BIOTEKNOLOGI MAKALAH

of 50/50
MAKALAH BIOTEKNOLOGI KARAKTERISASI DAN ASPEK BIOANALITIK PROTEIN REKOMBINAN Disusun oleh : Jaka Julian Kusuma (08111006010) Muhammad Arief Akbar (08111006036) Okta Hafsy (08111006044) Program Studi Farmasi
  • date post

    18-Nov-2015
  • Category

    Documents

  • view

    216
  • download

    40

Embed Size (px)

description

farmasi

Transcript of BIOTEKNOLOGI MAKALAH

MAKALAH BIOTEKNOLOGIKARAKTERISASI DAN ASPEK BIOANALITIK PROTEIN REKOMBINAN

Disusun oleh :Jaka Julian Kusuma (08111006010)Muhammad Arief Akbar (08111006036)Okta Hafsy (08111006044)

Program Studi FarmasiFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Sriwijaya2014BAB IPENDAHULUANProtein(akar kataprotosdaribahasa Yunaniyang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organic kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.Protein merupakan blok pembangun dasar hewanhewan dan oleh karenanya memiliki daya tarik utama bagi para biokimiawan. Protein ini merupakan konstituen utama penyusun tubuh mulai dari jaringan kulit, jaringan syaraf, tendon, otot, rambut, dan darah. Protein adalah sel penyusun tubuh yang eksis menyusun semua sel hidup. Oleh karena protein itu merupakan konsriruen utama enzimenzim dan banyak hormon yang berfungsi untuk mengontrol fungsi tubuh.Protein adalah salah satu makrobiomolekular yang berfungsi sebagai pembentuk strukur sel dari pada makhluk hidup termasuk manusia. Protein adalah polimer dari asamasam amino yang tersambung melalui ikatan peptida, oleh karenanya dapat juga disebut sebagai polipeptida. Hal ini yang menarik bahwa protein pada semua bentuk kehidupan (organisme) mengandung hanya 20 jenis asam amino, namun interkoneksinya menghasilkan ragam makhluk hidup yang tak terhingga banyaknya.Protein mempunyai fungsi khas yang tidak dapat digantikan oleh zat kimia lain, yaitu membangun serta memelihara sel-sel dan jaringan tubuh. Protein merupakan zat gizi yang paling penting. Karena yang paling erat hubungannya dengan proses kehidupan.Didalam sel protein terdapat protein struktural maupun protein metabolik. Molekul protein mengandung unsur-unsurC,H,O dan unsur khusus yang terdapat didalam protein dan tidak terdapat didalam molekul karbohidrat maupun lemak yaitu nitrogen (N).Protein adalah senyawa kompleks yang tersusun atas unsur-unsur C,H,O dan N. Namun demikian ada pula protein yang mengandung unsur S dan P. Kelenjar ludah dalam mulut tidak membuat enzim protease. Enzim protease baru terdapat dalam lambung, yaitu pepsin yang mengubah protein menjadi albuminosa dan pepton.Kemudian, tripsin dalam usus duabelas jari yang berasal dari pankreas mengubah sisa protein yang belum sempurna menjadi albuminosa dan pepton. Dalam usus halus, albuminosa dan pepton seluruhnya diubah oleh enzim pepsin menjadi asam-asam amino yang siap untuk diserap.Protein yang telah di ubah kedalam bentuk asam amino mempunyai sifat larut dalam air. Seperti halnya hidrat arang, asam amino yang mudah larut dalam air ini juga dapat diserap secara pasif dan langsung memasuki pembuluh darah.Ketika protein mengalami hidrolisis total, akan dihasilkan sejumlah 20-24 jenis asam amino, tergantung dari cara menghidrolisisnya. Ada 3 cara yang dapat ditempuh untuk menghidrolisis protein yaitu hidrolisis asam, hidrolisis alkalis, dan hidrolisis enzimatik.Struktur umum asam amino terdiri atas beberapa bagian:1.Gugusan amino2.Gugusan karboksil3.Gugusan sisa molekul (molecular rest)Perbedaan asam amino yang satu dengan yang lainnya terletak pada struktur sisa molekul R. Asam amino yang tidak dapat disintesis oleh tubuh disebut asam amino esensial. Untuk orang dewasa terdapat 8 jenis asam amino esensial, yaitu lisin, leusin, isoleusin, valin, treonin, fenilalanin, metionin, triptofan, sedangkan untuk anak-anak yang sedang tumbuh, ditambahkan dua jenis lagi, ialah histidin dan arginin. Dalam molekul protein, asam-asam amino saling dirangkaikan melalui reaksi gugusan karboksil asam amino yang satu dengan gugusan amino dari asam amino yang lain, sehingga terjadi ikatan yang disebut ikatan peptida.

BAB IIISIA. Perkembangan protein rekombinanPerkembangan protein rekombinan sebagai obat farmasi dituntut agar senseitif dan spesifitas uji analitik sebagai obat yang di murnikan dengan mengikuti fisikokimia sebagai biologis, dan uji bioanalitik untuk menghitung protein atau mengetahui aktifitas biologis mantrik. Di masa depan, akan ada lebih besar penekanan (bio) analitis suatu zat karena meningkatnya jumlah aktivitas biologis dibidang klinis, dan munculnya obat asli biologis serta senaywa tersebut harus di evaluasi untuk penggunaan klinis. Pengembangan metode dan protokol uji bioekuivalensi dari obat asli dan obat generik yang merupakan prioritas utama FDA menurut Komisaris FDA.Ruang lingkup artikel ini adalah membahas metode analisis yang digunakan untuk mengkarakterisasi pemurnian protein rekombinan dalam tahap pengembangan obat yang berbeda, serta membahas metode bioanalitik yang berfokus pada validasi dan standarisasi sebagai penentuan imunogenisitas dari terapi protein.

B. Karakterisasi dari Pemurnian Protein RekombinanI. Pemurnian dan PengotorSuatu pemurnian dari senyawa biologis sangatlah sulit. Modifikasi reguler dan kadang-kadang hanya protein halus seperti glikosilasi, pembentukan ikatan alternatif disulphide, deamidation, oksidasi, fosforilasi, asetilasi, sulfasi, sulfoksidasi, carboksilasi, dan pembentukan piroglutamate menyebabkan jenis protein yang mungkin memiliki karakteristik yang kurang lebih berbeda. Variasi protein dipotong dan mungkin di tampilkan oleh sisi alternatif awal dari trasnkripsi, melalui ikatan peptida akhir yang prematur proses elongasi, atau kegiatan dari inang sel peptida. Peptide mapping dan spektrometri massa biasanya mendeteksi beberapa dari jenis protein. Untuk menganalisa beberapa jenis protein esesnsial, sebagai fitur fisikokimia mungkin tidak akan berebeda dengan lainnya. Dari kemungkinan jenis protein yang di tampilkan dalam preparasi, disarankan dalam pemurnian protein obat oleh dua metode independen, metode tersebut menggunakan prinsip perbedaan fisikokimia seperti elektroporesis jel SDS-polycrylamide dan fase balik pada HPLC.Beberapa contoj, obat mengandung protein berkonjugasi untuk berefek sebagai radioisotop, toksin, atau beberapa protein seperti sitokin yang dapat menimulkan efek biologis. Disamping mempertimbangkan smua aspek untuk komponen individual sebagai konjugat.

II. IdentitasTes identitas bertujuan untuk mengkonfirmasikan komposisi molekul dan, jika secara teknis mungkin dan alasan secara komersial, struktur zat obat, dan dengan demikian harus cocok untuk memungkinkan pendeteksian bahkan perubahan kecil komposisi molekul dalam obat.

III. Kuantifikasi Protein Banyak uji fisikokimia ditetapkan untuk mengukur massa protein. Meskipun mudah dilakukan, uji kolorimetri mengalami ketidakakuratan yang disebabkan oleh penggunaan yang tidak standar seperti bovine serum albumin. Jika standar yang relevan tidak tersedia, analisis asam amino kuantitatif, dengan metode nitrogen Kjeldahl atau gravimetri sebagai sangat akurat tetapi memakan waktu alternatif dapat diterapkan. Bioassay dan immunoassay juga digunakan untuk menghitung jumlah protein, yang dapat divalidasi secara akurat dalam pengukuran dan memerlukan standar acuan.

IV. Stabilitas, Penyimpanan, dan SterilitasStudi stabilitas meliputi evaluasi fitur-fitur protein yang rentan untuk berubah selama penyimpanan serta dapat mempengaruhi kualitas, keamanan, dan efektifitas. Pengujian harus mencakup fisikokimia, aspek biologi, dan mikrobiologi. Uji stabilitas adalah prosedur anaslis untuk memvalidasi secara kuntatif yang dapat mendeteksi perubahan obat dari waktu ke waktu. Uji ini harus mencakup tes integritas obat, potensi, sterilitas, dan, jika berlaku sepeerti: kelembaban, pH, dan stabilitas pengawet yang diukur secara berkala. Selain stabilitas dan sterilitas, karakteristik sampel lainnya seperti penampilan (warna, kejernihan, partikulat), waktu disolusi, dan osmolalitas juga harus dijelaskan untuk produk obat dalam pengemasan akhir. Meskipun obat biologis mungkin kehilangan aktifitas substansi dalam waktu penyimpanan, prosedural pengawasan telah memberikan sedikit panduan mengenai pelepasan dan waktu paruh.

V. Spesifisitas dan Reaksi SilangTes ini harus dirancang untuk memungkinkan evaluasi khusus saat interaksi obat dengan sasaran, satu dari tiga jenis uji untuk penilaian spesifitas:1. Tes Pengikat2. Penentuan sifat molekul3. Imunohistokimia (IHC)

C. Validasi Uji Bioanalytical Bagian ini berfokus pada metode bioanalitis yang tervalidasi diterapkan untuk studi praklinis dan klinis seperti studi bioavailabilitas dan studi bioekivalensi. Sedangkan molekul kecil biasanya dianalisis dengan kromatografi dan spektrometri massa, protein rekombinan terutama di karakterisasi oleh biokimia dan uji berbasis sel. Beberapa format uji yang berbeda, sebagaimana telah disebutkan sebelumnya, secara umum dapat digunakan seperti ELISA, fluoroimuno assay (FIA), dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay (DELFIA), RIA, dan SPR.

I. Metode PenetapanUntuk pengaturan ulang metode bioanalitik, standar kalibrasi dan kontrol kualitas didalam standar referensi sampel yang dibutuhkan. Dokumentasi dari standar referensi idealnya meliputi beberapa angka sebagai sertifikasi dari analisis, stabilitas, identitas dan pemurnian. II. Pra-studi ValidasiMeliputi Selektivitas, Uji Kalibrasi, Akurasi dan Presisi, Linearitas serta evaluasi Stabilitas.

III. Studi ValidasiSecara umum, metode divalidasi digunakan dalam pengembangan praklinis untuk toxicokinetic studi dan dalam pengembangan klinis untuk semua studi di mana farmakokinetik yang dievaluasi.

IV. Imunogenisitas Protein rekombinanSaat ini, beberapa biotherapeutics dalam uji klinik adalah dari manusia atau komposisi manusiawi. Pada pasien, orang akan berharap obat ini tidak kenali dan tidak serang sistem kekebalan tubuh. Oleh karena itu, imunogenisitas protein rekomboinan harus terkonsentrasi tinggi dalam regulasi industri.

Ekspresi protein rekombinan adalah pembuatan protein yang berasal dari DNA rekombinan. Ini adalah teknik umum dalam biologi molekuler dan dalam produksi farmasi pengganti hormon. DNA rekombinan adalah bagian tertentu dari gen dirancang untuk mengekspresikan satu produk dalam sel inang, dipandu oleh faktor kimia khusus sehingga protein yang tepat dinyatakan dalam jumlah besar. Banyak hormon dan enzim yang secara historis berasal dari sumber hewani sekarang disintesis oleh ekspresi protein rekombinan, kemudian dipanen dan dimurnikan dari sel inang.Untuk mengekspresikan protein rekombinan, sekuens dipilih dengan cermat DNA harus dimasukkan ke dalam genom inang. Mengambil bagian dari kode genetik dari satu organisme dan menempatkan ini ke dalam inti sel yang lain adalah bentuk kloning. Hal ini dilakukan melalui penyisipan urutan DNA rekombinan yang mengkode untuk protein yang diinginkan ke dalam inti, yang memulai ekspresi gen dengan menyalin ke RNA. Protein rekombinan dirakit ketika potongan mRNA membawa informasi dari DNA bermigrasi ke ribosom dari inti sel, dan ada memulai produksi protein yang sesuai dengan template tertentu.Sel inang akan membuat jumlah cukup protein rekombinan kecuali DNA diperkenalkan dengan vektor yang tepat sehingga informasi genetik yang tepat akan dinyatakan dalam jumlah yang mencukupi. Faktor ekspresi protein adalah sinyal molekuler yang harus menyertai DNA rekombinan saat dimasukkan ke dalam sel inang untuk memastikan bahwa protein target akan lebih dari-disajikan. Ini adalah satu-satunya cara ekspresi protein rekombinan dapat membuat cukup zat untuk keperluan farmasi atau laboratorium.Perakitan protein ribosom tidak menyelesaikan proses ekspresi protein karena selama panen isi sel bakteri atau ragi bisa dicampur dengan produk akhir. Ekspresi Protein rekombinan harus dimurnikan dengan pemisahan dari potongan-potongan bagian-bagian sel hancur. Kadang-kadang tag melabeli molekul protein sehingga dapat mengikat zat logam atau lainnya dan diisolasi dari limbah. Ada juga teknik yang berbeda, tergantung pada faktor-faktor seperti ukuran protein dan kompleksitas sel inang.Manusia memiliki aplikasi komersial dan medis yang luas tentang ekspresi protein rekombinan. Banyak hormon, antibodi, dan enzim sebelumnya diekstraksi dari jaringan hewan atau mayat namun kini diproduksi secara sintetis dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan. Dua contoh sangat penting adalah hormon pertumbuhan manusia dan insulin. Banyak terapi penggantian hormon bergantung pada protein sintetis, seperti melakukan berbagai tes yang digunakan oleh ahli biologi molekuler dan seluler di laboratorium mereka. Dalam banyak kasus, bakteri yang digunakan sebagai sel inang untuk produk sederhana, sementara ekspresi protein rekombinan yang lebih kompleks, terutama gen dari hewan, dapat dilakukan dalam jamur dan ragi. ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEINPemurnian protein adalah serangkaian proses yangyang dimaksudkan untuk mengisolasi satu jenisproteindari campuran kompleks. Pemurnian protein sangat penting untuk karakterisasi struktur, fungsi dan interaksi dari suatu protein. Bahan awal biasanya adalahjaringan biologisatau budaya mikroba. Berbagai langkah dalam proses pemurnian dapat bebas protein dari matriks yang batas-batas itu, memisahkan protein dan bagian non-protein campuran, dan akhirnya memisahkan protein yang diinginkan dari semua protein lainnya. Langkah Pemisahan dapat mengeksploitasi perbedaan (misalnya) protein ukuran, sifat fisika-kimia, afinitas mengikat dan aktivitas biologis.Metode yang digunakan dalam pemurnian protein secara umum dapat dibagi menjadi 2 yaitu metode analisis dan preparatif. Metode analisis bertujuan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi protein dalam campuran, sedangkan metode preparatif bertujuan untuk menghasilkan jumlah besar protein untuk keperluan lain, sepertibiologi strukturalatau penggunaan industri. Pemurnian ProteinLangkah-langkah yang biasanya ditempuh untuk pemurnin protein adalah sebagai berikut:1.Mengembangkan suatu assay untuk protein yang diinginkan2.Menentukan sel atau jaringan/organ sumber protein3.Mengisolasi sel atau jaringan tersebut dengan sentrifugasi4.Melepaskan protein dari sumber tersebut dan melarutkannya dalam cairan buffer5.Mengisolasi seluruh atau sebagian protein dengan salting out.6.Memurnikan protein dengan salah satu teknik atau kombinasi teknik pemurnian seperti ion exchange adsorption, size exclusion dan affinity chromatography dan isoelectric focussing.Langkah pertama dalam pemurnian protein tertentu kebanyakan dilakukan dengan teknik pengendapan. Teknik ini terutama ditujukan untuk memisahkan protein dari senyawaan bukan protein yang terlarut. Protein dapat diendapkan dengan penambahan garam (salting out), pengaturan pH, pengaturan suhu dan penambahan pelarut organic seperti alcohol atau aseton. Namun beberapa jenis protein tidak dapat diendapkan dengan garam, bahkan penambahan garam akan mempertinggi kelarutannya (salting in). sifat protein seperti ini dapat juga digunakan untuk pemurnian protein tersebut. Sentrifugasi banyak digunakan untuk mempercepat pengendapan protein.Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm. Fraksinasi dengan salting outBanyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama berdasarkan ukuran molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari larutan dengan menambahkan garam, proses dari ukuran molekul protein yang lebih besar ke ukuran yang lebih kecil. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut"salting out".Metode "salting out" ini mungkin bergantung pada fenomena fisik, dua fenomena tersebut yang penting di antaranya adalah penghentian dari daya tarik dari permukaan protein oleh ion garam dan perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh kompetisi dari ion dari garam dengan air.Salting outmerupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya. Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein.Suatu campuran protein, seperti yang dapat diekstraksi dari jaringan dengan menggunakan atau larutan garam encer, dapat dipisah-pisahkan dengan penambahan sedikit demi sedikit ammonium sulfat. Pertama-tama globulin akan diendapkan dan kemudian dapat dipisahkan dengan sentrifus atau dengan penyaringan. Albumin mengendap apabila ammonium sulfat dalam larutan tersebut telah jenuh. Pemisahan dengan menggunakan garam ini, digabungkan dengan perubahan keadaan keasaman larutan dapat memisahkan campuran protein dengan cukup baik. Pemurnian selanjutnya mungkin memerlukan prosedur kromatografi yang lebih teliti.Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang.Kegunaan dari ammonium sulfat untuk pemisahan protein adalah untuk mempercepat dalam menghubungkan klasifikasi dari albumin dan globulin. Sodium sulfat lebih sesuai untuk pemisahan analitik dari plasma protein.Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae Sistem ekspresi prokariot biasanya digunakan untuk memproduksi protein heterolog (rekombinan) dari cDNA eukariot yang dikloning. Akan tetapi, pada beberapa penelitian, protein yang disintesis oleh bakteri tersebut tidak stabil atau tidak punya aktifitas biologi. Selain itu, meskipun kita menggunakan prosedur pemurnian protein yang sangat hati-hati, senyawa yang bersifat toksin pada bakteri dan senyawa yang menyebabkan kenaikan temperatur tubuh manusia dan binatang (pyrogen) mungkin dapat mengkontaminasi produk. Untuk mengatasi masalah ini beberapa peneliti telah mengembangkan sistem ekspresi protein eukariot, yaitu ragi, serangga atau sel mamalia untuk memproduksi protein-protein terapetik yang tidak terkontaminasi, sehingga dapat digunakan oleh manusia atau binatang dengan jumlah yang banyak dan stabil; aktif secara biologi untuk studi biokimia, biofisik, dan struktur; dan protein yang digunakan untuk proses industri. Selanjutnya, protein manusia yang ditujukan untuk penggunaan medis harus identik sifatnya dengan protein natif. Ketidakmampuan prokariot untuk memproduksi versi autentik dari protein eukariot, pada umumnya disebabkan oleh pelipatan protein yang tidak tepat dan tidak adanya mekanisme modifikasi pasca translasi. Pada eukariot terdapat enzim Protein Disulfida Isomerase (PDI) yang mengkatalisis pembentukan ikatan disulfida pada protein. Pembentukan ikatan disulfida yang menyimpang akan merubah konfigurasi protein, sehingga menyebabkan protein tidak stabil dan kehilangan aktifitas. Terdapat beberapa tipe modifikasi pasca translasi. Beberapa urutan asam amino pada N-terminal biasanya dibuang melalui pemotongan proteolisis protein precursor untuk menghasilkan protein fungsional. Penambahan gula spesifik (glikosilasi) terhadap asam amino tertentu merupakan modifikasi utama yang memberikan stabilitas dan sifat pengikatan yang khusus terhadap protein. Glikosilasi yang umum terjadi adalah pengikatan gula spesifik ke gugus hidroksil dari asam amino serin atau asparagin (O-linked glicosylation), dan gugus amida dari asparagin (N-linked glycosylation) (gambar 1). Sekitar 30% protein mamalia mengalami glikosilasi.

Kenyataanya tidak ada sel inang eukariot yang efektif secara universal, dimana proses modifikasi terjadi dengan benar untuk setiap protein. Dalam beberapa kasus, sel inang mungkin menambahkan gula yang tidak lazim ke asam amino yang tidak tepat sehingga menghasilkan protein antigen atau mungkin protein yang mempunyai fungsi yang tidak tepat. Walaupun beberapa protein rekombinan, mungkin memiliki sifat-sifat yang tidak cocok untuk agen terapeutik, tapi masih bisa dimanfaatkan untuk penelitian atau proses industri. Sistem ekspresi eukariot yang berbeda harus dicoba untuk menentukan sistem mana yang dapat mensintesis protein rekombinan yang fungsional dan dalam jumlah besar. Pemilihan vektor ekspresi tergantung pada kualitas protein rekombinan yang akan diproduksi, penggunaannya, dan biaya produksi dan purifikasi juga penting untuk dipertimbangkan. Pada prinsipnya vektor ekspresi eukariot tidak berbeda dengan vektor ekspresi prokariot. Vektor ekspresi eukariot memiliki promotor eukariot yang menjalankan transkripsi gen yang dikloning, signal terminasi transkripsi dan translasi, urutan yang dapat menyebabkan mRNA mengalami poliadenilasi, dan gen penanda untuk menyeleksi klon yang positif. Karena prosedur DNA rekombinan secara teknik sulit untuk dilakukan menggunakan sel eukariot, kebanyakan vektor eukariot merupakan suttle vector dengan dua origin of replication (ORI) dan gen penanda seleksi. Salah satunya berfungsi di E. Coli dan yang lain berfungsi di sel inang eukariot. Jika vektor ekspresi eukariot akan digunakan sebagai plasmid, maka vektor itu harus mempunyai ORI eukariot. Alternatif lain, jika vektor itu didisain untuk integrasi ke kromosom, maka harus mempunyai urutan yang komplemen dengan urutan pada inang untuk memfalisitasi insersi ke kromosom. Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae. Saccaromyces cerevisiae telah digunakan sebagai inang untuk ekspresi gen eukariot dengan alasan-alasan sebagai berikut: 1. Ber-sel tunggal dan sudah dipelajari secara genetik maupun fisiologi. 2. Beberapa promotor gen yang kuat telah diisolasi dari ragi ini dan dikarakterisasi. S. cerevisiae secara alami mengandung plasmid yang disebut plasmid 2m dan dapat digunakan sebagai vektor ekspresi. 3. S. cerevisiae mempunyai mekanisme modifikasi pasca translasi. 4. Ragi ini biasanya mensekresikan beberapa protein. Jadi apabila protein heterolog direkayasa untuk dibebaskan secara ekstraselular, maka produk dapat segera di purifikasi. 5. Karena sudah bertahun-tahun digunakan pada industri makanan, S. cerevisiae sudah didaftarkan oleh U.S Food and Drug Administration sebagai organisme generally recognize as safe (GRAS). Oleh karena itu penggunakan organisme ini untuk produksi agen terapetik manusia (drug or pharmaceuticals) tidak membutuhkan penelitian secara ekstensif seperti yang diwajibkan untuk inang yang belum terjamin keamanannya. Dewasa ini terdapat sejumlah protein yang telah diproduksi di S. cerevisiae, dan digunakan secara komersial sebagai vaksin, agen terapeutik, dan untuk diagnosa (table 1). Sebagai contoh lebih dari 50% suplai insulin dunia diproduksi oleh S. cerevisiae.Tabel 1 Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae. Protein rekombinan Kegunaan

Antigen permukaan virus hepatitis B Protein circumsporozoide malaria Envelope protein HIV-1 Vaksin

Protein virus hepatitis C Antigen HIV-1 diagnostik

Faktor pertumbuhan epidermal Insulin insulin-like growth factor Platelet-derived growth factor Proinsulin Fibroblast growt factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor 1 antitripsin faktor koagulasi darah XIIIa hirudin human growth factor human serum albumin Agen terapetik untuk manusia

Vektor untuk S. cerevisiae Terdapat tiga kelas utama vektor ekspresi untuk S. cerevisiae: episom atau plasmid, yaitu vektor Yeast Episomal plasmid [YEps], vektor integrasi (Yeast Integrating plasmid [Yips] dan Yeast Artificial kromosom [YACs]. Vektor-vektor ini telah digunakan secara ekstensif untuk memproduksi protein heterolog intra atau ekstraselular. Vektor YEp direkayasa dari plasmid 2m dengan jumlah copy tinggi. Seleksi berdasarkan pada mutan strain inang yang membutuhkan asam amino tertentu (histidin, triptofan atau leusin) atau nukleotida urasil untuk pertumbuhan. Strain ini disebut bersifat auxotrof karena medium pertumbuhan harus diberi suplemen dengan nutrient spesifik. Dalam prakteknya vektor ini dilengkapi dengan versi gen wild type yang menjadi komplemen dari gen yang dimutasi di sel inang. Sebagai contoh, bila plasmid YEp dengan gen LEU2 wild type, ditransformasi ke sel inang mutan leu2 dan kemudian ditumbuhkan pada media yang tidak ada penambahan leusin, maka hanya sel yang membawa plasmid yang akan tumbuh. Sejumlah promotor dari gen S. cerevisiae sudah diambil untuk efisiensi rekayasa transkripsi gen heterolog dalam vektor ragi. Pada umumnya vektor-vektor ini dapat diregulasi dengan ketat. Promotor yang dapat diinduksi lebih disukai untuk produksi sejumlah besar protein rekombinan selama pertumbuhan skala besar. Dalam kasus ini promotor yang diregulasi oleh galaktosa, merespon sangat cepat penambahan galaktosa, yang menaikkan efisiensi transkripsi sampai 1000x. Promotor yang dapat direpresi, konstitutif dan promotor hibrida yang menggabungkan sifat promotor yang berbeda juga tersedia. Tingkat ekspresi maksimal tergantung pada efisiensi terminasi transkripsi. Pada umumnya untuk vektor YEp urutan terminator dan promotor diambil dari gen yang sama. Urutan pengode gen heterolog pada umumnya dilengkapi segmen asam amino (urutan pengenal, peptida pengenal, dan urutan pemula) yang memfasilitasi perjalanan protein rekombinan melewati membran sel dan pelepasan protein ke luar sel. Alasan utama modifikasi ini adalah lebih mudahnya memurnikan protein yang disekresikan dibandingkan protein yang terdapat dalam lisat sel. Urutan pengenal yang umum untuk S. cerevisiae diambil dari gen mating factor. Urutan pengenal sintetik juga sudah dirancang untuk menaikkan jumlah sekresi protein. Urutan lain yang menstabilkan protein rekombinan, mencegah degradasi proteolisis, dan menyediakan urutan asam amino spesifik (affinity tag) yang digunakan untuk purifikasi secara selektif, dapat digabungkan ke urutan pengode gen heterolog. Asam amino tambahan ini dilengkapi oleh sisi pemotongan protease sehingga bisa dipotong dari protein rekombinan setelah dimurnikan. Sistem ekspresi ragi yang menggunakan plasmid kadang-kadang tidak stabil pada kondisi pertumbuhan skala besar ( 10 L) walaupun diberi tekanan. Untuk mengatasi masalah ini, peneliti telah menguji apakah integrasi gen heterolog dapat menyediakan sistem produksi yang dapat diandalkan. Pendekatan yang berbeda telah dilakukan untuk ko-integrasi klon dan gen penanda seleksi ke kromosom S. cerevisiae . Lebih jelasnya gen penanda seleksi fungsional dan gen heterolog ditambahkan dengan urutan pengontrol transkripsi dan translasi yang spesifik untuk ragi, di insersikan antara dua segmen DNA yang berasal dari ujung gen non esensial pada ragi. Pada contoh ini, plasmid tidak selalu membawa ORI yang berfungsi pada sel ragi. Plasmid dipotong pada ujung dari dua segmen ragi. Setelah transformasi, melalui peristiwa rekombinasi ganda terjadi insersi DNA dengan dua gen ke sisi kromosom spesifik (gambar 2). DNA plasmid dilinearisasi karena DNA dalam bentuk ini lebih disukai dibanding DNA sirkular untuk berekombinasi dengan DNA kromosom. DNA yang tidak terintegrasi hilang selama pembelahan sel. Kekurangan utama strategi ini adalah rendahnya hasil protein rekombinan dari satu copy gen.

Beberapa pendekatan sedang dilakukan untuk menaikkan jumlah gen heterolog yang terintegrasi melalui penentuan urutan DNA yang berulang. Kira-kira terdapat 200 copy urutan DNA untuk RNA ribosom (rRNA) dan sekitar 400 copy urutan pada genom S. cerevisiae. Urutan merupakan bagian dari DNA yang non esensial, yang diambil dari retrotransposon. Retrotransposon merupakan urutan DNA kromosom yang ditranskripsi. Molekul RNA ini berperan sebagai templat untuk reverse transcriptase, dan urutan DNA yang disalinnya mengalami integrasi ke kromosom pada sisi yang berbeda. Pada studi awal, 10 copy gen yang diinsersikan ke urutan memproduksi sejumlah rekombinan protein. Vektor YAC dirancang untuk mengkloning segmen DNA dengan ukuran besar (100 kb), yang kemudian dipertahankan sebagai bagian dari kromosom dalam sel inang. Sistem YAC sangat stabil dan sudah digunakan untuk pemetaan fisik genom manusia, analisis unit transkripsi yang besar dan pembentukan perpustakaan genom yang mengandung DNA dari kromosom manusia. Vektor YAC menyerupai kromosom karena mempunyai urutan yang berperan sebagai ORI (autonomous replicating sequence), urutan centromer ragi dan urutan yang muncul pada dua sisi setelah linearisasi DNA yang berfungsi sebagai telomer kromosom untuk mempertahankan kestabilan kromosom. (gambar 2). Dalam beberapa kasus, input DNA diklon ke sisi yang merusak gen marker yeast. Tanpa adanya produk gen ini, respon kolorimetri bisa diamati bila sel penerima ditumbuhkan pada medium khusus. Beberapa vector YAC mengandung gen marker penanda seleksi yang terpisah dari sisi cloning. YAC tidak pernah digunakan sebagai system ekspresi untuk produksi protein heterolog komersial walaupun punya potensi untuk produksi sejumlah besar protein tunggal dari gen yang punya jumlah copy banyak atau protein heterolog dengan subunit berbeda. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae Kebanyakan system ekspresi intraselular S. cerevisiae mempunyai dasar yang sama. Produksi enzim manusia superoksida dismutase akan digunakan sebagai ilustrasi. Anion superoksida merupakan produk samping dari penyediaan oksigen pada organisme aerob. Pada manusia anion ini membantu merangsang respon inflamasi dari fagosit dan untuk mengarahkan lekosit ke sisi infeksi. Akan tetapi bila molekul ini terlalu banyak, turunannya dapat menyebabkan kerusakan sel. Untuk meminimalkan efek cytotoxic, enzim Cu/Zn superoksida dismutase (Cu/Zn-SOD) mencari radikal superoksida dan menggabungkannya dengan ion hidrogen untuk membentuk hidrogen peroksida yang kemudian didegradasi menjadi air dan oksigen oleh katalase atau peroksidase. Anion superoksida juga dihasilkan bila darah masuk kembali ke organ-organ (reperfusion) setelah kehilangan darah selama proses operasi. Untuk mencegah hal ini, dokter berspekulasi bahwa Cu/Zn-SOD dapat dimasukkan ke organ yang sedang mengalami reperfusi. Cu/Zn-SOD mungkin bisa bertindak sebagai agen terapi terhadap penyakit-penyakit inflamasi seperti osteoarthritis, rheumathoid arthritis scleroderma dan ankylosing spondylitis. Untuk penggunaan ini bentuk natif dari Cu/Zn-SOD lebih disukai untuk mencegah respon immunologi yang merugikan yang mungkin dihasilkan dari penggunaan enzim dari spesies lain. Pada awalnya, cDNA untuk Cu/Zn-SOD manusia di kloning di sistem ekspresi E. Coli. Seperti telah diduga, sel inang E. Coli membuang N terminal metionin dari protein Cu/Zn-SOD, dan asam amino selanjutnya (alanin) tidak di asetilasi, seperti yang terdapat pada sel manusia. Sehingga kemudian, cDNA Cu/Zn-SOD manusia dikloning ke vektor YEp (gambar 3). Vektor YEp mengandung: (1) gen untuk biosintesis leusin (LEU2); (2) ORI plasmid 2 m; (3) gen resistan ampisilin (Ampr); (4) ORI dari E. Coli; dan (5) cDNA Cu/Zn-SOD manusia yang diinsersikan diantara daerah promotor gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase (GAPDp) dan urutan yang mengandung signal terminasi transkripsi dan poliadenilasi mRNA dari gen yang sama (GAPDp). Strain ragi dengan leusin defektif (leu2) ditransformasi dengan vektor ini, dan sel di tumbuhkan pada medium tanpa leusin. Hanya sel dengan gen LEU2 fungsional (yang terdapat pada vektor) yang akan tumbuh. Promotor GAPD di transkripsi secara konstitutif selama pertumbuhan sel. Pada percobaan ini sel ragi memproduksi Cu/Zn-SOD intraselular dengan level tinggi, dan residu alanin pada N terminal di asetilasi seperti protein yang sama pada manusia (Gambar 3).

Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae Semua protein yang mengalami glikosilasi pada S. cerevisiae, disekresikan ke luar sel. Protein ini harus mempunyai urutan pemula supaya bisa melewati sistem sekresi. Konsekuensinya urutan pengode dari protein rekombinan yang membutuhkan gula O-linked atau N-linked untuk aktifitas biologi harus dilengkapi dengan urutan pemula. Biasanya urutan pemula dari gen yeast mating factor type (prepro--factor) diinsersikan pada bagian depan cDNA gen yang akan di ekspresikan. Dengan kondisi ini, pembentukan ikatan disulfida yang tepat, pemotongan proteolitik dari urutan pemula, dan modifikasi pascatranslasi yang tepat sering terjadi, dan protein rekombinan yang aktif akan disekresikan. Selama proses ini peptida pemula dibuang oleh endopeptidase yang mengenali dipeptida Lys-Arg. Kodon Lys-Arg harus ditempatkan berdekatan dengan N terminal cDNA, sehingga setelah peptida pemula dibuang, protein rekombinan akan memperoleh residu asam amino yang benar pada posisi N terminal. Strategi tambahan juga sudah ditemukan untuk meningkatkan sekresi protein rekombinan oleh S. cerevisiae. Sebagai contoh, overproduksi PDI (Protein Disulfide Isomerase) yang secara natural terdapat pada sistem enzim sekresi. PDI menyebabkan terjadinya pelipatan protein (folding) yang tepat selama proses sekresi, sehingga PDI mungkin meningkatkan pelepasan protein rekombinan, terutama yang memiliki ikatan disulfida. Untuk memeriksa hipotesa ini, urutan promotor dan terminator transkripsi gliseraldehid fosfat dehidrogenase yang konstitutif ditempatkan pada ujung gen PDI ragi yang dikloning dalam vektor YIp, dan diintegrasikan ke kromosom. Strain transforman menunjukkan peningkatan produksi PDI 16x dibandingkan dengan strain wild type. Bila sel yang meng-overproduksi PDI ini ditransformasi dengan vektor YEp yang membawa gen platelet-growth factor B manusia, terdapat peningkatan sekresi proten rekombinan 10x lebih tinggi dibandingkan dengan sel yang mempunyai level PDI normal. Sehingga overproduksi PDI secara spesifik meningkatkan sekresi protein dengan pembentukan ikatan disulfida. Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. Pastoris Ekspresi protein rekombinan dalam S. cerevisiae telah berhasil digunakan untuk ekspresi berbagai protein dari sumber yang berbeda. Namun dalam beberapa kasus level ekspresinya rendah. Pada contoh lain protein rekombinan mengalami hiperglikosilasi dengan lebih dari 100 residu manosa pada rantai samping N-linked oligosakarida. Kelebihan manosa ini sering merubah fungsi protein dan menghasilkan protein rekombinan yang bersifat antigen. Selain itu protein yang dirancang untuk sekresi pada S. cerevisiae sering tertahan pada membran periplasma, sehingga menambah biaya dan waktu untuk pemurnian. Selanjutnya, bila densitas sel tinggi maka S. cerevisiae akan memproduksi etanol, yang merupakan racun bagi sel. Sebagai konsekuensinya menurunkan jumlah protein yang disekresikan. Untuk alasan ini beberapa peneliti mencoba spesies ragi yang lain dan sel eukariot yang dapat berperan sebagai sel inang yang efektif untuk produksi protein rekombinan. Sebagai eukariot, P. pastoris memiliki berbagai manfaat seperti sistem ekspresi eukariot lain, seperti pemrosesan protein, pelipatan protein, dan modifikasi pascatranslasi, serta mudah dimanipulasi seperti E. coli dan S. cerevisieae. Penggunaannya juga mudah, mudah, cepat dan mengekspresikan protein dengan level tinggi. P. pastoris merupakan ragi metilotropik yang memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan S. cerevisiae, yaitu: 1. P. pastoris memiliki promotor yang diregulasi dengan ketat, yaitu promotor gen AOX1 yang mengkode enzim alkohol oksidase yang dapat diinduksi oleh metanol. Apabila ada metanol, 30% dari protein selular adalah alkohol oksidase. Sedangkan bila tidak ada metanol, gen AOX1 tidak bekerja. Selanjutnya promotor gen AOX1 dengan cepat merespons penambahan metanol ke medium. Dengan kata lain, promotor AOX1 merupakan kandidat yang baik untuk menjalankan transkripsi gen yang dikloning dan memproduksi protein rekombinan dalam jumlah besar; 2. Tingkat sekresi protein rekombinan pada P. pastoris tinggi, hal ini disebabkan oleh konsentrasi sel yang tinggi dan tidak dihasilkannya etanol yang merupakan racun bagi sel; dan 3. P. pastoris biasanya mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri, sehingga memudahkan pemurnian protein rekombinan yang disekresikan. Vektor ekspresi P. pastoris pada umumnya memiliki format yang sama. Gen yang diekspresi berada dibawah kontrol promotor dan urutan terminator transkripsi dari gen AOX1 P. pastoris , ORI dan gen marker seleksi dari E. Coli dan gen marker seleksi dari ragi (gambar 4). Selain itu juga terdapat penambahan urutan signal dari gen fosfatase PHO1 P. pastoris atau gen dari ragi lain yang memfasilitasi sekresi protein rekombinan. Vektor P. pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka panjang. Gen asing dan marker seleksi ragi diinsersikan ke kromosom spesifik melalui proses rekombinasi homolog antara DNA pada vektor dengan daerah yang homolog pada genom P. pastoris.

Kemampuan P. pastoris mensekresikan protein tertentu dengan tingkat sekresi tinggi tidak terlepas dari kemampuan ragi tersebut melakukan metabolisme terhadap alkohol. Metabolisme yang dimaksud adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid dengan menggunakan molekul oksigen oleh alkohol oksidase. Salah satu produk samping dari oksidasi metanol adalah hidrogen peroksida (H2O2). Untuk mencegah sifat racun dari H2O2, maka metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel sel khusus yang disebut dengan peroksisom. Karena alkohol oksidase memiliki afinitas yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi P. pastoris adalah dengan cara mensekresi protein dengan jumlah sangat banyak (Invitrogen, 2004).Sistem ekpresi P. pastoris telah digunakan untuk memproduksi lebih dari 100 protein aktif dari bakteri, jamur, invertebrata, tumbuh-tumbuhan, dan mamalia, termasuk manusia (Tabel 2). Protein-protein rekombinan ini, seperti antigen permukaan hepatitis B, serum albumin manusia, dan bovine lysozyme, memiliki sifat identik dengan protein natifnya. Menurut Shi-Hwei et al. (2005), beberapa masalah yang sangat potensial dalam sekresi protein, termasuk dalam P. pastoris adalah: (1) jenis penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promoter, (4) efisiensi sinyal translasi, (5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease. Berdasarkan pertimbangan di atas, peptida sinyal dan proses pelipatan protein menjadi perhatian utama dalam peningkatan sekresi protein. Untuk menyelesaikan permasalahan di atas, beberapa penelitian dengan menggunakan teknik manipulasi genetik telah berhasil meningkatkan tingkat sekresi dari protein dalam P. pastoris. Vektor ekspresi untuk P. pastoris. Vektor pPICZ dan pPICZ merupakan vektor dengan tingkat ekspresi tinggi. Keduanya membawa marker Zeosin, sehingga seleksi dapat dilakukan secara langsung dan multi-copy integran dapat diketahui langsung tanpa menggunakan banyak medium. Zeosin juga dapat digunakan untuk E. coli, sehingga mengurangi penggunaan antibiotik lain dan mengurangi ukuran vektor (Gambar 5).

Kedua vektor ini memiliki: (1) promotor AOX1, untuk mengekspresikan protein dengan level tinggi yang diinduksi oleh metanol. (2) C-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk memudahkan deteksi dan purifikasi protein. (3) gen 5 AOX1 yang berfungsi untuk menargetkan integrasi ke genom P. pastoris. pPICZ juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium. Vektor pGAPZ dan pGAPZ dapat mengekspresikan protein tanpa menggunakan metanol. Vektor ini lebih disukai untuk ekspresi skala besar. Vektor ini memiliki promotor GAP untuk mengekspresikan protein dengan level tinggi, gen resistan Zeosin untuk seleksi langsung, dan C-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk memudahkan deteksi dan purifikasi protein. pGAP juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium (Gambar 6).

Integrasi multicopy. Beberapa vektor ekspresi untuk Pichia yang tersedia dapat meningkatkan jumlah copy gen dalam P. Pastoris. Sehingga protein akan diekspresikan lebih tinggi. Vektor pPIC3.5K dan pIC9K membawa gen resistan kanamycin, sehingga seleksi transforman yang membawa multi copy vektor terintegrasi dapat dilakukan. Multi insersi dapat diidentifikasi melalui peningkatan resistensi terhadap Geneticin. Tabel 2 Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. pastoris Protein rekombinan Tingkat ekspresi (mg/L)

Protein bakteri: Toksin tetanus fragmen C a-amilase T2A peroksidase Fragmen neurotoxin C. botulinum 12000 2500 2470 78

Protein Ragi: Catalase L Glukoamilase Lipase 2300 400 60

Protein tumbuhan: Hidroksinitril liase Aeroallergen Wheat lipid transfer protein 22000 720 60

Protein mamalia: Mouse gelatin Human tumor necrosis factor Human IGF-1 Human CD-38 14000 10000 600 455

Menurut buku Pharmaceutical Biotechnologi WILEY-VCH, Karakterisasi dari Pemurnian Protein Rekombinan:D. Perkembangan protein rekombinanPerkembangan protein rekombinan sebagai obat farmasi dituntut agar senseitif dan spesifitas uji analitik sebagai obat yang di murnikan dengan mengikuti fisikokimia sebagai biologis, dan uji bioanalitik untuk menghitung protein atau mengetahui aktifitas biologis mantrik. Di masa depan, akan ada lebih besar penekanan (bio) analitis suatu zat karena meningkatnya jumlah aktivitas biologis dibidang klinis, dan munculnya obat asli biologis serta senaywa tersebut harus di evaluasi untuk penggunaan klinis. Pengembangan metode dan protokol uji bioekuivalensi dari obat asli dan obat generik yang merupakan prioritas utama FDA menurut Komisaris FDA.Ruang lingkup artikel ini adalah membahas metode analisis yang digunakan untuk mengkarakterisasi pemurnian protein rekombinan dalam tahap pengembangan obat yang berbeda, serta membahas metode bioanalitik yang berfokus pada validasi dan standarisasi sebagai penentuan imunogenisitas dari terapi protein.

E. Karakterisasi dari Pemurnian Protein RekombinanVI. Pemurnian dan PengotorSuatu pemurnian dari senyawa biologis sangatlah sulit. Modifikasi reguler dan kadang-kadang hanya protein halus seperti glikosilasi, pembentukan ikatan alternatif disulphide, deamidation, oksidasi, fosforilasi, asetilasi, sulfasi, sulfoksidasi, carboksilasi, dan pembentukan piroglutamate menyebabkan jenis protein yang mungkin memiliki karakteristik yang kurang lebih berbeda. Variasi protein dipotong dan mungkin di tampilkan oleh sisi alternatif awal dari trasnkripsi, melalui ikatan peptida akhir yang prematur proses elongasi, atau kegiatan dari inang sel peptida. Peptide mapping dan spektrometri massa biasanya mendeteksi beberapa dari jenis protein. Untuk menganalisa beberapa jenis protein esesnsial, sebagai fitur fisikokimia mungkin tidak akan berebeda dengan lainnya. Dari kemungkinan jenis protein yang di tampilkan dalam preparasi, disarankan dalam pemurnian protein obat oleh dua metode independen, metode tersebut menggunakan prinsip perbedaan fisikokimia seperti elektroporesis jel SDS-polycrylamide dan fase balik pada HPLC.Beberapa contoj, obat mengandung protein berkonjugasi untuk berefek sebagai radioisotop, toksin, atau beberapa protein seperti sitokin yang dapat menimulkan efek biologis. Disamping mempertimbangkan smua aspek untuk komponen individual sebagai konjugat.

VII. IdentitasTes identitas bertujuan untuk mengkonfirmasikan komposisi molekul dan, jika secara teknis mungkin dan alasan secara komersial, struktur zat obat, dan dengan demikian harus cocok untuk memungkinkan pendeteksian bahkan perubahan kecil komposisi molekul dalam obat.

VIII. Kuantifikasi Protein Banyak uji fisikokimia ditetapkan untuk mengukur massa protein. Meskipun mudah dilakukan, uji kolorimetri mengalami ketidakakuratan yang disebabkan oleh penggunaan yang tidak standar seperti bovine serum albumin. Jika standar yang relevan tidak tersedia, analisis asam amino kuantitatif, dengan metode nitrogen Kjeldahl atau gravimetri sebagai sangat akurat tetapi memakan waktu alternatif dapat diterapkan. Bioassay dan immunoassay juga digunakan untuk menghitung jumlah protein, yang dapat divalidasi secara akurat dalam pengukuran dan memerlukan standar acuan.

IX. Stabilitas, Penyimpanan, dan SterilitasStudi stabilitas meliputi evaluasi fitur-fitur protein yang rentan untuk berubah selama penyimpanan serta dapat mempengaruhi kualitas, keamanan, dan efektifitas. Pengujian harus mencakup fisikokimia, aspek biologi, dan mikrobiologi. Uji stabilitas adalah prosedur anaslis untuk memvalidasi secara kuntatif yang dapat mendeteksi perubahan obat dari waktu ke waktu. Uji ini harus mencakup tes integritas obat, potensi, sterilitas, dan, jika berlaku sepeerti: kelembaban, pH, dan stabilitas pengawet yang diukur secara berkala. Selain stabilitas dan sterilitas, karakteristik sampel lainnya seperti penampilan (warna, kejernihan, partikulat), waktu disolusi, dan osmolalitas juga harus dijelaskan untuk produk obat dalam pengemasan akhir. Meskipun obat biologis mungkin kehilangan aktifitas substansi dalam waktu penyimpanan, prosedural pengawasan telah memberikan sedikit panduan mengenai pelepasan dan waktu paruh.

X. Spesifisitas dan Reaksi SilangTes ini harus dirancang untuk memungkinkan evaluasi khusus saat interaksi obat dengan sasaran, satu dari tiga jenis uji untuk penilaian spesifitas:4. Tes Pengikat5. Penentuan sifat molekul6. Imunohistokimia (IHC)

F. Validasi Uji Bioanalytical Bagian ini berfokus pada metode bioanalitis yang tervalidasi diterapkan untuk studi praklinis dan klinis seperti studi bioavailabilitas dan studi bioekivalensi. Sedangkan molekul kecil biasanya dianalisis dengan kromatografi dan spektrometri massa, protein rekombinan terutama di karakterisasi oleh biokimia dan uji berbasis sel. Beberapa format uji yang berbeda, sebagaimana telah disebutkan sebelumnya, secara umum dapat digunakan seperti ELISA, fluoroimuno assay (FIA), dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay (DELFIA), RIA, dan SPR.

V. Metode PenetapanUntuk pengaturan ulang metode bioanalitik, standar kalibrasi dan kontrol kualitas didalam standar referensi sampel yang dibutuhkan. Dokumentasi dari standar referensi idealnya meliputi beberapa angka sebagai sertifikasi dari analisis, stabilitas, identitas dan pemurnian. VI. Pra-studi ValidasiMeliputi Selektivitas, Uji Kalibrasi, Akurasi dan Presisi, Linearitas serta evaluasi Stabilitas.

VII. Studi ValidasiSecara umum, metode divalidasi digunakan dalam pengembangan praklinis untuk toxicokinetic studi dan dalam pengembangan klinis untuk semua studi di mana farmakokinetik yang dievaluasi.

VIII. Imunogenisitas Protein rekombinanSaat ini, beberapa biotherapeutics dalam uji klinik adalah dari manusia atau komposisi manusiawi. Pada pasien, orang akan berharap obat ini tidak kenali dan tidak serang sistem kekebalan tubuh. Oleh karena itu, imunogenisitas protein rekomboinan harus terkonsentrasi tinggi dalam regulasi industri.