada absorbansi diukur pada detektor.

12H Kromatografi Eksklusi UkuranDalam kromatografi eksklusi ukuran, atau disebut kromatografi eksklusi molekulaer

atau kromatografi perembesan gel, pemisahan didasari oleh kemampuan zat terlarut untuk masuk ke dalam pori-pori kolom packing. Solut yang lebih kecil membutuhkan bayak waktu untuk terelusi dari kolom.

Selektivitas ukuran packing partikuler tidak terhingga, tapi terbatas pada rentang sedang. Semua solut secara signifikan lebih kecil dibandingkan pori-pori yang melewati seluruh volume kolom dan mengelusi secara serentak, dengan volume retensi, VI ,

Vr = Vi + V0

dimana Vi volume fasa gerak yang menempati pori-pori material packing, dan V0 adalah volume fasa gerak sisa dalam kolom. Ukuran maksimal untuk persamaan 12.32 adalah packing batasan inklusi material, atau batasan perembesan.

12.32

Page 7: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Gambar 12.34Contoh aplikasi kromatografi penukar ion untuk analisis (a) anion-anion anorganik, (b) kation-kation anorganik, (c) antifreeze, dan (d) vitamin.

Page 8: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Gambar 12.35Contoh aplikasi kromatografi eksklusi ukuran untuk analisis protein. Pemisahan pada (a) penggunaan kolom tunggal; dan (b) penggunaan pada tiga kolom, menyediakan rentang yang lebar pada selektivitas ukuran.

Semua solut terlalu besar untuk masuk ke dalam pori-pori elusi secara serentak dengan waktu retensi

Vi = V0

Persamaan 12.33 menunjukkan packing limit eksklusi material.Diantara limit inklusi dan limit eksklusi, masing-masing solut melewatkan sejumlah

waktu dalam pori yang proporsional dengan ukurannya. Volume retensi untuk solut ini adalah

Vr = V0 + DVi

dimana D adalah ration distribusi solut yang memiliki rentang dari 0 pada limit eksklusi sampai 1 pada limit inklusi. Validitas persamaan 12.34 membutuhkan ukuran eksklusi hanya menjadi interaksi antara solut dan fasa diam bertanggung jawab pada pemisahan. Di akhir pemisahan, partikel silika yang digunakan untuk eksklusi ukuran dinonaktifkan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, dan resin polimer disintesis tanpa tempat penukaran.

Kromatografi aksklusi ukuran menyediakan laju yang cepat untuk memisahkan molekul-molekul yang lebih besar.

Aplikasi penting lainnya adalah untuk menetapkan massa molekul. Kurva kalibrasi log (massa molekul) versus Vr disiapkan diantara limit eksklusi dan limit inklusi. Karena volume retensi pada beberapa derajat merupakan fungsi ukuran dan bentuk solut, maka selayaknya keakuratan penentuan massa molekul sangat mungkin hanya jika standar dipilih sedcara hati-hati untuk meminimalisasi efek dari bentuk solut.

Kromatografi eksklusi ukuran dapat dilakukan menggunakan instrumen HPLC konvensional, menggantikan kolom HPLC dengan kolom eksklusi ukuran yang tepat. Detektor UV/Vis adalah yang umum digunakan untuk memperoleh kromatogram.

12.33

12.34

Page 9: Chapter 12E.8 Until End Terj.

12I Kromatografi Fluida SuperkritisMeskipun penting, kromatografi gas dan kromatografi cair tidak dapat digunakan untuk memisahkan dan menganalisis seluruh jenis sampel. Kromatografi gas, terutama sekali, ketika menggunakan kolom kapiler, memberikan pemisahan dengan cepatdan resolusi yang baik sekali. Aplikasi ini dibatasi untuk analisis volatil atau analit yang dapat dijadikan volatil dengan menngubahnya menjadi derivat yang pantas. Kromatografi cair dapat digunakan untuk memisahkan zat terlarut yang lebih besar, kebanyakan menggunakan detektor (UV, fluoresens, dan elektrokimia) yang tidak merespon secara keseluruhan seperti pada detektor ionisasi lidah api yang biasa digunakan dalam kromatografi gas.

Kromatografi fluida superkritis (SFC) memberikan alternatif yang berguna untuk kromatografi gas dan kromatografi cair untuk beberapa sampel. Fasa gerak dalam kromatografi fluida superkritis berupa gas pada suhu dan tekanan yang melebihi titik kritisnya. Pada kondisi ini fasa gerak tidak berapa dalam fasa gas maupun cair. Malahan, fasa gerak berupa cairan superkritis yang sifatnya berada pada pertengahan antara gas dan cair. Secara rinci, fluida superkritis memiliki viskositas yang sama dengan gasnya, sehingga fluida tersebut dapat bergerak melewati kapiler ataupun kolom packing tanpa membutuhkan tekanan tinggi seperti pada HPLC. Waktu analisis dan resolusi biasanya lebih baik dibandingkan waktu analisis dan resolusi pada HPLC konvensional. Kepadatan fluida superkritis lebih dekat kepada cairan, laporan ini dijadikan fungsi sebagai pelarut. Fasa gerak dalam SFC berjalan seperti fasa gerak cair dalam HPLC dan seperti fasa gerak gas dalam GC.

Fasa gerak yang biasa digunakan dalam kromatografi fluida superkritis adalah CO2. Pada suhu kritisnya, 31 0C, dan tekanan kritis, 72,9 atm, relatif lebih mudah untuk tercapai. Walaupun superkritis CO2 merupakan pelarut yang baik untuk organik nonpolar, tapi kurang berguna untuk pelarut polar. Sebaliknya, modifikasi organik, seperti metanol, meningkatkan kekuatan elusi fasa gerak. Berikut adalah fasa gerak yang biasa digunakan disertai informasi suhu dan tekanan kritisnya.

Tabel 12.6 Sifat-sifat Khas Gas, Cairan, dan Fluida Superkritis

FasaKerapatan

(g cm-3)Viskositas(g cm-1 s-1)

Koefisien Difusi(cm2 s-1)

Gas ≈ 10-3 ≈ 10-4 ≈ 10-1

Fluida superkritis ≈ 0,1–1 ≈ 10-4–10-3 ≈ 10-4–10-3

Cairan ≈ 1 ≈ 10-2 < 10-5

Instrumensasi penting untuk kromatografi fluida superkritis sama seperti instrumensasi standar GC atau HPLC. Gradien elusi, sama dengan pada HPLC, dapat dihindari dengan mengubah tekanan atas waktu. Hasil perubahan dalam kerapatan fasa gerak mempengaruhi kekuatan pelarutnya. Pendeteksian dapat dilakukan menggunakan detektor GC standar atao detektor HPLC.

Kromatografi fluida superkritis dapat ditemukan dalam banyak aplikasi analisis polimer, bahan bakar fosil, lilin, obat-obatan, dan produksi makanan.

Tabel 12.7 Sifat-Sifat Titik Kritis untuk Beberapa Fluida Superkritis

SenyawaSuhu Kritis

(0C)Tekanan Kritis

(atm)karbon dioksida 31.3 72.9etana 32.4 48.3nitrat oksida 36.5 71.4

Page 10: Chapter 12E.8 Until End Terj.

ammonia 132.3 111.3dietil eter 193.6 36.3isopropanol 235.3 47.0metanol 240.5 78.9etanol 243.4 63.0air 374.4 226.8

Gambar 12.38Contoh aplikasi kromatografi fluida superkritis untuk analisis trigliserida.

12J ElektroforesisElektroforesis merupakan teknik pemisahan berdasarkan kemampuan solut untuk bergerak melewati media konduktif, biasanya cairan penyangga, dibawah pengaruh medan listrik. Kation bergerak ke arah katoda yang bermuatan negatif, sedangkan anion bergerak ke arah anoda yang bermuatan positif. Ion-ion bermuatan besar dan ion-ion bermuatan kecil, atau yang memiliki ukuran rasio muatan lebih besar, bergerak pada kecepatan yang tinggi dibanding ion-ion yang lebih besar atau ion-ion bermuatan lebih rendah. Ion netral dapat dilewati medan listrik sehingga tertinggal pada fasa diam. Perbedaan pada laju migrasi memungkinkan untuk melakukan pemisahan pada analisis campuran kompleks.

Ada beberapa macam elektroforesis. Pada elektroforesis lemping gel, penyangga pengkonduksi ditahan di dalam pori-pori gel agarose atau polyacrylamide. Lemping-lemping terbentuk dengan mengalirkan gel diantara dua plat gelas yang terpisah oleh ruang-ruang kosong. Ketebalannya adalah 0,25–1 mm. Elektroforesis gel adalah teknik yang penting dalam biokimia, dimana seringkali digunakan dalam peruntunan DNA. Meskipun elektroforesis gel sangat baik digunakan dalam analisis campuran kompleks, namun kurang berguna untuk analisis quantitatif.

Pada elektroforesis kapiler, penyangga penkonduksi ditahan di dalam pipa kapiler yang diameter di dalamnya sekitar 25–75 μm. Sample diinjeksikan ke dalam salah satu ujung pipa kapiler. Ketika sampel berjalam melewati kapiler, komponen-komponen dalam sampel terpisah dan mengelusi dari kolom pada waktu yang berbeda. Hasil elektroferogram terlihat

Page 11: Chapter 12E.8 Until End Terj.

sama dengan kromatogram pada GC atau HPLC, dan dapat digunakan baik dalam memperoleh analisis kualitatif maupun quantitatif.

12J.1 Teori Elektroforesis KapilerKomponen sampel yang bergerak dibawah medan listrik memiliki dua macam mobilitas: mobilitas elektroforetik dan mobilitas elektroosmotik. Mobilitas elektroforetik adalah respon dari solut terhadap medan listrik, sedangkan mobilitas elektroosmotik, yang terjadi ketika larutan penyangga bergerak melewati kapiler, merupakan respon terhadap medan listrik.

Mobilitas elektroforetik Kecepatan dimana solut bergerak karena respon terhadap medan listrik disebut kecepatan elektroforetik, νep

νep = μepE

dimana μep adalah mobilitas elektroforetik solut dan E adalah besarnya medan listrik. Mobilitas elektroforesis solut ditentukan oleh

μep =q

6πηr

dimana q adalah muatan solut, η adalah viskositas pelarut penyangga, dan r adalah jari-jari solut. Dengan menggunakan persamaan 12.35 dan 12.36, dapat dibuat kesimpulan mengenai kecepatan elektroforetik solut. Mobilitas elektroforetik dan kecepatan elektroforetik merupakan yang terbesar untuk muatan solut yang tinggi dan ukuran solut yang lebih kecil. Karena q bernilai positif untuk kation dan negatif untuk anion, maka sampel ini bergerak dalam arah yang berlawanan. Jenis yang netral, dimana q adalah 0, memiliki kecepatan elektroforetik 0.

Mobilitas Elektroosmotik Ketika medan listrik digunakan pada kapeler yang terisi oleh cairan penyangga, diharapkan ion-ion penyangga bergerak dalam merespon mobilitas elektroforetiknya. Karena pelarut H2O adalah netral, maka diharapkan dapat tertinggal pada fasa diam. Pada kondisi normal, larutan penyangga bergerak melewati katoda, fenomena ini disebut arus elektroosmotik.

Elektroosmosis terjadi karena dinding-dinding pipa kapiler bermuatan listrik. Permukaan kapiler silika terdiri dari sejumlah besar gugus silanol (Si–OH). Pada pH yang lebih besar dari 2 atau 3, gugus silanol berionisasi untuk membentuk muatan negatif ion silanat (Si–O–). Katiom penyangga berinteraksi dengan ion-ion silanat membentuk lapisan dalam atau lapisan tetap. Kation lain yang terikat secara lemah membentuk lapisan luar atau lapiasan gerak. Lapisan-lapisan ini disebut lapisan ganda. Kation-kation pada lapisan terluar bergerak melewati katoda. Karena kation-kation ini terlarut, maka larutan tertarik terus menerus menghasilkan arus elektroosmotik.

12.35

12.36

Page 12: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Gambar 12.39Diagram skematik memperlihatkan sumber arus elektroosmotik.

Kecepatan arus elektroosmotik, νeof, merupakan fungsi dari besarnya medan listrik dan molitas elektroosmotik larutan penyangga, μeof.

νeof = μeofE

Mobilitas elektroosmotik didefinisikan sebagai

μeof =εζ

4πη

dimana ε adalah konstanta dielektrik, ζ adalah potensial zeta, dan η adalah viskositas larutan penyangga.

Potensial zeta menunjukkan peran penting dalam menentukan kecepatan arus elektroosmotik. Ada dua faktor yang menentukan potensial zeta dan kecepatan elektroosmotik; (a) potensial zeta secara langsung proporsional terhadap muatan yang ada pada dinding kapiler, dengan kerapatan yang lebih tinggi dari ion-ion silanat yang sesuai dengan potensial zeta yang lebih besar. Sebagai contoh, dibawah pH 2, terdapat sedikit ion-ion silanat, oleh karenanya, potensial zeta dan kecepatan arus elektroosmotik meningkat. Jika pH meningkat, baik potensial zeta dan kecepatan arus elektroosmotik juga meningkat. (2) Potensial zeta proporsional terhadap ketebalan lapisan ganda. Peningkatan kekuatan ionik larutan penyanggah memberikan konsentrasi yang lebih besar pada kation-kation.

Gambar 12.40Skema tersebut menunjukkan perbandingan arus untuk (a) GC dan HPLC, dan (b) elektroforesis.

12.37

12.38

Page 13: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Dibawah kondisi normal, terdapat hubungan berikut

(νtot)kation > νeof

(νtot)anion < νeof

(νtot)netral = νeof

Dengan demikian, kation berelusi terlebih dahulu dalam urutan yang sesuai dengan mobilitas elektroforetik, dengan kation bermuatan tinggi mengelusi sebelum kation yang lebih besar pada muatan yang rendah. Jenis netral berelusi sebagai pita tunggal dengan latu elusi sesuai dengan kecepatan arus elektroosmotik. Yang terelusi terakhir adalah komponen anion dengan anion bermuatan tinggi memiliki waktu elusi yang lebih lama.

Waktu Migrasi Kecepatan total solut

νtot =ltm

dimana l adalah jarak perjalanan solut diantara titik injeksinya dengan detektor, dan tm adalah waktu migrasi. Karena

νtot = μtotE = (μep + μeof)E

setelah diatur kembali

tm =l

(μep + μeof)E

Besarnya medan listrik adalah

E =VL

dimana V adalah potensial yang digunakan, dan L adalah panjang pipa kapiler. Substitusi persamaan 12.40 ke dalam persamaan 12.39 menunjukkan

tm =lL

(μep + μeof)V

Efisiensi Efisiensi elektroforesis kapiler digolongkan ke dalam jumlah plat teori, N, seperti pada GC atau HPLC. Pada elektroforesis kapiler, jumlah plat teori ditentukan dengan

N =(μep + μeof)V

2D

dimana D adalah koefisien difusi solut. Dari persamaan 12.42 dapat dilihat bahwa efisiensi pemisahan elektroforesis kapiler meningkat dengan naiknya tegangan. Kemudian, peningkatan kecepatan arus elektroosmotik menambah efisiensi. Solut dengan mobilitas

12.41

12.39

12.40

12.42

Page 14: Chapter 12E.8 Until End Terj.

elektroforesis yang lebih besar (dalam arah yang sama dengan arus elektroosmosis) memiliki efisiensi yang bsar; dengan demikian, solut dengan muatan lebih tinggi tidak hanya terelusi lebih dulu, namun juga memiliki efisiensi yang lebih besar. Efisiensi dalam elektroforesis kapiler memiliki panjang kapiler yang bebas. Plat teori yang terhitung sekitar 100.000–200.000 untuk elektroforesis kapiler.

Selektivitas Dalam kromatografi, selektivitas didefinisikan sebagai rasio faktor kapasitas untuk dua solut. Pada elektroforesis kapiler, yang sejalan dengan ungkapan selektivitas adalah

α =μep,1

μep,2

dimana μep,1 dan μep,2 adalah mobilitas elektroforetik untuk solut 1 dan 2, yang secara berturut-turut dipilih berdasarkan α ≥1. Selektivitas sering ditingkatkan dengan menyesuaikan pH larutan penyanggah. Sebagai contoh, NH4

+ merupakan asam lemah dengan pKa 9,24. Pada pH 9,24 konsentrasi NH4

+ dan NH3 adalah sama. Menurunkan pH dibawah 9,24 meningkatkan mobilitas elektroforetik karena fraksi yang lebih besar dari solut hadir sebagai kation NH4

+. Di sisi lain, peningkatan pH diatas 9,24 meningkatkan ukuran kenetralan NH3, tapi menurunkan mobilitas elektroforesis.

Resolusi Resolusi antara dua solut adalah

R =0,177(μep,2 + μep,2)V1/2

√(μ avg+μ eof )D

dimana μavg adalah rata-rata mobilitas elektroforesis untuk dua solut. Dengan meningkatkan tegangan dan menurunnya kecepatan arus elektroosmotik, maka resolusi meningkat.

Gambar 12.41Skema diagram untuk elektroforesis kapiler. Sampel dan sumber reservoir dibuka ketika melakukan enjeksi.

12J.2 InstrumensasiPipa Kapiler Kebanyakan pipa kapiler dibuat dari silika yang dilapisi 20–35 μm poliimida untuk memberikan kekuatan mekanik. Diameter dalam berkisar 25–75 μm, dengan diameter luar sebesar 200–375 μm.

12.43

Page 15: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Gambar 12.42Skema diagram memperlihatkan bagian penyilangan kolom kapiler pada elektroforesis kapiler.

Kaliber sempit dari kolom kapiler dan ketebalan relatif dinding kapiler adalam penting. Ketika medan listrik digunakan untuk kapiler berisi medium konduktif seperti larutan penyanggah, aliran arus melewati kapiler. Arus ini menuju Joule heating, yakni pemanasan larutan konduktif yang berkaitan dengan lintasan arus listrik yang melewati larutan.

Pemasukan Sampel Mekanisme pemasukan sampel pada elektroforesis kapiler sedikit berbeda dari yang digunakan pada GC maupun HPLC. Dua jenis injeksi yang biasa digunakan: injeksi hidrodinamik dan injeksi elektrokinetik. Kedua pipa kapiler diisi dengan larutan penyanggah, dan yang lainnya ditempatkan dalam botol sampel.

Injeksi hidridinamik menggunakan tekanan untuk memberi gaya pada sebagian kecil sampel ke dalam pipa kapiler. Untuk memasukkan sampel secara hidrodinamik, tekanan yang berbeda digunakan melewati kapiler dengan memberi tekanan udara pada botol sampel atau dengan menggunakan vakum untuk reservoir. Volume sampel yang dimasukkan (dalam liter) ditunjukkan oleh persamaan berikut

Vinj =ΔPd4πt128ηL

× 103

dimana ΔP adalah prbedaan tekanan yang melewati kapiler dalam paskal, d adalah diameter kapiler dalam (meter), t adalah waktu yang digunakan tekanan dalam detik, η adalah viskositas larutan penyanggah dalam kilogram per meter per detik (kg m-1 s-1), dan L adalah panjang pipa kapiler dalam meter. Faktor 103 mengubah besaran meter kubik ke liter.

CONTOH 12.9Injeksi hidrodinamik dibuat dengan menggunakan perbedaan tekanan 2.5×103 Pa (sekitar 0.02 atm) pada 2 s dengan panjang pipa kapiler 75 cm dan diameter dalam 50 μm. Asumsi bahwa viskositas larutan penyanggah adalah 10–3 kg m–1 s–1, berapa volume sampel yang terinjeksi?

JAWAB

Vinj =(2.5×103 Pa)(50 × 10–6 m)4(3.14)(2 s)

(128)(0.001 kg m–1 s–1)(0.75m)× 103 = 1 × 10-9 L = 1 nL

12.44

Page 16: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Karena sumbat injeksi sampel adalah silinder, maka panjangnya, lplug, dihitung menggunakan persamaan untuk volume silinder.

V = πr2lplug

Dengan demikian,

lplug =V

πr2 =(1 × 10-9 L)(10-3 m3/L)(3.14)(25 × 10-6 m)2 = 5 × 10-4 m = 0.5 mm

Injeksi elektrokinetik dibuat dengan menempatkan kapiler dan anoda ke dalam botol sampel dan dengan singkat menggunakan medan listrik. Mol solut yang dimasukkan ke dalam kapiler, ninj, ditentukan dengan

ninj = πCtr2(μep + μeof)Eκbuf

κsamp

dimana C adalah konsentrasi solut dalam sampel, t adalah waktu yang dibutuhkan medan listrik, r adalah jari-jari kepiler, μep adalah mobilitas elektroforetik solut, μeof adalah mobilitas elektroosmotik, E adalah medan listrik yang dibutuhkan, dan κbuf serta κsamp adalah konduktivitas larutasn penyanggah dan sampel. Solut dengan mobilitas elektroforetik terbesar dimasukkan dalam jumlah lebih besar dibanding solut dengan mobilitas elektroforetik terkecil.

Ketika konsentrasi solut dalam sampel terlalu kecil untuk analisis yang dapat dipercaya, hal ini memungkinkan untuk memasukkan solut dengan cara meningkatkan konsentrasi dalam pipa kapiler. Metode injeksi ini disebut stacking, yakni metode memusatkan solut dalam elektroforesis kapiler setelah injeksi ke dalam kolom kapiler.

Gambar 12.43Skema diagram demonstrasi stacking.

Menerapkan Medan Listrik Pergerakan dalam elektroforesis terjadi melalui respon terhadap penerapan medan listrik. Kemampuan untuk menerapkan medan listrik yang besar

12.45

Page 17: Chapter 12E.8 Until End Terj.

adalah penting karena tegangan yang lebih tinggi memerlukan waktu analisis yang lebih pendek, pemisahan yang lebih efisien, dan resolusi yang lebih baik.

Detektor Kebanyakan detektor yang digunakan dalam HPLC juga digunakan dalam elektroforesis kapiler. Diantaranya detektor yang biasa digunakan adalah yang berdasarkan kemampuan menyerap radiasi UV/Vis, fluoresens, konduktivitas, amperometer, dan spektrometri massa.

Detektor UV/Vis adalah yang paling populer, karena absorbansinya proporsional dengan panjang alur, diameter pipa kapiler yang lebih kecil memberi sinyal yang lebih kecil dibandingkan pada HPLC. Batas deteksi sekitar 10–7 M.

Gambar 12.44Skema diagram dari deteksi on-kolom menggunakan spektroskopi absorpsi UV/Vis.

Batas deteksi yang lebih baik diperoleh menggunakan fluoresens, terutama sekali ketika menggunakan laser seperti pada sumber eksitasi. Ketika menggunakan deteksi fluoresens, bagian ang kecil pelindung kapiler dilepas dan sinar laser terfokus pada bagian dalam pipa kapiler. Emisi terhitung pada sudut 900 terhadap laser. Karena laser menyediakan sumber radiasi yang kuat yang dapat terfokuskan pada titik yang terbatas, maka batas deteksi hanya sebesar 10–16 M.

Solut yang tidak diserap radiasi UV/Vis atau fluoresens dapat dideteksi dengan detektor lain.

Page 18: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Tabel 12.8 Ciri-Ciri Detektor yang Digunakan pada Elektroforesis KapilerBatas Deteksi

Deteksi On-KolomDetektor Selektivitas

Mol Terinjeksi

Molaritas

absorbansi UV/Vis

solut harus memiliki kromofor absorb uv/vis

10–13–10–16 10–5–10–7 ya

absorbansi tak langsung

universal 10–12–10–15 10–4–10–6 ya

fluoresenssolut harus efisiensi quantum fluoresens yang baik

10–15–10–17 10–7–10–9 ya

fluoresens lasersolut harus efisiensi quantum fluoresens yang baik

10–18–10–20 10–13–10–16 ya

spektrometer massa

universal ketika moitoring semua ion-ion; selektif ketika monitoring ion tunggal

10–16–10–17 10–8–10–10 no

amperometersolut harus dapat melakukan oksidasi atau reduksi

10–18–10–19 10–7–10–10 no

kondusktivitas universal 10–15–10–16 10–7–10–9 noradiometer solut harus radioaktif 10–17–10–19 10–10–10–12 ya

12J.3 Metode Elektroforesis KapilerElektroforesis Zona Kapiler Bentuk sederhana dari elektroforesis kepiler adalah elektroforesis zona kapiler (CZE). Dalam CZE pipa kapiler diisi dengan larutan penyanggah dan setelah menunggu sampel, ujung pipa kepiler ditempatkan di reservoir yang terdiri dari lerutan penyanggah tambahan. Pada kondisi normal, ujung kapiler yang terdiri dari sampel berupa anoda, dan solut bergerak melewati katoda pada kecepatan yang ditentukan oleh mobilitas elektroforetiknya dan arus elektroosmotik.Kation terelusi pertama, kemudian diikuti kation yang lebih besar dengan muatan yang kecil. Jenis netral terelusi sebagai pita tunggal. Di akhir, anion adalah yang terakhir terelusi diikuti dengan anion yang lebih negatif.

Page 19: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Gambar 12.45Skema diagram yang menunjukkan pemablikan arus elektroosmotik.

Kromatografi Kapiler Elektrokinetik Micellar (MEKC) MEKC merupakan bentuk elektroforesis kepiler dimana solut yang netral dipisahkan berdasarkan kemampuannya untuk berubah menjadi micelle muatan. Micelle adalah gumpalan molekul yang terdiri dari “kepala” ionik dan “ekor” hidrofobik yang membentuk menjadi struktir dengan hidrofobik di bagian dalam dan hidrofilik di bagian luar.

Karena micelle bermuatan negatif, mereka bergerak melalui katoda dengan kecepatan kurang dari kecepatan arus elektroosmotik. Jenis netral membuat sekat antara jenis ini dengan micelle dan larutan penyanggah dengan cara yang sama pada HPLC. Perlu diperhatikan bahwa MEKC kedua fasa adalah fasa gerak.

Elektroforesis Kapiler Gel Pada elektroforesis kepiler gel (CGE), pipa kapiler diisi dengan gel polimer. Karena gel bersifat menyerap, solut bergerak melewati gel dengan kecepatan yang ditentukan oleh mobilitas elektroforetik dan ukurannya. Kemampuan untuk memperngaruhi pemisahan berdasarkan pada ukuran adalah penting ketika solut memiliki mobilitas elektroforetik yang sama.

Kapiler yang digunakan pada CGE biasanya diolah untuk menyisihkan arus elektroosmotik, hal ini dapat mencegah tekanan gel dari pipa kapiler. Sampel dimasukkan secara elektrokinetik karena gel memberikan terlalu banyak perlawanan untuk sampling hidrodinamik.

Elektrokromatografi Kaplier (CEC) CEC merupakan elektroforesis kapiler dimana fasa diam termasuk ke dalam kolom kapiler. Metode pemisahannya sejalan dengan HPLC, tapi tanpa membutuhkan pompa tekanan tinggi. Efisiensi CEC lebih baik dibanding HPLC dengan waktu analisis yang lebih singkat.

12J.4 Metode RepresentatifMetode 12.3 Penentuan Vitamin B Kompleks dengan CZE atau MEKCDeskripsi Metode. Air dengan vitamin B1 terlarut (tiamin hidroklorida), B2 (riboflavin), B3

(niasiamida), dan B6 (pridoxin hidroklorida) dapat ditentukan dengan CZE menggunakan pH

Page 20: Chapter 12E.8 Until End Terj.

9 penyanggah natrium tetraborat/natrium dihidrogen fosfat atau dengan MEKC menggunakan penyanggah yang sama dengan tambahan natrium dodesilsulfat. Detektor adalah UV absorpsi pada 200 nm. Standar internal o-etoksibenzamida digunakan untuk metode standarisasi.

Langkah Kerja. Table vitamin B kompleks dihancurkan dan ditempatkan dalam gelas kimia dengan 20.00 mL larutan metanol 50% v?/v juga 20 mM dalam natrium tetraborat yang terdiri dari 100.0 ppm o-etoksibenzamida. Setelah dicampur selama 2 menit untuk meyakinkan bahwa vitamin B terlarut, 5.00 mL dilewatkan ke filter 0.45 μm untuk menghilangkan ikatan tak larut. Kira-kira 4 nL sampel ditambahkan ke dalam 50 μm diameter kolom kapiler dalam. Untuk CZE, kolom kapiler terdiri atas 20 mM pH 9 penyanggah natrium tetraborat/natrium dihidrogen fosfat. Untuk MEKC penyanggah terdiri dari 150 mM natrium dodesisulfat. 40 kV/m medan listrik digunakan untuk menjalankan baik pemisahan CZE maupun MEKC.

Pertanyaan.12J.1 Metanol, yang terelusi pada 4.69 menit, termasuk jenis netral untuk

mengindikasikan arus elektroosmotik. Ketika menggunakan larutan standar pada masing-masing vitamin, puncak CZE berada pada 3.41 menit, 4.69 menit, 6.31 menit, dan 8.31 menit. Ujilah struktur dan informasi pKa pada gambar 12.47, dan tentukan urutan terelusinya keempat vitamin B.

Vitamin B1 adalah kation dan terelusi sebelum metanol; dengan demikian vitamin B1

terelusi pertama kali pada 3.41 menit. Vitamin B3 adalah jenis netral dan seharusnya terelusi dengan metanol pada 4.69 menit. Sisa dua vitamin B merupakan asam lemah yang secara parsial terionisasi pada penyanggah pH 9. Vitamin B6 adalah asam yang lebih kuat dan terionisasi (sebagai anion) secara luas. Maka, vitamin B6 adalah yang terakhir terelusi.

Gambar 12.47Struktur vitamin B1, B2, B3, dan B6.

12J.2 Urutan elusi ketika menggunakan MEKC adalah vitamin B3 (5.58 min), vitamin B6 (6.59 min), vitamin B2 (8.81 min), dan vitamin B1 (11.21 min). Kesimpulan apa yang dapat kamu buat mengenai kelarutan vitamin-vitamin B dalam natrium dodesilsulfat micelles?

Page 21: Chapter 12E.8 Until End Terj.

Waktu elusi untuk vitamin B1 menunjukkan perubahan terbesar, yakni terjadinya peningkatan dari 3.41 min menjadi 11.21 min. Jelas bahwa vitamin B1 memiliki kelarutan tertinggi dalam micelles. Vitamin B2 dan B3 memiliki batasan kelarutan lebih besar dalam micelles, ini ditunjukkan oleh waktu elusi yang sedikit lama. Menariknya, waktu elusi untuk vitamin B6 menurun dengan hadirnya micelles.

12J.3 Analisis kuantitatif untuk vitamin B1 dilakukan menggunakan prosedur sebagai berikut. Ketika larutan 100.0 ppm B1 dan 100.0 ppm o-etoksibenzamida dianalisis, area puncak untuk vitamin B1 adalah 71% pada standar internal. Analisis tablet vitamin B kompleks 0.125 g menunjukkan area pundak untuk vitamin B1 adalah 1.82 kali sama besar seperti vitamin B1 pada standar internal. Berapa miligram vitamin B1 yang ada pada tablet?

Untuk stadarisasi internal, persamaan yang relevan adalah

SA

SIS= k

CA

CIS

dimana SA dan SIS adalah sinyal untuk analit dan syandar internal, dan CA dan CIS adalah konsentrasi masing-masingnya. Substitusi untuk larutan standar

71100

= k ×100.0 ppm100.0 ppm

dari persamaan tersebut, nilai k diperoleh sebesar 0.71. Substitusikan nilai ini ke dalam sampel

1.821

= 0.71 ×CA

100.0 ppm

maka konsentrasi vitamin B1 adalah 256 ppm. Ini adalah konsentrasi dalam sampel yang dimasukkan. Untuk menentukan jumlah miligram vitamin B1, kita harus menghitung disolusi sampel, maka

256 mgL

× 0.0200 L = 5.1 mg vitamin B1

12J.5 EvaluasiKetika membandingkan GC dan HPLC, elektroforesis kapiler memberikan tingkat ketepatan, ketelitian, dan sensitivitas yang sama, serta selektivitas yang sebanding. Jumlah zat yang dimasukkan ke dalam kolom elektroforetik kepiler secara signifikan lebih kecil dibandingkan pada GC dan HPLC, yakni 1 nL versus 0.1 μL untuk GC kapiler dan 1–100 μL untuk HPLC. Limit deteksi untuk elektroforesis kapiler adalah 100–1000 kali lebih kecil dibandingkan pada GC dan HPLC. Keuntungan yang paling signifikan dari elektroforesis kapiler adalah kemajuan pada efisiensi pemisahan, waktu, dan biaya. Kolom elektroforetik kapiler terdiri dari palt teori yang lebih banyak (≈106 plat/m) dibandingkan pada HPLC (≈105 plat/m) dan kolom GC kapiler (≈103 plat/m), menyediakan resolusi dan kapasitas puncak yang sangat baik.