Cara Kerja Laporan Praktikum
2
3. Cara Kerja Ada empat tahap dalam prosesisolasi/purifikasi DNA dari sel : a. Melisiskan sel dengan cell lysis solution b. Melisiskan inti sel dengan nuclei lysis solution, kemudian (optional) menguraikan/merusakan molekul RNA dengan RNase solution c. Mempresipitasikan protein dengan protein precipitation solution d. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh. Urutan cara kerja : 1) Masukan 900 ulcell lysis solution ke dalam tabung microcentrifuge steril 2) Tambahkan 300 ul darah dan tabung diputar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenesi 3) Inkubasi campuran di atas selama 10 menit dalam suhu ruang (bolak-balik 2-3 kali selama inkubasi). 4) Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 1 menit. 5) Buang supernatant tanpa menggangu pellet 6) Tambahkan 600 ul celllysis solution ke pellet dan vortex sebentar. 7) Ulangi tahap 4 dan 5 sampai pellet terlihat putih 8) Tambahkan 300 ul nucleilysis solution ke pellet. Pipet larut 5-6 kali untuk melisiskan sel darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental. Jika masih terlihat butiran- butiran kecil setelah pencampuran, inkubasi campuran tersebut pada suhu 37º C sampai butiran tersebut hilang. 9) Optional. Tambahkan 1,5 ul RNase solution dan campurkan dengan cara membolak balik tabung 10) Inkubasi campuran pada suhu37º C selama 15 menit, lalu dinginkan pada suhu ruang.
-
Upload
sri-nowo-minarti -
Category
Documents
-
view
164 -
download
1
Transcript of Cara Kerja Laporan Praktikum
3. Cara Kerja
Ada empat tahap dalam prosesisolasi/purifikasi DNA dari sel :
a. Melisiskan sel dengan cell lysis solutionb. Melisiskan inti sel dengan nuclei lysis solution, kemudian (optional)
menguraikan/merusakan molekul RNA dengan RNase solutionc. Mempresipitasikan protein dengan protein precipitation solutiond. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh.
Urutan cara kerja :
1) Masukan 900 ulcell lysis solution ke dalam tabung microcentrifuge steril2) Tambahkan 300 ul darah dan tabung diputar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenesi3) Inkubasi campuran di atas selama 10 menit dalam suhu ruang (bolak-balik 2-3 kali
selama inkubasi).4) Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 1 menit.5) Buang supernatant tanpa menggangu pellet6) Tambahkan 600 ul celllysis solution ke pellet dan vortex sebentar.7) Ulangi tahap 4 dan 5 sampai pellet terlihat putih8) Tambahkan 300 ul nucleilysis solution ke pellet. Pipet larut 5-6 kali untuk melisiskan sel
darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental. Jika masih terlihat butiran-butiran kecil setelah pencampuran, inkubasi campuran tersebut pada suhu 37º C sampai butiran tersebut hilang.
9) Optional. Tambahkan 1,5 ul RNase solution dan campurkan dengan cara membolak balik tabung
10) Inkubasi campuran pada suhu37º C selama 15 menit, lalu dinginkan pada suhu ruang.11) Tambahkan 100 ul protein precipitation solution ke dalam lisate dan vortex selama 20
detik. Setelah divortex akan terlihat butiran-butiran protein halus.12) Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu ruang. Akan terlihat
pellet dengan warna coklat terang. Bila supernatant masih berwarna coklat, ambil supernatant tersebut, pindahkan ketabung microcentrifuge bersih, ulangi langkah 11 dan 12.
13) Pindahkan supernatant kedalam tabung microcentrifuge bersih yang sudah berisi 1 ml isopropanol.
14) Bolak balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA).15) Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit. Akan terlihat
pellet putih.16) Buang supernatant, cuci dengan 400 ul alcohol 70% dingin.17) Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang, sampai DNA berubah
menjadi transparan18) Buang supernatant, kering anginkan DNA pada suhu ruang.
19) Larutan DNA dengan 100 ulrehydration solution20) Simpan DNA padasuhu -20º C.
