DAFTAR ISI

KARYOTYPING ..................................................................................... 1

PATOGENESIS MOLEKULER PENYAKIT GENETIK ................................. 9

STRUKTUR MOLEKUL DNA DAN RNA .................................................. 14

REGULASI EKSPRESI GEN .................................................................... 18

STRUKTUR MOLEKULER PROTEIN ....................................................... 33

HUMAN GENOME VARIATIONS & EPIGENETICS ................................ 42

REKAYASA GENETIKA – REKOMBINAN DAN APLIKASINYA .................. 53

BIOTEKNOLOGI BIDANG KEDOKTERAN ............................................... 59

DIAGNOSIS DAN TERAPI PENYAKIT GENETIK....................................... 69

MUTASI DAN REPARASI DNA .............................................................. 75

DNA .................................................................................................... 80

MEMBRAN STRUCTURE....................................................................... 84

DNA REKOMBINAN ............................................................................. 91

1

KARYOTYPINGMujosemedi, Drs, M.Sc

Karyotyping didefinisikan sebagai studi kromosom, proses pairing and ordering semua kromosom pd sebuah organisme, shg memberikan potret genom yang luas dr kromosom-kromosom individu (jumlah, ukuran, dan morfologi).

Karyogram/idiogram: gambaran susunan mikrofotograf kromosom dalam format standard (dalam pasangan,urut dalam ukuran dan posisi sentromer).

Manfaat karyotype: Utk studi aberasi kromosom Fungsi seluler Hubungan taxonomi Utk studi ttg kejadian evolusi.

Karyotype disusun dengan prosedur pengecatan standard gambaran structural yang karakteristik utk setiap kromosom.

Teknik baru diperlukan utk mengetahui juml kromosom sel diploid pd manusia :a. Menggunakan sel kultur yang dipacu untuk masuk fase S dengan

PHA (phytohemaglutinine).b. Mitosis ditahan dalam metafase dengan larutan colchicine.c. Pretreating sel dalam larutan hypotonic Sel bengkak &

kromosom tersebar.d. Squashing the preparation on the slide forcing the

chromosomes into a single plane.e. Memotong fotomikrograf & menyusunnya kedalam sebuah

karyogram. Karakteristik karyotype yang diamati & dibandingkan adalah

perbedaan:

2

1. Ukuran absol utk kromosom2. Posisi centromer3. Ukuran relative kromosom(akibat translokasi/pertukaran

segmental→ukuran tdk sama).4. Jumlah dasar kromosom5. Jumlha dan posisi satelit6. Derajat dan distribusi “region” hetero kromosomatin(lbh gelap

drpd eukromosomatin).

Mempersiapkan Karyotype dr sel mitotik : Sumber sel:

biopsi tumor atau bone marrow diagnosis kanker. spesimen drh tepi,dan biopsy kulit diagnosis lain. cairan amnion,atau specimen villus chorionic prenatal

screening. Sel mitotic ditahan dalam metaphase atau prometafase

dengan colchicines Sel diberi perlakuan dengan larutan hipotonik bengkak &

pecah. Nukleus diberi perlakuan dengan fiksatif diteteskan pd

“glassslide” dicat yang memberikan gambar struktur kromosom.

POLA PEMITAAN ( BANDING PATTERNS ) Sblm perkembangan teknik pemitaan, sulit utk membedakan

kromosom satu dengan yang lain → kromosom dikelompokkan berdasarkan ukuran(A-G) dan letak centromer.

1970 Torbjorn Caspersson,dkk.mendeskripsi teknik pemitaan pertama yang dikenal sebagaiQ-banding → dengan cat fluorescent quinacrine → mengalkilasi DNA.

3

Skrg sebagian besar karyotype dicat dengan GIEMSA → resolusi pita lbh baik,lbh stabil & dpt dianalisis dengan mikroskop bright-field biasa.

Komposisi basa DNA & perbedaan local struktur kromosomatin → hasil pengecatan yang beda (pola band/pita yang beda).

Pd Gbanding, varian pengecatan Giemsa → lazim di North America, kromosom metaphase diperlakukan sebentar dengan trypsin, sebelum dicat dengan Giemsa. Trypsin digest bbrp protkromosom → me-”relaxing” struktur khromatin → cat Giemsa dpt mengakses DNA.

Bagian hetero kromosomatin tendensi pd DNA kaya AT & relative lbh sedikit gen → tercat lbh gelap pd G-banding.Sebaliknya, kromosomatin yang kurang konden (eukromosomatin),tendensi kaya GC & lbh aktif ditranskriplbh sedikit tercat Giemsa → nampak sebagai pita (band) terang dalam “G-banding”.

G-banding menghasilkan pola “reproducible” utk setiap kromosom, & pola ini “shared” diantara individu-individu pd sebuah spesies.

Pengecatan Giemsa → 400-800 band yang terdistribusi diantara 23 psg kromosom manusia (500 band sel haploid).

R-banding, sebagian Eropa, dengan cat Giemsa, tetapi prosedur ini menghasilkan pola yang sebaliknya dr G-banding. Pd R-banding, sebelum Giemsa diaplikasikan, kromosom dipanaskan. Panas → disrupt helix DNA pd bagian kaya-AT (biasanya mengikat Giemsa paling kuat), & hanya meninggalkan bagian yang kaya-GC utk menyerap cat.

R-banding sering digunakan utk memberikan “criticaldetails” ttg bagian yang kaya gen yang terltk didekat telomer.

C-banding utk mengecat hetero chromatin (DNA tdk aktif scr genetik) jarang digunakan utk diagnostik. C-banding adalah sebuah teknik Giemsa special yang terutama mengecat kromosom pd centromer,yang mempunyai jumlah besar “AT-rich satellite DNA”.

4

Metode pertama utk mengidentifikasi 46 kromosom adalah Q-banding kromosom dicat dengan quinacrine & diperiksa dibwh cahaya UV. Metode ini utk memeriksa translokasi kromosom,terutama kromosom Y.Pola pita (band) adalah sangat serupa yang terlihat pd G-banding.

T-banding : utk memvisualisasikan telomer.

PENGORGANISASIAN KROMOSOM DALAM KARYOGRAM Utk informasi diagnostik, image/gambar kromosom individual

disusun ke dalam format standard sebagai karyotype atau karyogram.

Menurut konvensi internasional, autosom manusia (kromosomnon-sex), dinomori dari 1-22, dalam urutan yang makin kecil dalam ukuran, dengan perkecualian kromosom 21 & 22 (kromosom 21 adalah terkecil). Kromosom seks ditempatkan pd akhir dr karyogram.

Dalam karyogram,kromosom dijajarkan sepanjang aksis horisontal. Kromosom individual disunun dengan lengan pendeknya p (“petite”) diatas & lengan panjangnya q (“queue”) dibawah.

Letak centromer dpt digunakan utk mengidentifikasi “grossmorphology”, atau bentuk kromosom. Misalnya: Kromosom metacentric, seperti kromosom 1, 3, & 16 → lengan

p dan q panjangnya hamper sama. Kromosom submetacentric, seperti kromosom 2, 6, & 10 → ltk

centromer tdk ditengah. Kromosom acrocentric seperti 14, 15 & 21 → centromer terletak

dekat ujungnya. Pola pemitaan (banding pattern) antara 2 kopi kromosom (homolog),

pd autosom adalah hampir sama. Bbrp perbedaan tak kentara antara homolog pd kromosom tertentu dpt dipertalikan dengan variabilitas structural natural antar individu.

5

Penyusunan kromosom ke dalam karyogram → mempermudah identifikasi abnormalitas.

G-band karyograms → rutin utk diagnosis abnormalitas kromosom. Resolusi perubahan kromosom yang dpt dideteksi dengan

karyotyping adalah bbrp megabase → dpt utk mendiagnosis kategori tertentu dri abnormalitas.

Aneuploidi (akibat absen atau penambahan kromosom), mudah dideteksi dengan analisis karyotype.

Cytogeneticists dpt mendeteksi insersi atau delesi yang lebih tak kentara sebagai deviasi dr pola pemitaan normal.

Translokasi jelas kelihatan pd karyotype.

Classification of Chromosomes for Karyotyping (rasio p/q) Group A: chromosomes 1-3 are largest with median centromere. Group B: chromosomes 4-5 are large with submedian centromer. Group C: chromosomes 6-12 are medium sized with submedian

centromere Group D: chromosomes 13-15 are medium sized with acrocentric

centromere Group E: chromosomes16-18 are short with median or submedian

centromere Group F:chromosomes19-20 are short with median centromere Group G:chromosomes 21-22 are very short with acrocentric

centromere. Chromosome X is similar to group C. Chromosome Y is similar to group G.

PEMBAGIAN KROMOSOM Dalam pemetaan kromosom, setiap pita sesuai dengan garis

tengahnya & bukan dengan garis tepinya.

6

Satu region tersusun oleh bbrp pita gelap & terang. Landmark (tapal batas) pd suatu kromosom ditentukan sebagai satu

gambaran morfologik yang konsisten & nyata yang merupakan suatu bantuan diagnostic yang penting dalam mengidentifikasi satu kromosom.

Satu region terletak diantara 2 tapal batas yang berdekatan. Suatu lengan kromosom yang tdk memiliki tapal batas yang nyata

hanya terdiri atas 1 region.Penomoran Pita : Region dan pita dinomori berturut-turut mulai dr sentromer ke ujung

lengan kromosom. Satu pita yang dipakai sebagai tapal batas dianggap seluruhnya milik

region disebelah distal tapal batas, disetujui sebagai no 1 dalam region itu.

Pita yang dibagi 2 oleh sentromer dianggap sebagai 2 pita, diberi label sebagai pita 1 pd region 1 dr lengan kromosom yang berkaitan.

Lengan panjang = q dan lengan pendek = p. Utk menyatakan suatu pita tertentu, dibutuhkan 4 bagian (item):

a) Nomor kromosomb) Simbul lenganc) Nomor region, dand) Nomor pita dalam region itu.

Item-item diberikan tanpa spasi atau punctuasi, mis 1p33 → kromosom no 1, lengan pendek, region 3, pita 3. Jika pita dibagi menjd pita kecil (sub-band), angka pita diikuti ttk decimal dan sub band diberi nomor berurutan dr sentromer ke ujung, misalnya 1p33.1; 1p33.2; 1p33.3, menyatakan pita 3 region 3 lengan pendek kromosom no 1 dibagi menjd 3 sub-band, 33.1 bagian proximal dan33.3 bagian distal.

7

Kromosom mempunyai pola-pola “band” yang karakteristik yang ditimbulkan oleh trypsin dan Giemsa.

IDENTIFIKASI KROMOSOM : FISH (fluorescence in situ hybridization) is acytogenetic technique

developed by Christoph Lengauer that isused to detect and localize the presence or absence of specific DNA sequences on chrmosomes.

FISH uses fluorescent probes(fluorescent labeled DNA fragments,~10.000bp)that bind to only those parts of the chromosome with which they show a high degree of sequence similarity.

Fluorescence microscopy can be used to find out where the fluorescent probe bound to the chromosomes.

FISH is often used for finding specific features in DNA for use in genetic counselling, medicine, and species identification.

FISH can also be used to detect and localize specific mRNAs within tissue samples.In this context, it can help define the spatial-temporal patterns of gene expression within cells and tissues.

FISH dpt mendeteksi : Mikro delesi yang halus, Translokasi yang kompleks, perubahan telomer

Spectral Karyotype(SKY Technique) Adalah teknik sitogenetik molekuler utk memvisualisasikan scr

simultan semua pasang kromosom pd sebuah organsime dalam warna yang berbeda.

Probe(pelacak) melabel DNA spesifik dengan fluorescent pd setiap kromosom dengan fluorophore.

Krn jumlah fluorophores yang terbatas, sebuah method pelabelan kombinasi digunakan utk menghasilkan banyak warna yang berbeda.

8

Perbedaan spectral yang dihasilkan oleh pelabelan kombinasi dianalisis dengan interferometer yang dilekatkan pd mikroskup fluorescence.

9

PATOGENESIS MOLEKULER PENYAKIT GENETIKSuyatmi,dr.MBiomedSc

Klasifikasi penyakit genetik1. Penyakit Kromosomal/cytogenetik disorder.2. Penyakit Single gene/monogenik disorder (Mendelian pattern

inheritance).3. Penyakit akibat Multifactorial genetic (polyangenic disorder).4. Penyakit terkait defek pada mitochondrial DNA.

Mutasi Mutasi dapat menimbulkan penyakit melalui beberapa cara: Fungsi protein hilang Peningkatan fungsi protein Protein mutan dengan sifat baru Sintesis protein pada waktu dan tempat yang salah

KEGAGALAN FUNGSI ENZIM (AMINOACIDOPATHY)

1. Phenylketonuria (PKU) (autosomal resesif) Kelainan terkait protein sebagai enzim Gangguan sintesis enzim phenylalanine-hydroxylase (PAH)

10

yang mengubah Phenilalanin menjadi tyrosin Peningkatan plasma Phenilalanin impairs brain development after 6M - severe mental retardation - IQ under 50 Menurunnya pigmentasi rambut dan kulit akibat

ketaktersediaan tyrosin. EARLY SCREENING TEST!!! DIET!!!

2. Hiperfenilalaninemia (PKU)

LYSOSOMAL STORAGE DISEASESGM2 gangliosidoses

11

KELAINAN PROTEIN RESEPTORFamilial hypercholesterolemia (autosomal dominan)

(= subgroup of hyperlipoproteinemia) Frekuensi paling tinggi 1:500 Mutasi gene pengkode LDL-receptor Heterozyangotes: plasma kolesterol meningkat 2-3× Homozyangotes: plasma kolesterol meningkat 5× heterozyangotes asymptomatic sampai dewasa: xanthomas

sepanjang selubung tendon, atherosklerosis a. coronaria Homozyangotes: xanthomas pada masa kanak, kematian krn

Miocard Infarc pada usia 15th

KELAINAN PROTEIN TRANSPORTCystic fibrosis (autosomal resesif)

12

Mutasi terkait abnormalitas fungsi protein transport, dikodekan oleh gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulators) pada kromosom 7 (7q31-32)

1:2000 lahir hidup – mrp lethal genetic disease yang paling sering pada kulit putih

Defek pada transport ion Cl melalui membran epithelialpeningkatan absorpsi natrium dan air dalam sirkulasi darah

Defek meluas pada kelenjar exocrin: sekresi mukos yang viscous sumbatan jalan nafas, duktus pancreatikus, duktus biliaris

Abnormalitas pancreas (85%) – dilatasi duktus, atropi klj. Exocrin pancreas, fibrosis

Abnormalitas Pulmo: dilatasi bronkioles, retensi mukus, bronchiektasis, abses paru, emfisema, atelektasis, cor-pulmonal cronikum

GIT - meconium ileus (newborns) (25%), biliary cirrhosis (2%) Male genital tract - sterility (obstruction of vas deferens,

epididymis, seminal vesicles) (95%) Manifestasi klinis:

◦ Infeksi paru yang rekuren◦ Insufisiensi pancreas sindrom malabsorpsi,

hipovitaminosis A D E K◦ Keringatnya mengandung kadar Na yang sangat tinggi–

“salty” children◦ Kematian pada umumnya akibat gagal nafas pada

dekade 3

Kelainan Protein Struktur :1. Duchenne and Baker Muscular Dystrophies2.Osteogenesis Imperfecta

13

Penyakit terkait mutasi pada mitokondrial DNA : Mitokhondria adalah organel bulat panjang pada sitoplasma

tumbuhan dan hewan yang dibutuhkan untuk respirasi sel. Tiap mitokondria terdiri dari 5-10 DNA sirkuler. Tiap sel mengandung ratusan mitokondria

Mitochondrial DNA (mtDNA) mrp DNA sirkular yang mengandung 16,569 base pairs. Kebanyakan mitokondria memiliki 5-10 kopi mtDNA. mtDNA mengkode 2 rRNA subunits, 22 tRNA molecules, dan 13 polypeptides

Penyakit mitokondrial DNA pada dasarnya diakibatkan kegagalan rantai respirasi pada proses phosphorilasi oksidatif

Leber,s Hereditary Optic Neuropathy Terkait mutasi titik pada mtDNA Penderita mengalami kehilangan penglihatan akibat kematian

saraf optik pada dewasa muda Pria maupun wanita mempunyai resiko yang sama (epid: pria> ) Penderita wanita mewariskan kelainan, pria tidak mewariskan

kelainan (maternal inheritance)

14

STRUKTUR MOLEKULER DNA & RNAMujosemedi, Drs, M.Sc

GENOME MANUSIA Genome adalah komplemen khromhaploid (the complete set of

chromosomes) =23 kromosom. Sel manusia (diploid, nonreplicated) = 46 khromtd 6x109 bp

(basepairs).Tiap pasang basa berikatan dengan 6 molekul H2O = ±0.34nm panjang molekul DNA = 2m.

Bagaimana fit 2m “hydratedDNA” ke dalam nukleus [diameter±10μm(1μm=1x10-6m)] & mudah diakses enzim dan protein regulatornya?Jawaban tergantung pada bagaimana molekul DNA dipak.

Kromosom terdiri dari kromatin = DNA + protein Protein kromatin terdiri dari histon dan nonhiston (protein regulator,

enzimatis, dan protein struktural). Protein histone ada 5 kelas berdasar kandungan lys & arg : H1, H2A,

H2B, H3, & H4. Kromatin juga mengandung RNA (dalam pembentukan) & snRNA

(terlibat dalam “premRNAsplicing”). DNA & histon diorganisasi ke dalam sub unit berulang yang disebut

nucleosome Nucleosome terdiri dari “nucleosome coreparticle” (NCP) yang

mengandung 146 bp “supercoiled DNA” yang mengelilingi 2x kompleks 8 molekul histone (H2A,H2B,H3,&H4).

Histone H1 terletak di luar NCP. NCP di hubungkan satu sama lain oleh “linker DNA”(panjang

±60bp).

DNA & RNA

15

•DNA : Deoxy ribonucleic acid, adalah sebuah polynucleotide linear ganda, yang berfungsi sebagai molekul informasi genetic yang mengandung deoxy nucleotide Adenine(A), Guanine(G), Cytosine(C) &Thymine(T).

•RNA : Ribonucleic Acid, adalah sebuah poly nucleotide linear tunggal yang mengandung ribonucleotida Adenine(A), Guanine(G), Cytosine(C), & Uracyl(U).

•DNA double stranded helix (pita/rantai ganda).•RNA single strand(pita/rantai tunggal) Beberapa bentuk DNA:

a. A-DNA: righthanded and double stranded DNA containg about 11 residue perturn. It is formed through the dehydration of B-DNA.

b. Z-DNA: A formed of DNA in which the two antiparallel polynucleotidea chains form a left handed double helix. It consists of about twelfe residues perturn and has been shown to be present along with B-DNA in chromosomes and may have a role in regulation of gene expression.

c. B-DNA: The classic form Watson Crick double helix DNA containing about 10 residues perturn; having a helix diameter of about 24 A. The planes of the base pairs in the double helix are perpendicular to the helix axis.

•Perpasangan Basa DNA antara pita yang satu dengan pita yang lain dihubungkan oleh ikatan hydrogen.•Antara gula yang satu dengan gula yang lain dalam satu pita dihubungkan oleh ikatan phosphodiester.

MOLEKUL DNA :•Duapita/rantai(strand) antiparallel.•“Right handed double helix”.

16

•10 nukleotida per putaranhelix.•Dinomori dari kanan ke kiri (dalam1 rantaiberakhirpd 3’C dan5’C berkenaan dengan atom C pd deoxyribose).

NUKLEOTIDA DNA & RNA : Nucleotida adalah “the basic building block dari asam nukleat, yang td basa nitrogen (purine atau pyrimidine), sebuah gula pentose (ribose atau deoxyribosa) dan sebuah phosphate.•Antara basa nitrogen dan gula pentose dihubungkan oleh ikatan glycosidic (kovalen).•Nukleotida= basa+ gula+ phosphate

Basa•Basa DNA adalah A, G, C, danT.•Basa RNA adalah A, G, C, danU (Uracil)

GULA DNA & RNA :•Gula DNA adalah pentose (td 5 atom C) deoxyribosa.•Gula RNA adalah pentosa ribosa.•DNA merup molekul rantai panjang dr nucleotida(polynucleotida).•Tiap rantai berakhir pd 3’OH dan 5’PO4.•Arah rantai DNA adalah antiparalel.•Antara A dan T dihubungkan oleh 2 ikatan H (hydrogen) sdengankan ant G dan Cdihubungkan oleh 3 ikatan H.

17

18

REGULASI EKSPRESI GEN

Signifikansi biologis regulasi ekspresi gen aklimasi Menjaga pertumbuhan dan proliferasi Menjaga diferensiasi dan perkembangan individu

Multilevel regulasi ekspresi gencheck point

◘ aktivitas struktur gen pd genome◘ Amplifikasi DNA ◘ DNA rearangement◘ Metilasi DNA ◘ inisiasi transkripsi RNA *◘ Proses RNA post-transcription◘ Transport RNA post-process◘ Inisiasi translasi protein◘ Proses protein post-translation

Operon prokariotik◘ Kosep operon pertama dikemukakan pertama pd 1961 oleh

Jacob dan Monod. ◘ Operon adalah suatu unit secara keseluruhan pd ekspresi gen

prokariotik yang meliputi satu set gen struktural, promoter, operator dan kontrol elemen lain yang dikenali dan diikat oleh produk gen regulatori

OPERON : Sekelompok gen-gen fungsional yang ekspresinya diatur oleh interaksi prot repressor dengan gen operator

a) Gen struktural : mengkode enzim. b) Promoter : tempat dmn RNA pol berikatan dengan DNA

sebelum mulai transkripsi.

19

c) Operator : terltk antara promoter dan gen struktural, sebagai tempat perlekatan repressor (prot).

d) Gen regulator : mengkode repressor (prot).e) Operator adalah sebuah tempat berikatan dengan repressor.f) Operator memediasi regulasi negatif pd operong) Operator adalah di sebelah promoter. h) Operator terletak di downstream (hilir promoter).i) Operator sebagian overlaps dengan promoter kadang-kadang

Regulator lain pd operon prokariotik Sekuen DNA spesial pd bbrp operon prokariotik Dpt berikatan dengan aktivator pd RNA polymerase Meningkatkan transkripsi pd operon Memediasi regulasi positif operon Regulasi positif adalah bukan mekanisme utama tentang

regulasi ekspresi gen pd operon, tetapi regulasi negatif. cis-acting elements pd gen eukariotic

cis-acting element adalah fragmen DNA. cis-acting element adalah regulator pd transkripsi gen eukariotik Ada cis-acting element in the flakings atau pd introns gen

eukariotik. cis-acting elements meliputi promoter,enhancer, silencer and so

on. Gen-gen eukariotik adalah monocistron. Tidak ada struktur operon pd genom eukariotik

Protein regulasi Protein regulasi dr gen-gen prokariotik

• Faktor spesifik : menentukan identifikasi dan berikatan antara RNA polymerase dan promoter spesifik.

• Repressor：berikatan dengan operator dan menekan (repress) transkripsi gen

20

• Aktivator: berikatan dengan sekuen DNA spesial disebelah promoter ; mempercepat ikatan antara RNA polymerase dan promoter ; dan untuk membentuk kompleks inisiasi transkripsi.

RNA polymerase

Pengaruh promoter prokariote/eukariotes pd RNA polymerase

Promoter prokariot/eukariot terdiri dari tempat inisiasi transkripsi (transcription initiation site), identifikasi RNA polymerase dan binding site and elemen regulasi lain.

Promoter eukariot lebih kompleks drpd promoter prokariot. Sekuen promoter yang berbeda pasti beda (RNA

polymerasenya). Afinitas promoter prokariotik dengan RNA polymerase

berpengaruh scr langsung pd frekuensi inisiasi transkripsi gen

Afinitas antara RNA polymerase eukariotik dengann promoter adalah lebih kecil, ketika RNA polymerase adalah tunggal (single).

RNA polymerase eukariotik dpt berikatan dengan promoter setelah membentuk kompleks dengan faktor transkripsi dasar.

Protein regulasi mempengaruhi aktivitas RNA polymerase

Promoter spesifik menentukan frekuensi tanskripsi dasar (basic) gen-gen.

Protein regulasi dapat merubah frekuensi transkripsi gen. Konformasi atau level ekspresi dalam sel pd protein regulasi

mendapat sebuah perubahan dibwah stimulasi sinyal lingkungan.

Interaksi DNA-protein dan protein-protein dalam regulasi transkripsi pd gen-gen eukariotik

21

Interaksi DNA-protein Identifikasi dan ikatan antara cis-acting proteins or trans-acting

factors and cis-acting elements Interaksinya adalah sebuah ikatan non-covalent . Akhirnya membentuk kompleks DNA-protein

Interaksi protein-protein Sebag besar protein regulasi dpt membentuk homodimer,

heterodimer, homopolymer atau heteropolymer sebelum berikatan dengan cis-acting element.

Kemampuan bbrp protein regulasi untuk berikatan dengan its cis-acting element adalah meningkat atau menurun setelah polimerisasi.

Bbrp protein regulasi tdk berikatan dengan DNA, ttp dpt mempengaruhi aktivitas pengikatan antara DNA dan protein regulasi lain oleh interaksi protein-protein.

Regulasi Translasi protein pd prokariotRegulasi ekspresi gen eukariotik

1. Karakter struktur genomik eukariotik2. Karakter regulasi ekspresi pd gen-gen eukariotik.3. Regulasi transkripsi utk RNA pol I dan RNA pol III4. Regulasi inisiasi transkripsi utk RNA pol II5. Regulasi terminasi transkripsi utk RNA pol II6. Regulasi past-transcription utk RNA7. Regulasi translasi protein

Karakter struktur genomik eukariotik Genome eukariotik adalah sangat besar. Struktur genom eukariotik adalah sangat kompleks.

22

Hanya ada sebuah gen dalam sebuah unit transkripsi pd genome eukariotik genome.

Ada banyak sekuen berulang pd genome eukariotik. Gen adalah discontinuous, ada noncoding sequences pd sebag

besar gen eukariotikKarakter regulasi transkripsi pd gen-gen eukariotik :Tiga RNA polymerase pd eukariote

RNA polymerase Ⅰ，45s-rRNA(28S, 18S, 5.8S) RNA polymerase Ⅱ*，hnRNA(mRNA), sebuah bagian dr snRNA RNA polymerase Ⅲ，5s-rRNA, tRNA, sebuah bagian dr snRNA Setiap RNA polymerase td 10 subunit Bbrp subunit itu adalah bersama (in common) utk setiap RNA

polymerase, misalnya TATA box-binding protein (TBP). Bbrp subunit adalah special utk RNA polymerase. TF Ⅱ D adalah core of polymerase Ⅱ . TFⅡD td TBP and TBP-related factor.

Karakter struktural regio gen aktif Ada hypersensitive sites thd DNaseⅠpd regio yang mengapit

(flanking) gen aktif, dekat regulation protein binding sites.Ketika gen diaktifkan, struktur topologi regio transkripsi, DNA di depan RNA polymerase adalah konformasi superheliks positif, DNA di belakang RNA polymerase adalah konformasi superheliks negatif.

Konformasi DNA superhelix negatif adalah tepat utk membentuk nukleosome lagi, konformasi DNA superheix positif adalah tepat utk memisahkan histone dalam nukleosome.

Metilasi sekuen CpG pd regio yang mengapit gen aktif adalah lebih rendah.

Histon pd regio gen aktif sering berubah sbb : Histon adalah mudah utk dimodifikasi, sebagai akibat

strukturnya menjadi instabilitas. Dimer H2A-H2B adalah mudah utk dilepas dr nucleosome.

23

Instabilitas dimer H2A-H2B naik (meningkat). Histon yang kaya Lys seperti H1 adalah menurun (berkurang).

Regulasi positif adalah utama dalam regulasi transkripsi gen eukariote : Sebag besar protein regulasi transkripsi adalah protein aktivasi

transkripsi. Afinitas diantara RNA polymerase dan promoter pd eukariote

adalah sangat lemah atau tdk ada . RNA polymerase pasti tergantung pd satu atau banyak protein

aktivasi utk berikatan dengan promoter. Regulasi positif adalah universalitas pd regulasi transkripsi gen

pd eukariote. Genome eukariotik adalah sangat besar. Ada banyak cis-acting elements pd sebuah regio regulasi gen,

sebagai akibat bhw spesifisitas interaksi antara protein aktivasi dan DNA meningkat.

Banyak protein aktivasi meregulasi sebuah gen, oki efisiensi regulasi adalah lebih tinggi.

Protein aktivasi meregulasi banyak gen, oki regulasi adalah lbh ekonomis.

Transkripsi dan translasi dipisahkan dalam area yang berbeda, hal ini mudah utk meregulasi dengan tepat pd transkripsi gen

Proses modifikasi post-transkripsi adalah lebih kompleks dan perfect (lengkap), oki links (hubungan) regulasi ekspresi gen adalah meningkat .

Regulasi transkripsi untuk RNA polⅠ and RNA pol a). Kontrol transkripsi untuk RNA polⅠ b). Kontrol transkripsi untuk RNA pol

Regulasi inisiasi transkripsi untuk RNA polⅡ

24

a). cis-acting element menurut fungsi, terutama meliputi promoter, enhancer, silencer, dsba1. Promoter

Promoter td RNA polymerase binding site, a set of other functional elements yang mengontrol transkripsi dan paling tidak sebuah transcription initiation site.

Panjang setiap elemen fungsional pd promoter sekitar 7-20 bp. Sekuen promoter pd gen-gen yang berbeda adalah sedikit

berbeda. Sebagian besar sekuen promoter gen mempunyai TATA box. TATA box adalah elemen fungsional paling dasar dan penting pd

promoter. The consensus sequence of TATA box is TATAAAA yang terletak

pd regio -25 ~ -30 bp dr transcription start site upstream. TATA box mengontrol ketelitian (veracity) dan frekuensi

transkripsi gen. GC box（GGGCGG）dan CAAT box （GCCAAT）adalah lebih

sering dalam promoter. GC box dan CAAT box terletak pd regio -30 ~ -110 bp

transcription start site upstream Promoter pasti terletak pd upstream dr coding region dr gen itu. Promoter memp arah yang tepat (strict direction). Promoter yang paling sederhana td TATA box dan transcription

start site, ttp promoter yang khas sering mengandung juga GC box dan/atau CAAT box in upstream of TATA box.

Promoter pd bbrp gen tdk mengandung TATA box. Promoter tanpa TATA box selalu mengandung banyak

transcription start sites, dan kadang mengandung rich-GC.

25

Gen yang mengandung promoter tanpa TATA box adalah house keeping gene atau gen yang berperan dalam fetation, tissue differentiation, tissue damage regeneration dsb.

a2. Enhancer Enhancer adalah sebuah fragmen DNA. Enhancer meningkatkan aktivasi transkripsi gen dan

menentukan space-time specificity pd transkripsi gen. Peran enhancer tdk berhubungan dengan jaraknya dr

transcription start site. Enhancer adalah sangat jauh dr gene transcription start site (1~30/50kb) dan terletak tdk hanya di genic upstream, ttp juga di genic downstream, kadang dalam intron.

Bbrp elemen fungsional penting, misalnya core DNA sequence yang mana diikat dengan faktor transkripsi special, adalah di enhancer dan promoter pd saat yang sama.

Enhancer selalu interlinks atau overlaps dengan promoter. Kadang enhancer dan promoter terlalu dekat dalam struktur utk

berdiferensiasi dengan pasti dalam space dan fungsi. DNA dr promoter dan struktur enhancer disebut space-time

special promoter. a3. silencer

Silencer adalah elemen negatif pd regulasi transkripsi gen, sebaliknya enhancer.

Transkripsi gen dihambat ketika protein regulasi spesifik telah berikatan dengan silencer.

Bbrp silencer memainkan peran enhancer kadang hal ini sebag besar bergantung pada karakter protein regulasi dalam nucleus.

Faktor-faktor regulasi transkripsi Faktor-faktor regulasi transkripsi juga disebut faktor transkripsi

(TF).

26

Sebagian besar faktor regulasi transkripsi adalah trans-acting factors, bbrp faktor regulasi transkripsi adalah cis-acting proteins.

Tipe faktor-faktor transkripsi :Faktor transkripsi general/umum

Diperlukan utk RNA polymerase berikatan dengan promoter. Menentukan tipe transkripsi RNA. Ini juga dianggap sebagai sebuah komponen dr RNA

polymerase. Faktor transkripsi spesial

Diperlukan untuk transkripsi gen individual. Menentukan specificitas transkripsi gen in the time and the

space. Sebagian besar faktor transkripsi spesial adalah aktivator

transkripsi, dan sedikit faktor transkripsi spesial adalah inhibitor transkripsi.

Sebagian besar aktivator transkripsi adalah protein yang berikatan dengan enhancer.

Sebag besar inhibitor transkripsi adalah protein yang berikatan dengan silencer.

Bbrp inhibitor transkripsi tdk scr langsung berinteraksi dengan DNA, ttp berikatan dengan the general transcription factor II-D atau bbrp aktivator transkripsi dan menurunkan konsentrasi efektif pd akhir dalam sel dan menekan transkripsi gen.

Struktur faktor transkripsi Biasanya, sebuah faktor transkripsi mengandung sebuah DNA

binding domain dan sebuah transcription activation domain. Banyak faktor transkripsi juga mengandung sebuah domain

yang memediadi interaksi protein-protein, misalnya domain dimerisasi.

27

DNA binding domain Biasanya td 60 ~ 100 residue asam amino. Struktur yang paling familiar:

¬ struktur zinc finger ¬ struktur basic a- helix

Sruktur : ¬ basic leucine zipper structure，bZIP ¬ basic helix-turn helix structure，bHTH ¬ basic helix-loop-helix structure，bHLHDomain aktivasi transkripsi

Biasanya terdiri dr of 30~100 amino acid residue . Dibagi 3 tipe sbb : ¬ acidic activation domain ¬ glutamine-rich domain ¬ proline-rich domain

Domain dimerisasi :Domain dimerisasi adalah basic leucine zipper or basic helix loop helix in protein structure.KONTROL EKSPRESI GEN PD EUKARYOTE

• Sel euk > kompleks : genome > → informasi >• Sel tban + bntg : terdif luas → perlu “battery” prot yang berbeda

utk aktivitas spesialnya.1. AMPLIFIKASI SELEKTIF TEMPLATE DNA• Adalah proses overreplikasi utk ↑ juml kopi gen ttt.• Adalah mekanisme utk ↑ ekspresi gen yang memainkan kunci

peran dalam aktivitas tipe sel ttt (mis gen globin pd RBC).

2. PENYUSUNAN KEMBALI SEQ DNA YANG TERLIBAT DALAM FORMASI ANTIBODI

• Setiap molekul AB td 2 rantai polipept : light (L) chains & heavy (H) chains.

28

• Kedua tipe td 2 bag :◦ Bag Variable (V) : seq as am nya bervariasi dr spesies AB

dengan yang lain.◦ Bag Constant (C) : seq as am nya identik diantara semua

rantai H + L dr kelas yang sama.3. KONTROL DI TINGKAT TRANSKRIPSI • Gen-gen diekspresikan pd tingk yang berbeda (pd perkemb

embryonik).• Faktor transkripsi (prot) : menstimulasi atau menghambat

transkripsi gen ttt dengan berikatan pd seq DNA spesifik. TATA box : komp utama dr promoter gen. Enhancer : sebagai binding site fakt yang menstimulasi transkripsi. Delesi enhancer : ↓ tingk transkripsi 100 kali atau lebih.

a) Struktur Faktor Transkripsi Faktor transkripsi (prot) ≥ 2 domain yang berfx :

◦ Mengenali & berikatan dengan seq DNA spesifik.◦ Mengaktivasi transkripsi dengan berinteraksi dengan

prot yang lain. b) Repressi Transkripsi pd Euk◦ Dua cara gen disilenced :

Seq regulator DNA (kompleks preinisiasi transkripsi) berinteraksi dengan prot repressor.

DNA dimodif → kurang sesuai sebagai template.◦ Pd Verteb + methyl group → mensilencekan DNA scr

transkripsional.◦ PD mammal & verteb lain : 1 dr 100 nukleotida mengandung

group methyl yang melkt pd C5 Cytosin (sebagai bag dr dinukleotida –CG- dalam seq simetris.

c) Struktur Khromatin dan Transkripsi◦ Nucleosome (?) ↑ interaksi ant DNA & prot regulator.

29

◦ Khromatin adalah aktif dinamis → strukturnya dpt diremodel.◦ Ssdh prot regulator berikatan dengan DNA (diantara atau

didalam nukleosome) → perub sekunder strukt khromatin → tempat lain > atau < mdh berikatan dengan prot lain.

d) Regulasi Transkripsi ElongasiGerakan RNA pol spjg DNA tdk tjd pd kecep uniform (ada seq

dmn pol melambat dan kdengan istirahat).4. KONTROL DI TINGKAT PEMROSESAN mRNA

Alternate splicing : mengatur ekspresi gen pd tingk pemrosesan mRNA → variasi yang luas kombinasi exon yang berbeda.

5. KONTROL DI TINGKAT TRANSLASIMekanismenya mell interaksi ant mRNA dengan prot spesifik

(dalam sitoplasma). UTRs (Untranslated Regions) pd ujung 5’ (methylguanosin Cap – kodon START) & 3’ (kodon STOP – ujung poly A) : tempat pengontrolan translasi

30

PEMROSESAN mRNA :

a) Lokalisasi Sitoplasmik mRNA : Cont : pd lalat buah (fruit fly)

◦ Perkemb axis ant-post embryo & dewasa dicirikan oleh lokalisasi mRNA spesifik spjg axis yang sama pd telur.

◦ mRNA yang ditranskrip dr gen bicoid terltk pd ujung ant, sdengankan mRNA yang ditranskrip dr gen oskar terletak pd ujung yang berlawanan.

◦ Prot dr mRNA bicoid berperan dalam perkemb kepala & thoraks, sdengankan prot dr mRNA oskar → utk pembtkan abdomen & sel benih.

b) Kontrol Translasi mRNAMekanismenya dengan merubah laju translasi mRNA spesifik.

Cont : mRNA yang mengkode ferritin (fx mengisolasi atom Fe dalam sitoplasma → melindungi sel dr efek toksik free metal)

c) Kontrol Stabilitas mRNASebag besar mRNA Eukar : berumur pjg.

◦ C-fos mRNA yang diprod utk merespon thd perub kondisi eksternal : waktu paruh 10 – 30 min.

◦ mRNA yang mengkode prot dominan seperti Hb & ovalbumin : waktu paruh > 24 jam.

◦ mRNA dengan poly A : stabil & yang tanpa poly A : cepat didegradasi. mRNA meninggalkan nukleus dengan ± 200 Adenosin residu.

◦ Poly A-tail (± 30 A residues) berikatan dengan prot spesifik (PABP : poly A binding prot). Fx PABP :

Melindungi tail dr aktivitas nuclease. ↑ sensitivitas tail thd poly A ribonuclease

spesifik.6. KONTROL POST TRANSLASI

31

a) N-end rule :• Polypept berakhir dengan : Met, Ser, Ala, Thr, Val, & Gly → long

life (waktu paruh > 20 jam.• Polypept berakhir : Phe, Leu, Asp, Lys, & Arg < 5 min.b) Ubiquitinated : prot ditargetkan utk degradasi oleh proteosome

(multiprotein complex).

32

STRUKTUR MOLEKULER PROTEINMujosemedi, Drs. M.Sc

1. PROTEIN adalah polypeptide, sebuah polimer linear dr banyak asam amino

yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Sebuah makromolekul yang besar terssn dr 1 atau lebih rantai

polypeptide. Setiap polimer protein – juga dikenal sebagai polypeptide – td

sebuah sekuen dr 20 L-α-asam amino (residues). Untuk rantai dibwh 40 residues disebut peptide. Utk berfungsi scr biologis, protein folding (melipat), yang

didorong oleh interaksi non-kovalent seperti ikatan hydrogen, interaksi ionik, Van Der Waals forces, dan hydrophobic packing.

Proteins berperan dalam proses biologis yang meliputi : Katalisis Enzymatik – meningkatkan laju reaksi biologis. Binding, transport and storage – mis.: protein hemoglobin

transport O2 ke jaringan. Molecular switching – perub konformasi dalam response

thd pH atau ligand binding dpt digunakan utk mengontrol proses seluler.

Gerakan yang terkoordinasi – kontraksi otot gerakan sliding filamen actin dan myosin.

Structural support – kulit dan tulang diperkuat oleh the protein collagen.

Proteksi Immune – antibody Generation and transmission of nerve impulses – bbrp

asam amino sebagai neurotransmitter, reseptor (utk neurotransmitter, drug, dll.) reseptor acetylcholine di neuron postsynaptic.

33

Mengontrol pertumbuhan dan differentiasi – Misal: protein repressor, banyak hormon dan growth factors yang mengatur fungsi sel, seperti insulin atau thyroid stimulating hormone.

Sifat kunci – fungsi :1. Protein adalah polimer linear terbangun dr unit monomer (asam

amino) melipat kedalam struktur 3-dimensional .2. Protein mengandung grup fungsional - alkohol, thiol, thioether, asam

karboksilat, carboxamides, & berbagai grup dasar – misal: reaktivitas kimia yang esensial utk fungsi enzim.

3. Protein dpt berinteraksi satu sama lain, & dengan makromolekul biologis lain utk membentuk complex assemblies macromolecular machines.

4. Bbrp protein adalah quite rigid, sdengankan yang lain menunjukkan fleksibilitas terbatas - element struktural dalam sitoskeleton bag yang bertindak sebagai engsel, pegas, & pengungkit dll.

A. AMINO ACID RESIDUES• As amino : molekul yang mengandung grup amino (NH2), grup carboxyl (COOH) & grup R.

R-CH(NH2)-COOH• Grup R berbeda diantara as am.• Pd prot, grup R dsb “sidechain”.• > 300 as am terdpt scr alami di bumi, juml asam yang berbeda dalam prot = 20

Dua Puluh Asam Amino Dalam ProteinBerdasar sifat fisik & kimia dr grup R, 20 as am prot diklasifikasikan sbb:

34

a. Acidic : dalam lrtan netral, grup R dr acidic amino acid kehilangan proton atau menjd bermuatan negatif ; as asp & as glu.

b. Basic : dalam lrtan netral, grup R mendpt proton & menjd bermuatan positif ; lys, arg, his. Interaksi antr grup R (+) dan (-) membtk “salt bridengane” “stabilizing force in proteins”.

c. Aromatic : grup R mengandung sebuah “aromatic ring” ; tyr, trp, phe.

d. Sulfur : grup R mengandung atom S (Sulfur) ; cys & met. “Disulfide bond” terbtk ant 2 residu cys “stabilizing force” for globular structure.

e. Uncharged hydrophilic : grup R adalahf. hydrophilic dpt membtk ikatan hydrogen ; ser, thr, asn, gln.g. Inactive hydrophilic : as am ini kemungkinan besar terkubur

dalam prot interior. Grup R tdk membtk ikatan hydrogen & jarang terlibat dalam reaksi kimia ; gly, ala, val, leu, ile.

h. Special structure : pd sebag besar as am, grup R & grup amino tdk scr langsung dihubungkan. Proline adalah perkecualian diantara 20 as am yang ditemukan dalam prot Pro sll terletak di belokan rantai polipeptide dalam strukt 3 dimensi pd sebuah prot.

B. THE PEPTIDE BONDPeptide adalah sebuah rantai as am yang dihubungkan oleh “peptide bonds”.• Polypept : peptide yang pjg.• Oligopeptide : peptide yang pendek (< 10 as am).• Protein terbtk dr 1 atau lebih polypept dengan lebih dr 50 as am.

C. Phi – Psi Angles

35

• Krn strukt elektrik spesifik ikatan peptida, atom pd kedua ujungnya tdk dpt berotasi mengelilingi ikatan atom dr grup O=C-N-H, di”fix” pd “plane” yang sama sebagai “peptide plane”.• Keseluruhan plane berotasi mengelilingi ikatan N-Cα (φ angle) atau C-Cα (ψ angle). Cα adalah atom C yang dihubungkan dengan grup R.• Scr matematik , phi (φ) dan psi (Ψ) adalah dihedral angle (torsional angle) sebagai sudut ant ttk (mis : Cα) pd ujung dr 4-point sequence & plane (mis : peptide plane) yang ditempati oleh 3 ttk lain.• Pd sebuah peptida, sudut phi-psi terbatas utk “range” ttt. Plot distribusinya dsb “Ramachandran plot”. Ikatan peptide adalah hub (linkage) ant 2 as am, yang terbtk oleh reaksi kondensasi, sbb. Ikatan peptida Antara -carboxyl group pd satu AA & α-amino group pd AA yang lain ikatan peptide adalah stabil scr kinetic.

Rantai Utama atau backbone Constant backbone: bagian yang berulang scr regular Side

chains (R-groups) yang berbeda : bagian yang bervariasi. Unit AA pd sebuah polypeptide disebut sebuah residue, yang mengandung sebuah grup carbonyl; akseptor ikatan hydrogen yang bagus, sebuah grup NH (kecuali Pro); donor ikatan hydrogen yang bagus.

Struk primer dr prot berkenaan dengan seq as am nya. As am dalam sebuah peptide juga dsb “residue”. Rantai polipeptida mempunyai arah.

2. TINGKATAN STRUKTUR PROTEINa. Struktur primer

Strukt primer berkenaan dengan sekuen asam amino dr peptide atau protein.

36

Struktur primer ditahan bersama oleh ikatan kovalent atau peptide, yang terbentuk selama proses biosintesis protein atau translasi.

Dua ujung rantai polypeptide ditunjuk sebagai carboxyl terminus (C-terminus) dan the amino terminus (N- terminus).

Penghitungan residu selalu mulai pd the N-terminal end (NH2-group), yang mana ujung dimana grup amino terlibat dalam sebuah ikatan peptide

Modifikasi post-translasi seperti formasi disulfide, phosphorilasi danglikosilasi biasanya juga dianggap sebuah bagian dr struktur primer

b. Struktur sekunder Struktur sekunder berkenaan dengan sub-struktur lokal yang

sangat reguler yang distabilisasi oleh ikatan hydrogen. Tipe struktur sekunder adalah alpha helix, beta strand dan

turns. Struktur sekunder ini ditetapkan oleh pola ikatan hidrogen

antara grup rantai peptide utama. Kedua the alpha helix and the beta-sheet menunjukkan sebuah

cara/jalan penjenuhan semua donor dan akseptor ikatan hidrogen pd the peptide backbone

Pd sebuah prot, domain tertentu membtk struktur spesifik seperti α helix dan β strand yang merup strukt sekunder dr prot.

Hydrogen Bond• Ikatan H terbtk oleh 3 atom : 1 atom H dan 2 atom elektronegatif (sering N atau O).• Atom H diikat scr kovalent pd salah satu atom elektronegatif : dsb “the hydrogen bond donor”.

37

• Atom elektronegatif yang lain : dsb “the hydrogen bond acceptor”.• Ketika ikatan H terbtk, jarak ant donor & acceptor = 0.28 nm (1nm = 10-9 m). Atom H scr kovalen diikat oleh donor dan jaraknya lbh pendek drpd jarak ant atom H dan acceptor.

Alpha Helixα helix memp ciri sbb :• every 3.6 residues make one turn,• the distance between two turns is 0.54 nm,• the C=O (or N-H) of one turn is hydrogen bonded to N-H (or C=O) of the neighboring turn.

Hydrogen bonds play a role in stabilizing the α helixconformation. However, the size and charges ofsidechains are also important factors.An a helix can be either right-handed or left-handed.

Amphipathic α helix :• Pd “a amphiphatic α helix”, satu sisi helix mengandung as am hydrophilic & sisi lain mengandung as am hydrophobic.• Seq as am “amphipathic α helix” berseling ant residu hydrophilic dan hydrophobic setiap 3 – 4 residu, krn α helix membuat sebuah belokan tiap 3.6 residu.

Beta Strand, Beta Sheet and Beta Barrela) Beta strand :• Pd “a β strand”, “torsion angle” dr N-Cα-C-N pd “backbone” adalah 120o.

38

• “The sidechains” pd 2 residu yang berdekatan mengarah pd arah berlawanan dr “backbone”.b) Beta sheet• “β sheet” td 2 atau lbh “hydrogen bonded β strands”.• Dua β strands : parallel jika mereka dalam arah yang sama dr satu terminus (N or C) ke terminus yang lain, or anti-parallel jika mereka dalam arah berlwananc) Beta barrel• “a β barrel” adalah “a closed β sheet.”

THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE• Strukt 3 dimensi dsb struktur tersier.• Jika molekul prot td lbh dr 1 polypeptide memp struktur quarter menentukan posisi relatif ant polypeptide (subunits) dalam sebuah prot.

c. Struktur Tersier ST berkenaan dengan strukt 3 dimensi dr sebuah molekul prot

tunggal; hubungan spasial strukt sekunder satu sama lain -helices and β-sheets melipat kedalam a compact globule.

The folding is driven oleh interaksi hidrophobik non-specific (penguburan residu hydrophobic dr air). Distabilisasi oleh interaksi nonlokal, paling lazim pembentukan a hydrophobic core, ttp juga mell salt bridenganes, ikatan hidrogen, ikatan disulfide , dan modifikasi post-translational.

Ikatan disulfide sangat jarang pd protein cytosolic.

d.Struktur Quater SQ adalah sebuah kumpulan yang lebih besar dr bbrp molekul

protein atau rantai polipeptide.

39

Distabilisasi oleh ikatan disulfide dan interaksi nonkovalen yang sama. Kompleks dua atau lebih polypeptides (misal. multiple subunits)

disebut multimers. Disebut dimer jika mengandung dua subunit, trimer jika

mengandung tiga subunit, dan tetramer jika mengandung empat subunit.

Subunit sering dihubungkan satu sama lain oleh symmetry operations

(misal. heterotetramer , seperti dua rantai alpha and dua beta dari hemoglobin).

Banyak protein tidak mempunyai struktur quarter dan berfungsi sebagai monomer

Domain dan Motif Protein• Motif adalah strukt domain yang karakteristik yang td 2 atau lbh α helices atau β strands.• Contoh : coiled coil, helix-loop-helix, zinc finger, leucine zipper.• Banyak prot juga mengandung domain spesifik seperti “SH2 domain”. (SH : sulfhydril)PROTEIN FOLDING :

Adalah proses fisik yang mana sebuah polypeptide melipat kedalam struktur 3 dimensi fungsional dan karakteristiknya dr random coil

Setiap protein eksis sebagai sebuah polypeptide yang tdk melipat atau random coil ketika ditranslet dari sebuah sekuen mRNA ke sebuah rantai linier asam amino.

As amino berinteraksi dengan satu sama lain untuk menghasilkan sebuah struktur tiga dimensi yang dirumuskan dengan baik.

40

Struktur tiga dimensi yang benar adalah esensial utk fungsi. Kegagalan utk melipat kedalam bentuk yang dimaksudkan

biasanya menghasilkan protein inaktif dengan sifat yang berbeda yang meliputi prion yang toksik.

Bbrp penyakit neurodegeneratif dan yang lain dipercaya berasal dari akumulasi protein misfolded (melipat tdk benar)

a.Helix-Loop-Helix• Dicirikan oleh 2 helices yang dihubungkan oleh loop.• Mirip leucine zipper.• Cont : myoblast determination proteins (MyoD)

b.Leuzine zipper• LZ yang memuat faktor transkripsi berikatan dengan DNA sebagai dimers.• Terbtk oleh 2 α helices, satu dr tiap monomer. Helices dipertahankan oleh interaksi hydrophobic diantara residu leucine, yang terletak pd salah satu sisi setiap helix.• Cont : Transcription factor Jun.

c. Zinc Fingermotif “zinc finger” mengandung 1 atau lbh ionzinc yang penting utk stabilitas struktural.

41

HUMAN GENOME VARIATIONS & EPIGENETICS

dr. Afiono Agung Prasetyo , Ph.D

A. HUMAN GENOME VARIATIONSClasses of genomic variation Sequence variation:

a. substitutions b. insertionsc. deletions d. indels

Structural variationa. 2 bp to 1000 bp b. 1 kb to submicroscopicc. Microscopic to subchromosomal d. Whole chromosomal to whole genome

How to find genes and specific genetic variants responsible for diseases?• Linkage analysis• Genetic markers: Positional cloning• Linkage disequilibrium mapping• Genetic association analysisCopy Number Variation• DNA segments > 1 kb in size in which a comparison of two or

more genomes reveals gains (by insertion or duplication) or losses (by deletions or null genotypes) of genomic copy number relative to a designated reference genome sequence

• copy number polymorphism is present when such variation is present in more than 1% of the reference or general population

CNV-Diet-Drugs Metabolism

42

• Duplication of the salivary amylase gene (AMY1)• high starch diets have more AMY1 copies• in populations with low starch diets there had been genetic drift

and the locus had evolved neutrally• CYP genes encoding cytochrome P450 enzymes• > two active functional copies of a specific CYP gene may show

increased drug metabolism and absence of response at ordinary drug dosages, classified as ‘ultrarapid metabolizers’

• while ‘poor metabolizers’ lack functional enzyme due to defective or deleted genes.

• Lancet 2006: the death of an infant 13 days after birth who had lethal levels of morphine

• Mother: a gene duplication of CYP2D6CNV-multifactorial disease • Psoriasis risk and β defensins copy number– each extra copy increased the relative risk of disease by 34%

• CCL3L1 and HIV-1– inhibits infection of cells by HIV-1 strains using the CC

chemokine receptor 5 (CCR5) – Most people: 1-6 copies of the CCL3L1 gene– higher number of copies : risk was significantly reduced

SATELLITE DNA• Satellite DNA comprises very long arrays of tandem repeats

typically 100 kb to several megabases in size, the repeat unit length varying between 5 and 171 bp.

• Minisatellite DNA arrays are of intermediate size and typically span between 100 bp and 20 kb, with each repeat unit between 6 and 100 bp in length.

43

• Microsatellite DNA comprises short arrays less than 100 bp in size, made up of simple tandem repeats 1–6 bp in length.

Functional Effects of VTR• Modulates transcriptional regulation:– Alternative splicing– Genomic imprinting

• Alter the control of gene expression or the structure and function of the encoded protein

VTR-Diseases• Marker• Repeat instability has been associated with more than 20

diverse neurological disorders, including neurodegenerative and neuromuscular disease– CCTG repeats and dystrophia myotonica type 2– ATTCT repeats and spinocerebellar ataxia type 10– Etc

B. EPIGENETICS Genetics:

a. Genes + their interactionsb. Only a few diseases can be explained by mutations in a

single gene Genomics: Genome

Genomics• Structural genomics: gene libraries, gene maps, complete

sequencing of entire genomes, processing of sequencing data• Comparative genomics: relationships between the genome &

the phenotype

44

• Functional genomics: identify the biologic function of sequenced genes & the proteins they encoded

• Clinical genomics: genome & health• Pharmacogenomics Epigenetic Mecanisms Epigenetic regulation :

a. DNA methylation b. histone modificationsc. post - transcriptional alteration of gene expression

based on RNA interference Epigenetic changes can occur on all building blocks of the

nucleosome to ultimately constitute the epigenome: post-translational histone modifications incorporation of histone variants remodelling of the DNA-histone interaction methylation of DNA association with transcription (co)factors local changes in nucleosome density changes in long-range chromatin interactions and

compaction.

METHYLATION• Basic biological properties of DNA - segments such as gene

density, replication timing and recombination are tightly linked to their guanine – cytosine (CG) content.

• 60 – 90 % of all CpGs are methylated in mammals• Methylated C residues spontaneously deaminate to form T

residues; hence CpG dinucleotides steadily mutate to TpG

45

dinucleotides, which is evidenced by the under-representation of CpG dinucleotides in the human genome (they occur at only 21% of the expected frequency).

• Spontaneous deamination of unmethylated C residues gives rise to U residues, a mutation that is quickly recognized and repaired by the cell

• Unmethylated CpGs are often grouped in clusters called CpG islands, which are present in the 5' regulatory regions of many genes.

CpG islands• GC > 50% and with an observed CpG > 60%.• In mammals: 200 – 3000 bp. • at or near the gene’s transcriptional start• Promoters of tissue - specific genes that are situated

within CpG islands are, normally, largely unmethylated

How cytosine methylation can regulate gene expression?• 5 - methylcytosine can inhibit or hinder the association of

some transcriptional factors with their cognate DNA recognition sequences

• methyl-CpG-binding proteins (MBPs) can bind to methylated cytosines mediating a repressive signal

• MBPs can interact with chromatin forming proteins modifying the surrounding chromatin, linking DNA methylation with chromatin modification

• Mostly, DNA methylation causes a repression of mRNA gene expression, however, when CpG methylation blocks a

46

repressor binding site within a gene promoter, this may induce a transcriptional activation

• Hypomethylation, in general, is linked to chromosomal instability and loss of imprinting.

DNA methyltransferases (DNMTs)• Conduct DNA-methylation at position five of CpG-cytosines • expressed in most dividing cells• Most DNMTs contain a sex-specific germline promoter

which is activated at specific stages during gametogenesis.• Genomic methylation patterns are largely erased during

proliferation and migration of primordial germ cells and re – established in a sex - specific manner during gametogenesis, resulting in a high methylation of the genome.

• Close regulation of the DNMT genes during these stages and during early embryogenesis is needed

• After fertilization, a second phase of large epigenetic reprogramming takes place. Upon fertilization, a strong, presumably active DNA demethylation can be observed in the male pronucleus while the maternal genome is slowly and passively demethylated.

• Imprinting by methylation is maintained for both the paternal and the maternal genome. DNA - demethylation occurs until the morula stage, followed by de novo methylation

HISTONE MODIFICATIONS

47

HISTONE CODE? Through alteration of gene expression and destabilization

of chromatin, histone modifications can have an impact on the risk of cancer

acute promyelocytic leukemias: a chromosomal translocation leads to inappropriate HDACs activity

gastric cancer, esophageal squamous cell carcinoma, and prostate cancer: an increased HADC1 expression

Colon cancer: overexpression of HDAC2 causes a decreased expression of the APC (adenomatous polyposis coli) tumor suppressor gene

in cancer of epithelial origin: an overexpression or mutation of HAT genes

Some lines of lung, breast, and colorectal cancer have in common a mutation which inactivates a specific HAT

MICRO RNAs and siRNA• small non – coding RNAs • Post transcriptionally regulate the expression of

complementary mRNAs • key controllers in cellular processes, including

proliferation, differentiation and apoptosisGENOMIC IMPRINTING• Each autosomal gene is represented by two copies, or alleles, with one copy inherited from each parent at fertilisation. • For the vast majority of autosomal genes, expression occurs from both alleles simultaneously.

48

• In mammals, <1% of genes are imprinted: gene expression occurs from only one allele.

The expressed allele is dependent upon its parental origin• certain genes are expressed in a parent-of-origin-specific manner. It is an inheritance process independent of the classical Mendelian inheritance. Imprinted genes are either expressed only from the allele inherited from the mother (e.g. H19 or CDKN1C), or in other instances from the allele inherited from the father (e.g. IGF-2).• involves methylation and histone modificationsGenomic Imprinting-example• Prader-Willi syndrome & Angelman syndrome are associated with loss of the chromosomal region 15q11-13 (band 11 of the long arm of chromosome 15). – contains the paternally expressed genes (SNRPN and

NDN) and the maternally expressed gene (UBE3A). – Paternal inheritance: Prader-Willi syndrome (hypotonia,

obesity, hypogonadism)– Maternal inheritance: Angelman syndrome (epilepsy,

tremors, smiling facial expression).• NOEY2 (tumor suppressor gene?)– paternally expressed imprinted gene located on

chromosome 1 in humans. – if a person inherits both chromosomes from the

mother, the gene will not be expressed and the individual is put at a greater risk for breast and ovarian cancer.

49

C. X-CHROMOSOME INACTIVATION (LYONIZATION)The genes on the X & Y chromosomes• Y chromosome (122 genes ) – the instructions to make the baby develop as a male

rather than a female• X chromosome (1021 genes) – very important for growth and development; e.g. the

genes that contain the instructions for a major protein in muscles (dystrophin), several proteins that control clotting in the blood and a number of genes involved in the development of intelligence.

• When these particular X chromosome genes are faulty, specific genetic conditions may result: haemophilia, Duchenne and Becker muscular dystrophy and fragile X syndrome– X-linked recessive inheritance• Women who have the faulty gene copy as well as a

‘back up’ working gene copy on the other partner X chromosome copy, means that they are usually unaffected by these conditions

• Men have no other X chromosome to provide ‘back up’ so will usually be affected due to the faulty gene being expressed in the cells

• In order to adjust this potential imbalance between the genetic information in men and women, the cells have a system to ensure that only one copy of most of the X chromosome genes in a female cell is ‘active’. Most of the other genes on the other partner X chromosome copy are

50

‘inactivated’ or switched off. This mechanism ensures that only the genes located on the ‘active’ copy of the X chromosome are able to be used by the cell to direct the production of proteins.

• inactivated X chromosome: Barr body• This system of inactivation in the body cells is usually

random so that women’s bodies have a mixture of cells in regard to the inactivated X chromosome. Some cells will have the X chromosome switched off that came from their mother (an inactive maternal X chromosome); other cells will have the paternal X chromosome inactivated. The relative proportion of cells with an active maternal or paternal X chromosome varies from female to female (even between identical twins) because the process is usually random.

• X-inactivation only occurs in the somatic cells, since both X chromosomes need to be active in the egg cells for their normal development

D. MOLECULAR ASSAYS Profiling of DNA Methylation

bisulphite conversion digestion with methylation sensitive restriction

enzymes capture of methylated DNA fragments using a

recombinant methyl-DNA binding protein domain (MBD) or a monoclonal anti-5-methyl-cytosine antibody

51

Profiling of histone modifications, transcription factors and histone variants ChIP

Bisulphite Conversion Based Methods• chemical conversion of only the unmethylated cytosines to

thymidines, followed by PCR amplification, cloning and sequencing of the obtained fragments

• Methylation-Specific PCR (MSP)• COmbined Bisulphite Restriction Analysis (COBRA)• MethyLight, GoldenGate, etc

METHYLATION SENSITIVE ENZYME• HpaII & MspI only digests 5’-CCGG-3’ sites when the

cytosine in the central CG dinucleotide is unmethylated • BstUI: unmethylated CGCG • McrBC: methylated PumCG capture of methylated DNA fragments• Methylated-CpG Island Recovery Assay (MIRA)

– uses recombinant proteins that recognize dsDNA • Methylated DNA ImmunoPrecipitation (MeDIP)

– uses an antibody that requires ssDNA • MeDIP-seq >>> whole-genome DNA methylation profiles

chromatin immunoprecipitation (ChIP)• using antibodies directed against the protein or histone

modification of interest• quantitative PCR using primers specific for the genomic

region of interest.

52

• for profiling chromatin-associated factors, histone modifications, histone variants as well as local nucleosome density.

CHIP-on-chip & ChIP-seq• CHIP-on-chip: Combining ChIP with genomic tiling array

hybridization• ChIP-seq: massive-parallel sequencing • No gene-specific PCR allows to analyze larger genomic

regions or even the whole genome.

53

REKAYASA GENETIKAdr. Jarot Subandono, M.Kes

DNA REKOMBINAN DAN APLIKASINYA “Genetic Engineering” = Creating organisms with novel genetic

sequences (Reiss and Straughan, 1996). It is the alteration of the genetic makeup of an organism to produce a desired effect.

Genetic Engineering :- Technology involved in removing, modifying, or adding genes to

a DNA molecule.- Technique that transfers gene(s) of interest to develop and

improve plants, animals and other organisms. Steps in Genetic Engineering

1. Isolation of gene of interest2. Isolation of plasmid DNA3. Manipulation of DNA sequence

a. Cutting- Restriction enzymesb. Splicing- DNA ligase

4. Transformation of bacteria5. Selection of “correct” bacteria

Contoh rekayasa genetika : Human insulin Antibodi monoclonal• Limfosit B• Sel Myeloid• Digabung sisi positifnya menjadi sel hibridoma yang

menghasilkan Antibodi Monoklonal .

GENE The gene is the basic unit of heredity. Genes determine our hair,

eye and skin color.

54

A gene is a stretch of DNA which codes for a specific protein. Proteins perform, regulate, or influence all our bodily functions.

DNA 1. DNA kromosom

Berhubungan dengan genetik atau pewarisan sifat2. DNA mitokondria

Tidak berhubungan dengan genetik atau pewarisan sifat. Fungsi : mengkode enzim pernapasan, berhubungan dengan

ATP, penyakit tertentu.

RNA Jenis-jenis RNA :

1. ribosomal RNA (rRNA) 5 S, 5.8 S (160 bp), 18 S (2000 bp) and 28 S (5000 bp) RNA Ribosome structure

2. transfer RNA (t-RNA) small RNA species with characteristic secondary structure

(anticodon, amino acid binding)→ amino acid transfer

3. messenger RNA (mRNA) matrix for protein synthesis at the ribosome, different

length translation

Perbandingan jumlah masing-masing RNASebagai suatu perbandingan pada E. coli didapatkan sebanyak 5%

dari RNA total adalah mRNA sedang rRNA dan tRNA masing-masing adalah 80% dan 15% (Stryer, 2000). Ciri mRNA

- Hanya Ekson- TR

55

- Poly A-identifikasi mRNA- Membawa kodon- Penentu urutan AA

SINTESIS cDNAMeniru pola infeksi virus RNA (lihat animasi) dengan enzim RT mengubah RNA mjd DNA.

a. Sintesis cDNA untai tunggalb. Sintesis cDNA untai ganda

Riboclone®cDNA Synthesis System AMV-RT (Promega)c. Penambahan adaptor EcoRI pada cDNA

Riboclone®EcoRI Adaptor Ligation System (Promega)d. Reaksi fosforilasie. Eliminas Kelebihan Adaptor

(sephacryl S-400)Structural parameters of a gene and of a mRNA (comparison) : Gene- 5‘-flanking region, structural part, 3‘-flanking region- exons (coding) and introns (non-coding)- no real start, no real stopcDNA (mRNA)- 5‘-UTR, coding region, 3‘-UTR- no uncoding region between start and stop- start (cap-site) and stop (poly-A tail)

RESTRICTION ENDONUCLEASES Awalnya untuk mek perlindungan E. coli thd bakteriofaga DEF: endonucleases, which cleave double stranded DNA at

a well defined site (restiction site). Each retsriction enzyme recognized as certain sequence of nucleotides (mostly 4 or 6, but sometimes more)

56

These enzymes are used in molecular biology to cut DNA in well defined pieces of known molecular weight

Medically important substances produced by genetic engineeringHuman Insulin- used to treat diabetes

• Past: extracted insulin from pancreas of cattle and pigs• Today: Human insulin produced from bacteria

PLASMID• Kendaraan Gen• Plasmid tidak dapat hidup sendiri di alam• Plasmid memerlukan sel hospes untuk replikasi• Ekstraksi sel yang mengandung plasmid dari sel bakteri• Plasmid berisi: Replication Origin, Antibiotic resistance gene• Dipotong misalnya dengan EcoR1• DNA fragment inserts into plasmid• Disambung dengan enzim ligase• Menjadi Recombinant Plasmid (Plasmid Rekombinan)

Isolation of Plasmid DNA Lysis by boiling Alkaline lysis Detergents or organic solvents

Using Plasmids• Plasmid is small circle of bacterial DNA• Foreign DNA can be inserted into plasmid

– Forms recombinant plasmids– Plasmid is a cloning vector– Can deliver DNA into another cell

TRANSFORMASI• Sel E coli ditambahkan ke plasmid??

57

• Yang benar Plasmid dimasukkan ke dalam Sel E coli yang disebut Transformasi, dengan heat shock pada suhu 42 selama 56 detik

• Keberhasilan Transformasi sekitar 25%• E coli ditumbuhkan pada media agar yang mengandung

Antibiotik• Sel E coli yang membawa plasmid rekombinan yang membawa

gen yang resisten thd antibiotik akan tetap hidup• Plasmid replikasi• Sel E coli yang membelah masing-masing membawa plasmid

rekombinan misalnya membawa gen yang menyandi protein Insulin

• Koloni bakteri yang membawa rekombinan berwarna putih

Transformation of BacteriaCaCl2 Transformation

• Cells and DNA incubated together in CaCl2 at 0oC, then heat shock at 42oC

• How this makes cells “competent” to take up DNA is not known• Only a small percent of cells take up DNA- must select for them

Newer Methods of Transformation• Lipofectin® and similar molecules• Electroporation• Microinjection

Blue-White ScreeningPromega Corp; Madison, WI

• pGEM-3Z, e.g.– Ampr

– lacZ– polycloning site in lacZ gene– T7 promoter one side, SP6 other

58

TRANSFORMASI pUC 18 pada E. coli XL1-BluePlasmid bereplikasi bebas ttp memerlukan hospesTransformasi:E. coli kom heat shock: 42C, 56 detTumbuhkan pd plate agar diberi Ampi,IPTG,X-GalE.coli tanpa pUC18 mati E.coli dengan pUC18 biru E.coli dengan pUC18rek putih dan diharapkan membawa insert cDNA ditumbuhkan-isolasi plasmid

DEFINITIONS• Recombinant DNA technology: techniques & tools used to

analyze genes• Genetic Engineering: uses the above technology to isolate &

modify genes in organisms or even to insert new genesGenetic Engineering

• Genes are isolated, modified, and inserted into an organism• Made possible by recombinant technology

– Cut DNA up and recombine pieces– Amplify modified pieces

Restriction Enzymes• Molecular scissors that cut DNA at a specific nucleotide

sequence• Over 200 different restriction enzymes are known, each isolated

from bacteria and able to cut DNA in a unique manner

59

BIOTEKNOLOGI BIDANG KEDOKTERANdr. Paramasari Dirgahayu, Ph.D

A. REFRESHING ON CELLS STRUCTURECells Tissues Organs Organs System Cells Typesa. Prokaryotic—no nucleus, circular DNA, ribosomesb. Eukaryotic—larger, nucleus, linear chromosomes,

membranous organelles Eukaryotic cell structure• Nucleus is control center of the cell

1. Membrane bound (nuclear envelope) 2. Contains nucleoli; synthesizes ribosomal RNA 3. DNA in chromosomes (DNA and proteins)

Plasma Membrane Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Lysosomes Mitochondrion Peroxisoe Ribosomes Centrioles : Only in animal cells.

Microtubule-producing center Microtubules : Hollow tubes of globular proteins called

tubulins. Microfilaments Cilia and Flagella Cell Function: Gene Expression And Protein Synthesis

60

Dna Structure Gene

Functional units of DNA “Code” for proteins Humans have 20-25K genes* Only 3% of genome contains genes locus = physical location on a chromosome gene = unit of information (~protein)

Gene Expression genes are located at specific places on the chromosome

(loci) regions corresponding to genes are transcribed sequences flanking the coding sequence control the start

and stop of transcription not all genes are expressed at the same rates or at the

same times

How your cell makes very important proteins??

61

The production (synthesis) of proteins. 3 phases:

1. Transcription 2. RNA processing: Pre-mRNA menjadi mRNA 3. Translation

DNA ® RNA ® Protein RNA differs from DNA

1. RNA has a sugar ribose DNA has a sugar deoxyribose

2. RNA contains uracil (U) DNA has thymine (T)3. RNA molecule is single-stranded DNA is double-stranded

Types of RNAa. messenger RNA (mRNA)b. transfer RNA (tRNA)c. ribosome RNA (rRNA)nb : all types is produced in nucleus

a. mRNA– Carries instructions from DNA to the rest of the ribosome.– Tells the ribosome what kind of protein to make – Acts like an email from the principal to the cafeteria lady.

b. rRNA– Part of the structure of a ribosome– Helps in protein production– Gets the right parts to make the right protein according to

mRNA instructions Transcription

– Then moves along one of the DNA strands and links RNA nucleotides together.

62

RNA Processing

Translation1) initiation: start codon (AUG)2) elongation3) termination: stop codon (UAG)

End Products

63

pre-RNA moleculeintron

intronexon exon exon

exon

exonexonMature RNA molecule

exon exon exonintron intron

splicesomesplicesome

- The end products of protein synthesis is a primary structure of a protein.

- A sequence of amino acid bonded together by peptide bonds.

B. BIOTEKNOLOGI Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari

pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, jamur, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa

Pesatnya kemajuan ilmu Biologi Molekuler memberikan kontribusi nyata terhadap perkembangan ilmu Kedokteran molekuler, khususnya dalam bidang Patobiologi molekuler yang mencakup pemahaman sign & symptom secara lebih mendasar.

Pemahaman gangguan homeostasis pada level molekuler yang belum memunculkan sign & symptom sebagai manifestasi klinik, akan menghasilkan diagnosis molekuler yang bersifat lebih akurat dan dini.

Dokter berhasil mencegah dan menyembuhkan berbagai penyakit yang sampai saat ini sering menjadi masalah yang menakutkan manusia:

1) Diagnosis dini berbasis molekuler2) Teknik fertilasi invitro . Teknik ini dapat membantu pasangan

suami istri yang sulit mendapatkan keturunan karena suatu kelainan dengan jenis kelamin tertentu.

3) Mikrobiologi kedokteran telah berhasil mengidentifikasi beberapa jenis mikroba yang menyebabkan penyakit pada manusia maupun hewan. Dengan demikian, antibiotik untuk mikroba-mikroba tersebut dapat dibuat.

4) Penemuan VAKSIN, Obat

64

5) Penemuan Rekayasa Genetika, Rekombinan Hormon6) Terapi Gen7) Teknik transplantasi (pencangkokan) organ 8) Kloning

RISIKO POTENSIAL1. Gen sintetik dan produk gen baru yang berevolusi dapat menjadi

racun dan atau imunogenik untuk manusia dan hewan.2. Rekayasa genetik tidak terkontrol dan tidak pasti, genom bermutasi

dan bergabung, adanya kelainan bentuk generasi karena racun atau imunogenik, yang disebabkan tidak stabilnya DNA rekayasa genetik.

3. Virus di dalam sekumpulan genom yang menyebabkan penyakit mungkin diaktifkan oleh rekayasa genetik.

4. Penyebaran gen tahan antibiotik pada patogen oleh transfer gen horizontal, membuat tidak menghilangkan infeksi.

5. Meningkatkan transfer gen horizontal dan rekombinasi, jalur utama penyebab penyakit.

6. DNA rekayasa genetik dibentuk untuk menyerang genom dan kekuatan sebagai promoter sintetik yang dapat mengakibatkan kanker dengan pengaktifan oncogen (materi dasar sel-sel kanker).

7. Tanaman rekayasa genetik tahan herbisida mengakumulasikan herbisida dan meningkatkan residu herbisida sehingga meracuni manusia dan binatang seperti pada tanaman.

Beberapa teknik biologi molekuler• Digunakan dalam identifikasi ekspresi genetik/protein secara

kuantitaif/kualitatif • Terpenting:

Preparasi sample : dari Invivo/In Vitro experiment berupa DNA/RNA/Protein?

65

Tentukan metode identifikasi sample1. PCR 2. Western Blot3. Northern Blot4. Southern blot Metoda PCR ? suatu teknologi yang dibuat dengan tujuan dapat membuat

tiruan berlipat ganda secara in-vitro enzymatic amplification dari suatu segmen DNA spesifik.

untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksi

digunakan untuk berbagai aplikasi penting seperti bidang penelitian biologi, genetika, arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik

ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985.Tahapan Proses PCR

Pre – PCR : Preparasi reagensia Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA

PCR : proses amplifikasi Denaturasi (pemisahan rantai DNA)Annealing (penempelan primer)Extension (pemanjangan oleh enzim)

Post – PCR :Deteksi/ Analisa Hasil PCR

Deteksi/ Analisa Hasil PCR

66

Elektroforesis gel agarosa (horizontal)Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)Enzym labelling oligonucleotide Biotin-labelled oligonucleotide Digoxigenin-labelled oligonucleotideSelanjutnya : RFLP, Sequencing dll.

AGAROSE GEL ELEKTROPHORESIS Agarose gel elektophoresis adalah suatu metode untuk

memisahkan molekul DNA atau RNA berdasarkan besar molekulnya (BM).

Pemisahan molekul tersebut dapat terjadi melalui pergerakan asam nukleat yang “negatively charged “menembus matriks agarose dalam tank electrophoresis.

Molekul dengan berat molekul (BM) rendah akan bergerak lebih cepat daripada molekul yang BM nya besar.

Aplikasi penggunaan teknik elektrophoresis :1. Untuk memperkirakan ukuran molekul DNA setelah dilakukan

restriksi dengan enzim digesti tertentu (misal restriction mapping dari clone DNA).

2. Analisis produk PCR, misal untuk kepentingan Analysis of PCR molecular genetic diagnosis atau genetic fingerprinting.

KEUNTUNGAN DAN KERUGIANKeuntungan: sampel dapat dipisahkan dan divisualisasi, akan tetapi karena

agarose gel tidak bersifat mendenaturasi protein, maka sampel yang sudah di “running” tersebut dapat di purifikasi kembali untuk kepentingan pembuatan plasmid

Gel sangat mudah dibuat dan secara praktis hanya dituangkan ke dalam tank

67

Kerugian: Gel tersebut dapat meleleh pada saat elektrophoresis

PRINSIP The DNA fragments will separate according to size. To see the DNA

bands one must stain the gel with ethidium bromide, a fluorescent dye that intercalates DNA, and excite and view the fluorescence by U.V. transillumination.

The gel may also be photographed. Unknown bands may be sized by comparison to molecular weight standards .

The standards should be used to generate a standard curve for interpolation.

BLOTTINGAdalah suatu mekanisme transfer materi (dna/rna/protein) dari agarose gel kepada membran nitrocelluseTujuan: (1). Hibridisasi(2). Penyimpanan material jangka waktu lamaSesuai dengan jenis sampel dibagi menjadi 3 macam: (1). Dna shoutern blotting(2). Rna northern blotting(3). Protein western blottingAlur Blotting :

68

ELISA• The Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, or ELISA, adalah

tehnik biokimia biasanya terutama digunakan pada penelitian immunologi untuk mendeteksi adanya antibodi atau suatu antigen tertentu dalam sebuah sampel.

• Menggunakan 2 macam antibodi. 1st AB adalah spesifik terhadap antigen. 2nd AB adalah Ag-Ab complexes yang dapat berikatan dengan bantuan enzim.

• 2nd AB disebut juga sebagai "enzyme-linked", bisa mengakibatkan substrat chromogenic atau fluorogenic memproduksi signal.

• Karena ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi adanya Ag atau AB pada sampel, maka sangat bermanfaat untuk mendeteksi konsentrasi antibody pada serum (misal pada tes HIV atau or West Nile Virus and juga mendeteksi terdapatnya Ag.

69

DIAGNOSIS DAN TERAPI PENYAKIT GENETIK

1. Prenatal diagnostic

a. Metode invasive Amniocentesis : menggunakan sampel sel embrio yang

terdapat pada cairan amnion (usia kehamilan 16 minggu). Chorionic Villous Sampling : menggunakan sampel yang

diambil dari villi chorialis (usia kehamilan 10 minggu). Cordocentesis : pengambilan sampel sel melalui fetal

umbilical cord. Preimplantation genetic diagnosis : analisa genetik terhadap

embrio yang dihasilkan melalui fertilisasi invitro untuk menyeleksi embrio.

b. Metode non invasive Maternal serum alpha-fetoprotein Maternal serum screening pada trimester I & II USG Isolasi sel fetal dari sirkulasi maternal.

Indikasi invasive prenatal diagnosis : Umur ibu yang lebih dari 35 tahun. Adanya riwayat kelainan genetik pada anak sebelumnya. Adanya kelainan genetik pada orang tua. Adanya riwayat kelainan genetik dalam keluarga orang tua. Adanya riwayat X-linked diseases dalam keluarga.

2. Pemeriksaan biokimiawiSampel : fetal amnion dari Amniocentesis

70

maternal serumContoh : Konsentrasi alpha feto protein.

Konsentrasi fenilalanin (PKU).Konsentrasi gula darah (DM), dll.

3. Pemeriksaan Alpha feto-protein Alpha feto protein (AFP) = glikoprotein yang disintesis oleh fetus

tu/ oleh sel hepar, disekresikan ke dalam sirkulasi darah fetal, ekskresi melalui ginjal ke dalam cairan amnion. AFP melintasi sirkulasi feto-maternal, sehingga dapat dideteksi melalui serum darah maternal.

Peningkatan AFP terjadi pada: Kematian fetus Kontaminasi darah fetus Kehamilan kembar Abnormalitas perkembangan fetus: omphalochele,

NTD/spina bifida

4. Citogenetik dan DNA analisisKromosomal analisis (cytological prosedur) :

Kariotiping G Banding; Q Banding; R banding; C Banding (metaphase). High resolution banding (prometaphase). Syarat: sel dapat hidup dengan cepat pada media kultur (in

vitro) Lymfosit T Kultur sel Lymfosit T Sel yang sedang membelah ditahan

pada metaphase treatment dengan hipotonik solution untuk melepaskan kromosom kromosom difiksasi dilekatkan pada slide pewarnaan (banding teknik).

71

Kariotiping dapat digunakan untuk memerikasa morfologi kromosom

FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) Pemeriksaan segmen kromosom (ada tidaknya kromosomal

rearrangement). Menggunakan DNA probe untuk mengidentifikasi individual

kromosom, segmen, atau gen. Menggunakan fluorochrom. Identifikasai dapat dilakukan pada fase metaphase dan

interphase. Penggunaan lebih dari 1 jenis fluorokrom SKY (Spectral

kariotyping).

CGH (Comparative Genomic Hybridization) Analisa kromosom pada genomic level. Evaluasi segmen DNA yang relatif pendek (<1Mb). Menganalisa jumlah kopi segmen gen pada kromosom. Tidak dapat mengidentifikasi ada tidaknya gene

rearrangement. Usage: identifikasi jumlah kopi gene pada sel kanker

dibandingkan dengan sel normal. Identifikasi adanya delesi/duplikasi dari segmen DNA. DNA sequencing: untuk mengetahui urutan basa nukleotida

pada gene target. Southern Blotting: untuk mengetahui abnormalitas segmen

DNA dengan menggunakan DNA probe.

Indikasi Pemeriksaan Cytologis : Problem tumbuh kembang anak pada fase dini.

72

Bayi lahir mati/kematian neonatal. Problem fertilitas. Riwayat penyakit genetik dalam keluarga. Neoplasia. Kehamilan ibu pada usia lanjut (>35th).

5. Terapi Penyakit GenetikSecara umum pendekatan terapeutik dapat dilakukan pada

berbagai level : Mutant gene

Modifikasi : Transplantasi transplantasi sumsum tulang pada

βthalasemia Terapi gene menggunakan vektor (mis. Virus) Modulasi ekspresi gene agen kimiawi (decitabin pd

sickle sel anemia) Mutant mRNA

Modifikasi : RNAi (RNA interference) untuk mendegradasi mutan RNA

Mutant proteinModifikasi : Protein replacement (penggantian protein FVIII/FIX pada

hemofili) Metabolic/bichemical disfunction

Modifikasi : Diet rendah phenilalanin pada PKU

Clinical phenotypeModifikasi : Transfusi darah pada thalasemia

73

Tindakan operative pada kelainan kongenital (bibir sumbing, CHD)

FamiliIntervensi pada keluarga penderita: Genetik konseling.

6. Terapi Genetik

Syarat umum: Defek gene sudah diidentifikasi. cDNA dari gen terkait dapat dibuat. Patogenesis penyakit sudah diketahui dengan jelas. Manfaat lebih besar dp resiko yang mungkin muncul. Regulasi terhadap gene yang ditransfer dapat dilakukan dengan

ketat. Target sel diketahui dan dapat diakses dengan selektif. Ada bukti yang mengindikasikan keberhasilan dan keamanan

terapi. Mendapatkan persetujuan dari badan terkait.

Teknik terapi genetic Transfer gene menggunakan vektor (viral vektor)

Kriteria vektor yang dapat digunakan: Aman, mudah dikonstruksi, dapat mengakses sel target

dengan selektif, dapat mengekspresikan gene yang dikehendaki (dikoreksi),non-toxic thd sel target.

Jenis virus yang digunakan: retrovirus (RNA virus), Adenovirus, Adeno-associated virus.

Sampai saat ini belum ada virus yang dapat memenuhi kriteria di atas.

74

Transfer dengan non viral vektor cDNA—plasmid, small interfering RNA (siRNA). DNA dalam liposom. Protein-DNA conjugat: DNA dilekatkan pada protein yang

dapat ditangkap oleh reseptor. Artifisial kromosom: komponen kromosom dikombinasikan

dengan cDNA.

Risiko terapi genetik : Respon sellular yang tak dikehendaki terhadap vector. Insersi mutagenesis neoplasma. Insersi gene inaktivasi gene esensial.

75

MUTASI DAN REPARASI DNA

MUTASI DNAMutasi dapat mengakibatkan terjadinya perubahan informasi

genetik. Mutasi dapat terjadi pada tingkat nukleotida, gen, maupun kromosom. Mutasi pada perubahan, urutan, atau susunan satu nukleotida disebut mutasi noktah (point mutation). Mutasi bisa menyebabkan perubahan yang bermakna seperti terjadi pada mutasi missence, dimana pembacaan kodon dari asam amino tertentu salah menjadi asam amino yang lain atau perubahan satu kodon asam amino tertentu menjadi kodon asam amino yang lain, misalnya dari asam amino glutamat menjadi valin sehingga menyebabkan terjadinya anemia sel sabit. Sel sabit merupakan eritrosit yang panjang dan melengkung dengan dua kutub yang runcing. Pada kondisi normal, sel ini tidak ditemukan pada darah. Mutasi bisa tidak terlihat seperti pada, silent mutation, dimana terjadi mutasi namun tidak Nampak karena mutasi tetap menyandi asam amino yang sama dan hanya diketahui saat melakukan analisa DNA (Murray et al,2003).

Mutasi gen merupakan perubahan susunan urutan nukleotida DNA/gena dari aslinya. Beberapa jenis mutasi antara lain :

1. Substitusi basa tunggalTransversi : basa pirimidin → basa purin, atau sebaliknyaTransisi : basa pirimidin → basa pirimidin yang lain

basa purin → basa purin yang lain 2. Delesi : kehilangan nukleotida3. Inversi : penambahan/sisipan nukleotida4. Duplikasi : penggandaan nukleotida

Kodon atau Sandi Genetik Triple Nukleotida

76

Keterangan :1. Mutasi substitusi

ATG CTC CAC CGT AAC GCT TAT TGA→ TansversiATG CTC CAG CGT AAC GCT TAT TGA

ATG CTC CAT CGT AAC GCT TAT TGA→ TransisiATG CTC CAC CGT AAC GCT TAT TGA

77

2. DelesiATG CTC CAC TAA CGC TTA TTG A

3. InsersiATG CTC CAT CCG TAA CGC TTA TTG A

4. DuplikasiATG CTC CAC CCC CGT AAC GCT TAT TGA

Letak Mutasi : Regulator(promoter), splice junction, coding sequences, di dalam intron

Hubungan genotip-fenotip mutasi gena :- Nonsense → stop kodon(terminasi prematur)- Missense → kodon berubah → protein abnormal atau

normal (polimorfisme)- Silence → kodon berubah tapi asam amino sama- Frameshift → susunan kodon rusak- Inframe → susunan kodon terjaga(bias bertambah /

berkurang panjangnya)

Nonsense MutationATG CTC CAC CGT AAC GCT TAT TGA

tyr ↓ATG CTC CAC CGT AAC GCT TAA TGA

Stop

Silence MutationATG CTC CAC CGT AAC GCT TAA TGA his ↓ATG CTC CAT CGT AAC GCT TAA TGA

His

78

Konsep dasar frameshift teory the bad and old dog eat the fat cat- Delesi/insersi nukleotida tidak kelipatan 3 :

the bad and old dog eat the fat cat ↓

the ada ndo idd oga tet hef atc at

- Delesi / insersi nukleotid kelipatan 3 : the bad and old dog eat the fat cat

↓ bad and old dog eat the fat cat

REPARASI DNA Mekanisme Repair DNA

Gen p53 disebut sebagai penjaga genom (the guardian of the genom). Terdapat suatu peningkatan yang cepat dari respon p53 terhadap kerusakan DNA sehingga menyebabkan arrest(penahanan) siklus sel selama G1. Ini memberi waktu bagi sel untuk memperbaiki DNA-nya. Jika perbaikan tidak memungkinkan,p53 menginduksi program cell death yang disebut apoptosis. P53 menghambat pertumbuhan sel dengan aksi sebagai suatu factor transkripsi yang sekuen spesifik, yang meningkatkan transkripsi gen yang mengkode protein dengan aktivitas supresi pertumbuhan (gen WAF1).

Gen WAF1 mengkode protein p21. Over ekspresi p21 dapat menyebabkan supremasi pertumbuhan. Karena kemampuannya mengikat cyclin-dependent kinase (CDK2) maka WAF1 disebut juga CIP1.Aktivasi p53 (karena kerusakan DNA) menghasilkan transaktivasi WAF1 sehingga gen WAF1 menghasilkan protein p21. Protein ini kemudian akan berikatan (membentuk kompleks) dengan cyclin-dependent kinase sehingga menghambat cyclin-dependent kinase. Penghambatan aktivasi kinase ini akan mencegah terjadinya fosforilasi dari pRB (juga merupakan gen protein supresor tumor) dan akibatnya akn terjadi penghentian pelepasan factor transkripsi(E2F-1). E2F-1 tetap terikat dengan pRB → E2F-1 tidak bias berikatan dengan sekuen

79

regulator dari DNA → tidak terjasi sintesis produk gen → siklus sel tidak berlanjut ke fase S tetapi tetap pada fase G1 sampai terjadi perbaikan DNA. Jika perbaikan tidak memungkinkan akan terjadi apoptosis. Bila mekanisme repair DNA dan apoptosis gagal, maka akan terjadi kanker.

P53 yang disebut sebagai penjaga gawang genom, apabila ada kerusakan gen pada tubuh, maka p53 akan berfungsi dengan mencari bagian gen lain yang disebut gen WAF/CIP1 yang akan mengalami transaktivasi sehingga menghasilkan protein p21, protein p21 dapat berikatan dengan cyclin/CDK4 yang mengatur pembelahan sel, sehingga siklus sel berhenti dan kerusakan akan diperbaiki, bila perbaikan atau reparasi gagal akan ditempuh apoptosis. Bila perbaikan dan apoptosis gagal, maka kerusakan tersebut akan dibawa terus-menerus sehingga bias menyebabkan mutasi.

80

DNA

DNA FingerprintSidik jari (1930) ----- Sidik DNA (1989)

Sidik jari dapat diubah dengan di operasi Sidik DNA: - Ada pada semua jaringan

- Tidak dapat diubah

Struktur DNA Struktur molekul:

C (cytosin) G (guanin) A (adenin) T (thymin)

Bangunan dasar nukleotida: gula/sugar desoksiribosa kelompok phosphat 4 nitrogen dasar berpasangan:

A-T; C-G; G-C; T-A

DeterminasiSegmen DNA dideterminasi dari pasangan gula phosphate.DNA membedakan :

- Karakter - Organisme - Individu

Analisis DNA1. Isolasi DNA: darah, rambut, kulit, sperma, dsb.

81

2. Memotong mengukur dan mensortir (restriksi).dengan enzim restriksi asal bakteri:

mis Eco RIpada sequen GAATTC3. - Elektroforesis gel - Transfer DNA ke nylon4. Probing:

- dengan radioaktif- DNA.FP- Pewarna probDNA.FP

5. DNA. FP dengan pewarna prob lagi

Sidik DNA Setelah proses elektroforesis, kemudian diwarnai dengan methylen

blue untuk pewarnaan gel konvensional. Pewarnaan khusus untuk peningkatan penampilan dan

memudahkan pembacaan, dapat diwarnai dengan:- Carolina blue, atau - Quikviem DNAKedua jenis pewarnaan ini dapat mengurangi background dan meningkatkan sensitivity.

Polymerase Chain Reaction (PCR)Reaksi penggandaan DNADiperlukan:- DNA original- dua molekul primer nukleotida utuh - larutan buffer- Taq DNA polimerases (enzim):Fungsi/kegunaanya:- Melipatgandakan DNA dengan cara mengkopi(copy).- Diagnosis untuk mengkonformasi DNA.

82

Proses PCR :1. Denaturasi (suhu 94-96oC)

Dobel helix astrand dipisah.2. Annealing Primer (suhu 50-65oC)

annealing/primer melekat pada masing-masing strand.3. Replikasi DNA (suhu 72oC)

masing-masing strand digandakan.

Aplikasi DNA FP1. Mendiagnosis Kelainan keturunan (genetik) pada janin yang belum

dilahirkan atau pada bayi yang baru dilahirkan.2. Penelitian mengenai kelainan genetik :

Normal bandingkan ßKelainan 3. Bukti biologik: untuk laboratorium forensik.

Penyakit Genetik Perpaduan dari faktor gen makhluk hidup dan faktor lingkungan. Klasifikasi penyakit genetik :

MINI-SATELITVariable Number Tandem Repeat (VNTR)- Pada kromosom manusia ada sequens pendek yang diulang.- Ulangan : dari 1-30 ulangan.- Dapat dipotong pada variasi jumlah tandem repeat: dengan cara

hibridisasi dan probe spesifik.- “TAAGGGCCATAAGGGCCATAAGGGCCA”- VNTR :

Single locus:

83

Memperlihatkan locus-tunggal probe VNTR sangat mudah diinterpretasikan untuk setiap individu dengan band yang tidak lebih dari dua.

Digunakan di Amerika untuk penyidikan forensik dan jejak keturunan. Multi locus:

Memperlihatkan locus-multi probe VNTR, banyak informasi yang dapat dibaca secara simultan dengan band antara 10-30. Tetapi agak susah interpretasinya.

Digunakan di Eropa untuk penyidikan forensik dan jejak keturunan.

84

Single Locus Multi Locus

MEMBRANE STRUCTURE

The fluid mosaic model of membrane structure contends that membranes consist of:-phospholipids arranged in a bilayer.-globular proteins inserted in the lipid bilayer Cellular membranes have 4 components:1. phospholipid bilayer 2. transmembrane proteins3. interior protein network4. cell surface markersMembrane structure is visible using an electron microscope.Transmission electron microscopes (TEM) can show the 2 layers of a membrane.Freeze-fracturing techniques separate the layers and reveal membrane proteins.

Phospholipid Phospholipid structure consists of :

glycerol a 3-carbon polyalcohol acting as a backbone for the phospholipid.

2 fatty acids attached to the glycerol. The fatty acids are nonpolar chains of carbon and hydrogen. Their nonpolar nature makes them hydrophobic (“water-fearing”).

phosphate group attached to the glycerol. The phosphate group is polar and hydrophilic (“water-loving”).

The partially hydrophilic, partially hydrophobic phospholipid spontaneously forms a bilayer:

-fatty acids are on the inside.-phosphate groups are on both surfaces of the bilayer.

85

Phospholipid bilayers are fluid. hydrogen bonding of water holds the 2 layers together. individual phospholipids and unanchored proteins can move

through the membrane. saturated fatty acids make the membrane less fluid than

unsaturated fatty acids. warm temperatures make the membrane more fluid than cold

temperatures.

Membrane Proteins Membrane proteins have various functions:

1. transporters2. enzymes3. cell surface receptors4. cell surface identity markers5. cell-to-cell adhesion proteins6. attachments to the cytoskeleton

Membrane Protein : Peripheral membrane proteins anchored to a phospholipid in one layer of the membrane. possess nonpolar regions that are inserted in the lipid

bilayer. are free to move throughout one layer of the bilayer.

Integral membrane proteins span the lipid bilayer (transmembrane proteins). nonpolar regions of the protein are embedded in the interior

of the bilayer. polar regions of the protein protrude from both sides of the

bilayer.

86

Integral proteins possess at least one transmembrane domain region of the protein containing hydrophobic amino acids. spans the lipid bilayer.

Extensive nonpolar regions within a transmembrane protein can create a pore through the membrane. Β sheets in the protein secondary structure form a

cylinder called a β-barrel. β-barrel interior is polar and allows water and small polar

molecules to pass through the membrane

Passive Transport Passive transport is movement of molecules through the

membrane in which : - no energy is required.- molecules move in response to a concentration gradient.

Diffusion is movement of molecules from high concentration to low concentration .

Selective permeability: integral membrane proteins allow the cell to be selective about what passes through the membrane.

Channel proteins have a polar interior allowing polar molecules to pass through. Channel proteins include:-ion channels allow the passage of ions (charged atoms or molecules) which are associated with water.-gated channels are opened or closed in response to a stimulus.-the stimulus may be chemical or electrical.

Carrier proteins bind to a specific molecule to facilitate its passage. Carrier proteins bind to the molecule that they transport across the membrane.

87

Facilitated diffusion is movement of a molecule from high to low concentration with the help of a carrier protein.-is specific-is passive-saturates when all carriers are occupied

Osmosis is the movement of water from an area of high to low concentration of water or movement of water toward an area of high solute concentration. When 2 solutions have different osmotic concentrations :-the hypertonic solution has a higher solute concentration-the hypotonic solution has a lower solute concentrationOsmosis moves water through aquaporins toward the hypertonic solution.Organisms can maintain osmotic balance in different ways.1. Some cells use extrusion in which water is ejected through contractile vacuoles.2. Isosmotic regulation involves keeping cells isotonic with their environment.3. Plant cells use turgor pressure to push the cell membrane against the cell wall and keep the cell rigid.

Active Transport Active transport

-requires energy – ATP is used directly or indirectly to fuel active transport.-moves substances from low to high concentration.-requires the use of carrier proteins.

Carrier proteins used in active transport include:-uniporters – move one molecule at a time-symporters – move two molecules in the same direction

88

-antiporters – move two molecules in opposite directions Sodium-potassium (Na+-K+) pump

-an active transport mechanism-uses an antiporter to move 3 Na+ out of the cell and 2 K+ into the cell-ATP energy is used to change the conformation of the carrier protein-the affinity of the carrier protein for either Na+ or K+ changes so the ions can be carried across the membrane.

Coupled transport -uses the energy released when a molecule moves by diffusion to supply energy to active transport of a different molecule.-a symporter is used.-glucose-Na+ symporter captures the energy from Na+ diffusion to move glucose against a concentration gradient.

Bulk Transport Bulk transport of substances is accomplished by :

1. endocytosis – movement of substances into the cell2. exocytosis – movement of materials out of the cell

Endocytosis occurs when the plasma membrane envelops food particles and liquids.1. phagocytosis – the cell takes in particulate matter.2. pinocytosis – the cell takes in only fluid.3. receptor-mediated endocytosis – specific molecules are taken in after they bind to a receptor.

Exocytosis occurs when material is discharged from the cell.-vesicles in the cytoplasm fuse with the cell membrane and release their contents to the exterior of the cell.-used in plants to export cell wall material.

89

-used in animals to secrete hormones, neurotransmitters, digestive enzymes.

90

DNA REKOMBINANMujosemedi, Drs, M.Sc

Adalah suatu bentuk DNA (secara natural tidak ada) yang diciptakan dengan mengombinasikan sequence-sequence DNA yang secara normal tidak akan terjadi bersama.

Dalam istilah modifikasi genetik, DNA rekombinan (rDNA=recombinant DNA) diintrodusir lewat penambahan DNA yang relevan ke dalam DNA pada organisme hidup, misalnya plasmid bakteri, untuk mengkode atau mengubah sifat yang berbeda untuk maksud tertentu, misalnya resisten antibiotik.

Protein rekombinan diperoleh dari DNA rekombinan.

REKAYASA GENETIKA (genetic engineering)

Rekayasa genetika = teknologi DNA rekombinan = modifikasi/manipulasi genetik = gene splicing = istilah yang diaplikasikan untuk manipulasi langsung pada suatu gen organisme.

Rekayasa genetika berbeda dengan perkembangbiakan tradisional di mana gen-gen organisme dimanipulasi tidak secara langsung. Rek genetika menggunakan teknik molecular cloning dan transformasi untuk mengubah struktur dan karakteristik gen-gen secara langsung.

Langkah2 dalam rek genetika :

1. Isolasi gen yang diinginkan (interest). Diperoleh dengan mengidentifikasi gen interest untuk

diinsersikan. DNA (gene interest) dapat diperoleh dari cDNA

(complementary DNA=hasil transkripsi balik dari mRNA)

91

atau gDNA (genomic DNA) libraries yang diamplifikasi dengan teknik PCR.

Insersi gDNA eukaryote ke dalam DNA prokaryote perlu modifikasi, seperti penghilangan intron atau ligasi (penyambungan) promotor prokaryote.

2. Insersi gen ke dalam vektor. Dilakukan setelah gen interest diisolasi dan dipotong

dengan enzim restriksi endonuklease. Kemudian potongan gen ini diinsersikan ke dalam vektor yang telah dipotong dengan enzim restriksi yang sama.

Vektor ekspresi paling tidak mempunyai :a) Promotor sebagai kontrol ekspresi.b) Multiple cloning sites (MCS) tempat insersi gen

interest.c) ORI (origin of replication) kontrol replikasi.d) Selectable marker (antibiotic resistance gene) uji

tapis(screening).

Plasmid : adalah molekuler sirkuler kecil dari DNA rantai ganda yang terdapat secara alami dalam sel bakteri dan yang bereplikasi secara bebas dari genome.•Polylinker : dapat dipotong beberapa enzim

restriksi.•Gen resisten terhadap antibiotik amplifikasi

selektif.•Origin of replication (ORI) : untuk replikasi di dalam

sel inang. Bacteriophage [lamda] :

92

• Adalah virus yang dapat menginfeksi bakteri• Genome [lamda] = 49 kb dapat membawa DNA

asing 15 -25 kb. Cosmids : vektor kloning yang berasal dari

bacteriophage [lambda] dapat membawa fragmen DNA yang besar di dalam & di luar sel.• Efisiensi transformasi tinggi.• Dapat membawa DNA asing hingga 45 kb.

YACs(Yeast artificial chromosomes) :• Dapat membawa fragmen DNA hingga 2 Mb.

3. Transfer vektor ke dalam organisme yang dimodifikasi.a) Kompeten sel (CaCl2) diberi perlakuan Heat shock : 42°C

selama 90 detik dalam es selama 2 menit.b) Liposomes: vesikula (gelembung) dari lipid bilayer atau

monolayer dapat fusi dengan sel.c) Bacterial conjugation = transfer material genetik antar

bakteria melalui kontak langsung sel ke sel.d) Electroporation: sebuah teknik untuk mengubah

permeabilitas membran plasma sel yang memfasilitasi introduksi DNA asing ke dalam sel dengan memakai suatu arus listrik.

e) Gene gun atau sistem pengiriman partikel biolistic yang semula dirancang utk transformasi tumbuhan adalah sebuah alat untuk menginjeksi sel-sel dengan informasi genetik. Payload adalah sebuah partikel unsur logam berat dilapisi dengan DNA plasmid. Teknik ini sering berkenaan dengan biolistics.

4. Transformasi sel-sel organisme.

93

5. Seleksi the genetically modified organism (GMO) dari orang yang tidak berhasil dimodifikasi. Ditumbuhkan dalam medium yang mengandung antibiotik. Warna koloni: blue-white screen. Sel kompeten

ditumbuhkan dalam media yang mengandung X-gal.Jika ligasi berhasil koloni bakteri berwarna putihJika tidak berhasil koloni bakteri berwarna biru

Beberapa produk DNA rekombinan digunakan dalam terapi manusia: Insulin untuk diabetes.Faktor VIII untuk pria penderita hemofilia A.Human growth hormone (HGH).Erythropoietin (EPO) untuk pengobatan anemia.Beberapa tipe interferon dan interleukin.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)

untuk menstimulasi sumsum tulang setelah transplantasi sumsum tulang.

Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) untuk menstimulasi produksi neutrophil.

Tissue plasminogen activator (TPA) untuk melarutkan darah yang membeku.

94