...........untaian DNA dalam rangkaiannya. Terkesan, selama perjalanan proses replikasi ini, rata-rata akan terjadi sekali kesalahan.

INISIASI REPLIKASI DNA

Urutan Spesifik Genome DNA Mengarahkan Inisiasi Replikasi DNA

Pembentukan awal dari garpu replikasi memerlukan pemisahan dua untaian DNA duplek untuk menyediakan ssDNA yang diperlukan untuk mengikat halicase DNA dan bertindak sebagai suatu template untuk sintesa kedua-duanya RNA primer dan DNA baru. Meskipun pemisahan untaian DNA (juga disebut DNA unwinding) dengan mudah mencapai end chromosome, sintesa DNA biasanya dimulai dari bagian dalam. Memang, untuk rangkaian chromosome, kurangnya ends chromosome membuat internal DNA unwinding penting untk inisiasi replikasi.

Tempat spesifik dimana DNA unwinding dan inisiasi replikasi terjadi disebut origins (asal) of replication. Tergantung pada organismanya, mungkin ada sedikitnya satu atau sebanyak beribu-ribu asal perchromosome.

Replicon Model Dari Inisiasi Replikasi

Pada tahun 1963, Francois Jacob, Sydney Brenner, dan Jacques Cuzin telah mengusulkan suatu model yang menjelaskan peristiwa yang mengendalikan inisiasi replikasi pada bakteri. Mereka menggambarkan semua DNA yang telah direplikasi dari asal tertentu pada replikasi sebagai replicon. Sebagai contoh, dikarenakan ditemukannya chromosome tunggal dalam sel E.coli hanya mempunyai satu asal pada replikasi, keseluruhan chromosome adalah replicon tunggal. Sebaliknya, kehadiran berbagai asal replikasi membagi masing-masing chromosome eukaryotic ke dalam berbagai replicons - masing-masing dapat satu asal replication.

Model replicon yang diusulkan dua komponen dimana mengontrol inisiasi replikasi : replikator dan inisiator (fig. 8-24). Replikator adalah menggambarkan keseluruhan set dari urutan cis-acting DNA telah cukup mengarahkan inisiasi replikasi DNA. Ini adalah kebalikan dalam asal replikasi, yang mana site DNA dibatalkan dan sintesis DNA dimulai. Meskipun asal replikasi selalu merupakan kerja dari replikator, terkadang (partikel dalam sel eukariotik) asal replikasi hanya dibutuhkan sebagian kecil dari urutan DNA untuk langsung memulai replikasi (replikator). Perbedaan yang sama dapat dibuat antara promotor transcripsi dan site awal transkripsi, seperti yang akan kita lihat di Chapter 12.

FIGURE 8-24 Model Replikon. Pengikatan inisiator ke replikator mensimulasi inisiasi replikasi dan duplikasi DNA

Komponen kedua dari model replikon adalah protein initiator. Protein ini diakui secara khusus adalah elemen DNA didalam replikator dan aktivitas inisiasi replikasi (lihat Fig 8-24). Protein inisiator telah ditemukan pada banyak organisme berbeda, termasuk bakteri, virus dan eukariotik sel. Semua protein inisiator memilih site yang akan menjadi asal replikasi, meskipun mengenali DNA menggunakan beberapa motif DNA-binding yang berbeda. Menariknya, semua protein inisiator yang telah ditemukan di atur oleh ikatan ATP dan hidrolisis dan berbagi sebuah motif inti ATP-binding yang saling berkaitan, tetapi bentuk yang berbeda, yang digunakan dalam pengisian lapisan pengapit DNA.

Seperti yang akan kita bicarakan dibawah ini, inisiator protein adalah hanya urutan protein spesifik DNA-binding yang dilibatkan dalam inisiasi replikasi. Protein sisanya dibutuhkan untuk inisiasi replikasi yang tidak mengikat untaian DNA secara khusus. Sebagai gantinya, protein ini di rekrut ke replikator melalui combinasi interaksi protei-protein dan digabung menjadi struktur DNA spesifik. (e.g., ssDNA atau primer:templete junction).

Urutan Replikator Meliputi Inisiator Binding Site dan Kemudahan Pembatalan DNA.

Urutan DNA yang mengetahui replikator membagi menjadi dua bentuk umum (fig. 8-25). Pertama, mereka meliputi binding site untuk inisiator protein yang merupakan perakitan nuceat dari proses inisiasi replikasi. Kedua, mereka meliputi peregangan dari AT-rich DNA yang siap melepaskan gulungan tetapi tidak secara spontan. Pelepasan gulungan DNA pada replikator dikontrol oleh protein inisisasi replikasi, dan kerja protein ini diatur/pantau dengan ketat pada kebanyakan organisme.

Replikator tunggal terjadi dalam replikasi kromosome E. Coli yang dinamakan oriC. Pengulangan motif dua kali adalah kritis untuk fungsi oriC (fig. 8-25a). Motif 9-mer adalah binding site pada inisiator E. Coli, DnaA, dan pengulangan lima kali pada oriC. Motif 13-mer, pengulangan tiga kali, merupakan initiasl site pada bentuk ssDNA selama inisiasi.

Meskipun urutan spesifik adalah berbeda, kkeseluruhan struktur dari derivat replikator dari banyak virus eukariotik dan sel kariotik tunggal Saccharomyces cerevisiae adalah sama (Fig. 8-25b,c). Metoda yang digunakan menggambarkan asal replikasi diuraikan dalam Box 8-5, Identifikasi Asal Replikasi dan Replikator.

FIGURE 8-25 Struktur Replikator. Elemen DNA yang dihiasi tiga well-characterized replicator ditunjukkan. Untuk setiap diagram, warna hijau menunjukkan DNA-binding site, biru menunjukkan elemen DNA yang memudahkan pelepasan gulungan DNA, dan merah menunjukkan site dari mulai sintesis DNA (site untuk oriC diluar urutan). (a) oriC terdiri lima site 9-mer DnaA-binding dan tiga unsur 13-mer yang diulangi yang merupakan site awal pelepasan gulungan DNA. (b) Origin virus eukariotik SV40 terdiri empat pentamer binding site (P) untuk protein inisiator dinamakan antigen T large dan sebuah 20-bp bait awal (EP) merupakan site untuk pelepasan gulungan DNA. (c) Tiga elemen biasanya ditemukan pada replikator S. Cerevisiae. Elemen A dan B1mengikat ke inisiator ORC. Elemen B2 mempermudah pelepasan gulungan DNA dan mengikat faktor replikasi lainnya.

Fungsi replikator pd eukariotik multiseluler tidak diketahui secara pasti. Identifikasi dan karakteristik mereka dihambat oleh kekurangan percobaan genetik untuk perkembangan yang stabil lingkar kecil DNA yang dapat dibandingkan dengan yang lain untuk mengidentifikasi asal single-cell eukariot dan bacteria (lihat Box 8-5). Sedikit kejadian yang mana replikator dapat diidentifikasi, mereka ditemukan banyak lebih besar darpada replikator yg diidentifikasi dalam S. Cerevisiae dan kromosom bakteri, biasanya mencakup lebih dari 1000bp DNA. Tidak seperti pasangan kecil mereka, mutasi yg menyebabkan eleminasi fungsi replikasi ini tidak terbaca diasingkan, barangkali dikarenakan elemen penting disekitar urutan ini sangat berlebihan.

BOX 8-5 Identifikasi Origin Replikasi dan Replikator.

Urutan replikator secara khas ditemukan menggunakan percobaan genetic. Contoh, replikator ragi pertama kali ditemukan menggunakan percobaan transformasi DNA (Box 8-5 Fig. 1). Pada percobaan ini, peneliti memasukkan secara acak bagian kecil genom DNA kedalam replikator yg kekurangan plasmid tetapi yang berisi selectable marker lacking kedalam sel induk. karena plasmid akan di mantenance didalam sel induk setelah transformasi, bagian kecil DNA yang telah dimasukkan harus berisi replikator ragi. Bagian kecil DNA yg telah ditemukan dinamakan aotumomously replicating sequences (ARSs). Meskipun urutan ini bertindak sebagai replikator dalam kontek tiruan sebagai sebuah lingkaran plasmid, bukti lebih lanjut dibutuhkan untuk menjelaskan bahya urutan ini adalah juga replikator didalam lokasi kromosom aslinya.

BOX 8-5 FIGURE 1 Identifikasi Genetik Replikasi. Plasmid (molekul DNA lingkar kecil) yang berisi selectable marker memotong dengan enzim restriksi yang dihasilkan dalam eksisi replikator plasmid normal. Daun-daun fragmen DNA yang kekurangan replikator. Untuk mengisolasi replikator dari partikel organisme, DNA dari organisme tersebut memotong dengan enzim restriksi yang sama dan diligasi kedalam potongan plasmid membentuk lingkar plasmid yang masing-masing terdiri derivat fragmen tunggal dari organisme percobaan. DNA ini diubah kedalam organisme induk, dan plasmid rekombinan dipilih menggunakan selectable marker pada plasmid (e.g., jika marker berunding resistensi antibiotik, sel akan tumbuh pada kehadiran antibiotik). Sel yang tumbuh itu mampu memelihara plasmid dan itu adalah selectable marker, mengindikasikan bahwa plasmid dapat replikasi dalam sel dan pasti berisi replikator. Isolasi plasmid dari sel induk dan peruntunan DNA yang disisipi mengizinkan indentifikasi urutan fragmen yang terdiri replikator. Mutagenesis lebih lanjut DNA yang disisipi (seperti penghapusan regio spesifik DNA yang disisipi), diikuti oleh pengujian ulang, mengijinkan definisi tepat replikator.

Untuk menjelaskan bahwa ARSs bertindak sebagai replikator didalam kromosome, sangat perlu dikembangkan metode untuk mengidentifikasi lokasi dari asal replikasi didalam sel. Satu pendekatan untuk mengidentifikasi origin dapat diambil keuntungan dari struktur yg tak biasa dari bentuk intermediate replikasi DNA selama inisiasi replikasi. Tidak sama antara DNA yang tereplikasi secara penuh atau tidak tereplikasi secara penuh, DNA yang dalam proses replikasi adalah tidak linear. Sebagai contoh, sebuah bagian kecil DNA (hasilkan oleh pemecahan DNA dengan pengurangan enzym) yang tidak mengandung asal replikasi akan menerima variasi penyesuaian Y-shaped karena adanya replikasi (Box 8-5 Fig.2, Fragmen DNA biru). Dengan kata lain, seketika setelah inisiasi replikasi, fragmen DNA berisi asal replikasi yg memberi bubble shape. Pada akhirnya, jika asal replikasi bertempat asimetris disekitar fragmen DNA, DNA itu akan mulai keluar sebagai gelembung dan kemudian dikonversi ke Y shape (Box 8-5 Fig. 2, Fragmen DNA merah). Bentuk DNAs yang tidak biasa ini akan dibedakan dari DNA linier sederhana menggunakan elektroporesis agarose gel dua-dimensi (Box 8-5 Fig. 3).

BOX 8-5 FIGURE 2 DNA Yang Berada Dalam Proses Replikasi Mempunyai Struktur Yang Tidak Biasa. Hasil enzim restriksi perpecahan DNA pada proses replikasi telah ditunjukkan. Ilustrasi menunjukkan pertumbuhan replication bubble (dibuat oleh dua grapu replikasi yang melangkah maju menjauh dari origin replikasi). Konsekuensi pemotongan replikasi tambahan ini diikuti deteksi oleh hibridisasi dengan pemeriksaan label DNA. Jika enzim restiksi merah digunakan dan hanya fragmen yang hibridisasi ke pemeriksaan DNA merah yang diuji, pola teladan pada sisi kiri akan dihasilkan. Jika enzim restriksi biru dan pemeriksaan Dna biru digunakan untuk deteksi hasil fragmen DNA, pola teladan sebelah kanan akan diobservasi. Catatan bahwa lengan kiri pola teladan dimulai dengan fragmen DNA yang berisi gelembung dan secepatnya berakhir dengan molekul Y-shaped. Lengan kanan pola teladan tidak pernah mempunyai gelembung tetapi mengasumsikan variasi penuh intermediat Y-shaped . hanya fragmen DNA yang berisi origin replikasi dapan memproduksi pola teladan pada sisi kiri.

Untuk menjelaskan DNA dalam proses replikasi, derivat DNA dari pemecahan sel adalah pemecahan pertama dengan pengurangan enzyme dan yang dipisahkan pada dua-dimensi agarose gel. Pada dimensi yang pertama, DNA dibagi berdasarkan ukuran dan bentuk dan pada dimensi kedua, DNA dibagi hanya berdasarkan ukuran. Ini diselesaikan oleh kepadatan yang berda dari agarose gel dan elektroporesis rates untuk setiap dimensi. Untuk pemisahan melalui ukuran dan bentuk, (oleh) pori-pori agarose gel yang kecil (high agarose density) dan tingkat elektroporesis yg cepat. Sebaliknya, pemisahan dengan hanya berdasarkan ukuran, (oleh) pori-pori agarose gel besar (low agarose density) dan tingkat elektroporesis yang lambat. Sekali elektroporesis komplit, molekul DNA ditransfer ke nitrocellulose dan dideteksi oleh southern blotting (lihat Chapter 21). Pilihan dengan enzym restriksi dan pemeriksaan DNA yang digunakan mendapatkan hasil secara dramatis dari analisis. Secara umum, metoda ini memerlukan investigator yang telah mengetahui lokasi terdekat potensi terjadinya asal replikasi. Baru-baru ini, metode terbaru yang dikembangkan adalah menggunakan microarays untuk mengetahuilokasi asal dan tidak membutuhkan suatu pengetahuan mengenai lokasi asal.

Bagaimana bisa dua-dimensi gels menjelaskan DNA intermediate yang dihubungkan dengan asal replikasi? Pola partikel yang paten dari migrasi DNA dapat menunjukkan bukti tegas dari asal replikasi. Struktur yang sangat tidak biasa bermigrasi paling lambat didalam dimensi pertama. Sebagai contoh, sebuah molekul Y-shapped yang mempunyai lengan yang panjangnya sama akan bermigrasi lebih lambat dari semua seperti derivat molekul dar fragmen partikel DNA. (Box 8-5 Fig. 3b),oleh karena itu akan terletak diatas pada lengkungan molekul-molekul DNA yang merupakan nonlinier. Sebaliknya, sebuah molekul Y-shaped dengan dua lengan replikasi yang sangat pendek dan regio replikasi yang lebar akan bermigrasi sangat mirip dengan versi tidaktereplikasi dari fragmen DNA yang sama. Pada akhirnya, molekul Y-shapped yang dihasilkan dari hampir semua fragmen replikasi adalah serupa bentuknya menjadi suatu molekul linear dengan ukuran dua kali ukuran fragmen yang tidak tereplikasi. Dengan demikian, sebagai molekul DNA yang di replikasi melalui sebuah garpu replikasi tunggal, akan bermigrasi dalam posisi yang tertukar dari spot yang dekat dengan fragmen tidak tereplikasi dalam lengkungan yang secepatnya menjangkau lokasi suatu molekul linier dengan ukuran dua kali dari DNA tak tereplikasi diharapkan berpindah tempat. Bentuk ini dinamakan Y-arc dan menandakan bahwa molekul sedang dalam proses menjadi tereplikasi. Dikarenakan semua molekul DNA direplikasi dalam setiap putaran replikasi, mayoritas fragmen DNA akan memperlihakan pola seperti ini.

BOX 8-5 FIGURE 3 Identifikasi Molekular Asal Replikasi. (a) melalui elektroporesis pemisahan DNA dalam dua dimensi, DNA dalam proses replikasi dapat dipisahkan dari replikasi penuh atau unreplikated DNA. Total DNA diisolasi dari pembelahan (dan oleh karena itu mereplikasi) sel. DNA pertama kali dipisahkan menurut ukuran dan bentuk (menggunakan elektroporesis tegangan tinggi sampai melalui pori-pori yang relatif kecil), medan elektrik di putar 90, dan DNA kemudian sebagian besar dipisahkan melalui ukuran (elektroporesis dengan tegangan rendah dalam media agar yang luas). Analisis southern blot digunakan untuk mendeteksi minat DNA. Lokasi origin (hijau), site perpecahan enzim restriksi (merah), dan pemeriksaan southern blot DNA (biru), digambarkan untuk tiga perbedaan pola paten yang dapat di observasi. Replikasi gelembung yang paling besar berpindah tempat sangat lambat pada dimensi yang pertama (c) dan molekul Y-shaped dengan lengan yang sama berpindah sangat lambat (b). Dikarenakan pola teladan Y-arc dan bubble arc sulit dicirikan, pola teladan bubble-to-Y-arc (d) dipertimbangkan penanda lebih pada origin.

Molekul yang mengandung asal replikasi dari bubble-shaped intermediate replikasi akan migrasi bahkan lebih lambat pada dimensi pertama daripada molekul Y-shaped. Gelembung yang lebih besar, semakin molekul ini berpindah tempat dengan cara yang berbeda dari DNA linier (B0x 8-5 Fig. 3c). Sayangnya, sangat sulit membedakan lengkungan intermediate yang dibuat menggunakan gelembung berisi fragmen (dinamakan lengkungan gelembung) dengan yang dibuat menggunakan Y-shaped intermediates (B0x 8-5 Fig. 3b,c). Kesulitan ini dapat terjadi jika lokasi asalnya asimetris dalam fragmen DNA. Pada kejadian ini, intermediate akan mulai keluar sebagai gelembung, tetapi pada saat garpu replikasi mendekati akhir replikasi fragmen terakhir, bubble-shaped intermediate akan menjadi Y-shaped. Ini juga dinamakan bubble-to-y transition yang dengan mudah dideteksi sebagai diskontinuitas pada lengkungan dan sangat indikatif sabagi asal (Box 8-5 Fig. 3d). Seperti itu, idealnya, enzym restriksi yang dipilih akan secara asimetri mengapit asal replikasi agar dapat dideteksi.

PENGIKATAN DAN PELEPASAN GULUNGAN : SELEKSI DAN AKTIVASI ASAL OLEH PROTEIN INISIATOR

Protein inisiator selalu melaksanakan paling sedikit dua fungsi yang berbeda selama inisiasi replikasi (Fig. 8-26). Pertama, protein ini mengikat untaian DNA spesifik disekitar replikator. Kedua, protein inisiator saling berhubungan dengan faktor tambahan yang dibutuhkan untuk inisiasi replikasi, seperti itulah, mereka merekrutnya ke dalam replikator. Beberapa tetapi tidak semua protein inisiator melakukan tiga fungsi : mereka menyimpangkan atau melepaskan bagian DNA yang bersebelahan ke tempat ikatan mereka untuk memudahkan pembukaan inisiasi DNA duplek.

FIGURE 8-26 Fungsi Protein Inisiatorn Selama Inisiasi Replikasi DNA. Tiga fungsi umum protein inisiator digambarkan : Pengikatan DNA, Pemisahan strand DNA, dan pengambilan replikasi protein. (disini protein yang direkrut digambarkan sebagai helicase DNA; bagaimanapun, protein yang direkrut berbeda untuk setiap protein inisiator).

Berdasarkan pertimbangan, sebagai contoh, inisiator protein E. Coli, DnaA. DnaA mengikat elemen 9-mer yang diulang dalam oriC (lihat Fig. 8-25) dan itu di atur oleh ATP. Ketika diikat oleh ATP (tetapi bukan ADP), DnaA juga berhubungan dengan DNA didalam bagian dari pengulangan 13-mer yang diulangi pada oriC. Hasil interaksi tambahan dalam pemecahan rantai DNA melebihi dari 20 bp disekitar bagian pengulangan 13-mer. Pelepasan ini DNA menyediakan sebuah template ssDNA untuk replikasi tambahan protein untuk memulai langkah sintesis RNA dan DNA dalam replikasi. (lihat dibawah).

Formasi ssDNA pada site didalam kromosome tidak mencukupi untuk helicase DNA dan replikasi protein lainnya untuk melakukan pemasangan. Melainkan, DnaA merekrut replikasi protein tambahan kedalam ssDNA yang dibentuk pada replikator termasuk helicase DNA ( lihat section berikutnya). Pengaturan replikasi pada E. Coli yang dihubungkan ke kontrol aktivitas DnaA dan akan didiskusikan kemudian dalam Box 8-7 (Replikasi DNA E. Coli Diatur oleh DnaA.ATP level dan SeqA).

Dalam sel eukariotik, sebagai inisiator adalah complek six-protein yang disebut origin recognition complex (ORC). Fungsi ORC telah diketahui dengan baik dalam sel ragi. ORC mengenali urutan yang dipelihara yang ditemukan dalam replikator ragi, yang dinamakan elemen A, seperti halnya yang kedua, pemeliharaan elemen B1 (lihat Fig. 8-25). Seperti DnaA, ORC mengikat dan hidrolisis ATP. Ikatan ATP disediakan untuk ikatan urutan spesifik DNA didalam origin, dan hidrolisis ATP disediakan untuk ORC untuk berpartisipasi dalam pengisian helicase DNA eukariotik ke replikator DNA. Tidak seperti DnaA, pengikatan ORC ke replikator ragi tidak menunjukkan pemecahan rantai DNA yang bersebelahan. Meskipun demikian, ORC disiapkan untuk direkrut, maupun langsung atau tidak langsung, semua sisa replikasi protein ke replikator (lihat Section Complek Formasi Prereplikative Adalah Langkah Pertama Dalam Inisiasi Replikasi Pada Eukariotik).

Interaksi Protein-Protein dan Protein-DNA Mengarahkan Proses Inisiasi.

Sekali inisiator mengikat replikator, langkah sisa dalam inisiasi replikasi sebagian besar di kemudikan oleh interaksi protein-protein dan interaksi protein-DNA yang merupakan urutan independen. Hasil akhir adalah pemasangan dua replisome yang kita bicarakan diawal. Untuk meyelidiki peristiwa yang menghasilkan mekanisme protein ini, kita pertama berbalik ke E. Coli, yang mana telah diketahui lebih detail.

Setelah inisiator (DnaA) diikat oleh oriC dan melepaskan 13-mer DNA, kombinasi ssDNA dan DnaA merekrut complek dua protein : helicase DNA, DnaB, dan helicase loader, DnaC (Fig. 8-27). Kedua protein kini dalam enam salinan disekitar komplek. Helicase DNA adalah tidak aktif dalam komplek helicase/helicase loader untuk mencegah berfungsinya pada site yang lain. Sekali terikat dalam ssDNA pada origin, helicase loader mengarahkan pemasangan mengenai helicase DNA yang dihubungkan sekitar ssDNA (perlu diingat bahwa ssDNA melewati sampai pertengahan cincin protein hexameric helicase DnaB). Proses ini adalah analisator untuk perakitan lapisan clamp DNA disekeliling primer:templete junction, dan seperti lapisan clamp loader, DnaC adalah protein ATP-utilizing AAA+ (lihat Box 8-4). Ketika menyelesaikan tugas ini, helicase loader dilepaskan, membiarkan helicase menjadi aktif. Setiap satu helicase terisi dua pecahan rantai ssDNA pada origin, dan orientasi dari dua helicase ini seperti mereka akan berproses satu dengan lainnya seperti mereka bergerak dengan polaritas 53 sepanjang ssDNAs yang menghubungkan mereka.

Protein-protein berinteraksi antara helicase dan componen lain pada garpu replikasi diatas digambarkan secara langsung perakitan sisa dari mekanisme replikasi (lihat Fig. 8-27). Helicase merekrut DNA primase ke asal DNA, merupakan hasil dalam sintesis RNA primer pada setiap rantai origin. DNA pol III holoenzyme dibawa ke origin melalui interaksi dengan primer:template junction dan helicase. Sekali holoenzyme ada, lapisan clamp dipasangkan pada RNA primer, dan leading-strand polimerase telah dilibatkan. Sebagai ssDNA baru yang terkena tindakan helicase, yang terikat oleh SSB dan sintesis DNA primase adalah primer lagging-strand. Primer:template junction baru ini yang ditargetkanoleh clamp loader, yang mana tempat dua sliding clamp tambahan pada rantai tertinggal. Clamp ini dikenali oleh sisa inti DNA Pol III enzim yang tidak dikaitkan, merupakan hasil dalam inisiasi sintesis lagging-stran DNA. Pada intinya, dua garpu replikasi telah dikaitkan, dan inisiasi replikasi selesai (persisnya bagaimana dua garpu replikasi di kaitkan masih dalam perdebatan, lihat Box 8-6, Hipotesis Mekanisme Replikasi).

FIGURE 8-27 Model Inisiasi Replikasi DNA E. Coli. Peristiwa besar dalam inisiasi replikasi E. Coli digambarkan. (a) Multiple protein DnaA-ATP mengikat urutan 9-mer yang diulang sekitar oriC. (b) Pengikatan DnaA-ATP ke urutan ini kearah pemisahan strand sekitar pengulangan 13-mer. Ini dipermudah oleh daerah ss-DNA-binding dalam DnaA-ATP. (c) Helicase DNA (DnaB) dan pengisi helicase DNA (DnaC) bersama dengan asal DnaA-bound. Daerah ssDNA-binding dalam pengisi helicase dan interaksi protein-protein dengan DnaA dibutuhkan membentuk komplek ini. (d) Pengisi helicase DNA mengkatalisasi pembukaan ring protein helicase DNA dan menempatkan ring disekitar ssDNA pada origin. Pengisian helicase DNA mengarahkan persekutuan pengisi helicase dari replikator dan mengaktivasi helicase DNA. (e) Setiap helicase DNA mengambil sebuah DNA primase yang mana mensintesis RNA primer pada tiap templete. Pergerakan helicase DNA juga menghapus sisa DnaA yang terikat pada replikator. (f) Sintesis primer terbaru dikenali oleh komponen clamp loader dari dua holoenzim Pol III DNA. lapisan clamps dirakitkan pada setiap RNA primer, sintesis leading-strand di mulai oleh satu dari dua inti enzim DNA Pol III pada tiap holoenzime. (g) Sesudah setiap helicase DNA dipindahkan ~1000basis, RNA primer kedua disintesis pada setiap templete laging-strand dan lapisan clamp diisi. menghasilkan primer-templete junction yang dikenali oleh enzim inti Pol III DNA kedua dalam setiap holoenzime, menghasilkan dalam memulai sintesis lagging-strand. (h) Sintesis Leading- dan Lagging-strand sekarang dimulai pada setiap garpu replikasi dan diteruskan ke templete akhir atau sampai garpu replikasi lainnya dari replikasi origin bersebelahan dicapai.

ADVANCED CONCEPTS

Box 8-6 Hipotesis Pabrik Replikasi

Ada dua cara memikirkan gerak relatif DNA dan mekanisme replikasi (Box 8-6 Fig. 1). Satu pandangan sederhana adalah replikasi bergerak sepanjang DNA yang dapat dianalogikan seperti kereta bergerak sepanjang relnya, replikasi rantai rangkap mendekati DNA. Dalam Pandangan tradisional ini, helicase DNA dilewati oleh helicase yang lain seketika setelah terisi pada origin dan sesudah itu bertindak dengan bebas satu dengan lainnya pada dua garpu replikasi. Pandangan alternatif menyatakan bahwa DNA bergerak pada saat proses replikasi memerlukannya, mirip dengan film yang berpindah ke proyektor bioskop. Secara mecanisme, telah di usulkan bahwa proses ini selesai pada saat dua helicase DNA tidak dilewati oleh satu sama lain tetapi sebagai gantinya menjauh satu sama lainnya dan hubungan sisa untuk sisa proses replikasi.

BOX 8-6 FIGURE 1 Dua Gambaran Bagaimana Fungsi Mesin Replikasi. Pada panel kiri, dua fungsi helicase DNA yang saling ketergantungan. Pada panel kanan, dua sisa helicase DNA digabungkan satu dengan yang lain. Catatan bahwa pada panel kanan, satu holoenzin Pol III DNA hanya menggunakan Watson strand sebagai templete dan yang lain hanya menggunakan Crick strand sebagai templete. Untuk lebih sederhana, Pol III DNA tidak menunjukkan penyatuan dengan helicase DNA.

Pandangan dari replikasi yang terjadi pada stasioner site terus menignkat. Studi dari replikasi DNA bakteri telah jelas menunjukkan bahwa proses replikasi menyisakan lokasi tunggal disekitar sel selama sintesis DNA. Sebagai ganti pergerakan proses replikasi, DNA bergerak masuk dan keluar dari mekanisme replikasi ini dan telah disalin dalam proses tersebut. Sama halnya, replikasi dalam sel eukariotik yang diamati secara terpisah disekitar sel nukleus. Penelitian menunjukkan fungsi helicase pada garpu replikasi juga mendukung berhentinya proses replikasi. Beberapa helicase DNA hexameric berasal dari hexamer. Ini menggambarkan bahwa tidak satu pun dari dua helicase hexameric dipisahkan dengan cepat satu dengan lainnya setelah replikasi (di gambarkan seperti model rel kereta api), mereka menyisakan bersama dalam keseluruhan proses replikasi.

FIGURE 8-28 Kerusakan Kromosom sebagai hasil Replikasi DNA yang tidak Komplet. Ilustrasi ini menunjukkan konsekuensi replikasi tidak lengkap diikuti pemisahan kromosome. Bagian atas tiap ilustrasi menunjukkan keseluruhan kromosome. Bagian bawah menunjukkan detail kerusakan kromosome pada tingkatan DNA. (untuk detail pemisahan kromosome, lihat chapter 7). Sebagai kromosome yang terpisah penuh, menghasilkan kromosom rusak.

Disini dua pandangan pengabungan garpu replikasi juga mempunyai konsekuensi menarik mengenai DNA yang direplikasi oleh setiap DNA Pol III holoenzyme. Jika helicase DNA dilewati satu dengan yang lain seketika setelah mereka terisi, maka rantai terdekat dapat direplikasi secara serempak oleh dua polimerase DNA Pol III holoenzyme menjadi rantai Watson dan Crick pada DNA yang paling akhir dilepaskan (Box 8-6 Fig.1, panel kiri). Sebaliknya, jika dua helicase sisa yang dihubungkan setelah inisiasi, maka memungkinkan bahwa lagging-strands DNA polymerase DNA Pol III holoenzime bisa dihubungkan dengan keduanya pada dua template perdana, sejak mereka saling berdekatan. Banyak perkiraan, sekenario ini, pilihan nantinya untuk setiap DNA Pol III holoenzime mempunyai template strand sama untuk awal dan akhir sintesis; itu adalah, satu enzin inti akan mereplikasi Crick strand pada DNA dan yang lainnya akan mereplikasi Watson strand pada DNA (Box 8-6 Fig. 1, panel kanan).

Kromosom Eukariotik Mereplikasi Persisnya Sekali per Siklus Sel.

Sebaagai bahan diskusi pada Chapter 7, peristiwa itu diperlukan untuk pembentukan divisi sel eukariotik pada waktu yang berbeda selama siklus sel. Replikasi Kromosomal DNA terjadi hanya selama fase S pada siklus sel. Selama waktu ini, semua DNA didalam sel hanya disalin satu kali. Pada replikasi lengkap bagian kromosome manapun menyebabkan rantai yang tidak sesuai antara kromosom anak perempuan. Pemisahan rangkai kromosome menyebabkan kerusakan atau kehilangan kromosome (Fig 8-28). Rereplikasi bahkan pada jumlah terbatas DNA eukariotik dihantarkan ke lesi DNA yang sulit untuk diperbaiki oleh sel. Dalam usaha memperbaiki lesi sering menghasilkan pembesaran penggabungan DNA, yang mana dapat meningkatkan ketidaksesuaian ekspresi penggabungan gene. Penambahan bahkan satu aatau dua lebih salinan pada pengatur kritis gene dapat menyebabkan malapeaka cacat pada ekspresi gene, devisi sel, respon terhadap sinyal lingkungan. Ini membahayakan dimana setiap pasangan dasar dalam setiap kromosome akan direplikasi sekali dan hanya sekali setian pembelahan eukariotik.

Kebutuhan replikasi DNA sekali dan hanya sekali adalah tantangan bagi khromosome eukariotik karena setiap mereka mempunyai banyak asal replikasi. Origin secara khas dipisahkan oleh ~30kb bahkan chromosome kecil eukariotik mungkin mempunyai lebih dari sepuluh origin dan kromosome manusia yang besar mempuanyai ribuan. Cukup origin ini yang harus diaktifkan untuk memastikan bahwa masing-masing chromosome secara penuh direplikasi selama setiap S phase. Secara khas, tidak semua origin potensial perlu diaktivasi untuk replikasi lengkap, tetapi jika terlalu sedikit diaktivasi, bagian genome aka mengeluarkan proses relikasi. Pada panduan lain, meskipun beberapa origin potensial mungkin tidak digunakan dalam suatu putaran pada devisi sel, tidak ada asal replikasi yang dapat di inisiasi setelah di replikasi. Seperti itu, apakah origin direplikasi dikarenakan replikasi sendiri atau direplikasi oleh derivat garpu replikasi dari origin yang bersebelahan, maka harus di inaktivasi sampai putaran berikutnya dari divisi sel (Fig. 8-29). Jika keadaan ini tidak benar, pengikatan DNA dengan origin bisa direplikasi dua kali didalam siklus sel yang sama.

FIGURE 8-29 Replikator Diinaktivasi Oleh Replikasi DNA. Menunjukkan kromosom dengan lima replikator. Replikator diberi lebel 3 dan 5 adalah yang pertama diaktivasi, mengarahkan pembentukan dua pasangan garpu replikasi bidiretional. Aktivasi replikator induk dihasilkan dalam salinan inaktif tiap replikator pada kedua molekul DNA anak perempuan sampai siklus sel selanjutnya (ditandai oleh X merah). Perluasan selanjutnya hasil garpu replikasi mereplikasi overlaping DNA dengan replikator nomor 2 dan 4. Dimana replikator disalin oleh derivat garpu dari origin bersebelahan sebelum inisiasi, dapat dikatakan replikasi pasif. Walaupun replikator ini tidak diinisiasi, mereka meskipin diinaktif oleh tindakan mereplikasi DNA mereka. Sebaliknya, replikator 1 tidak dicapai oleh garpu bersebelahan sebelum inisiasi dan dapat diinisiasi normal. Kehadiran replikator lebih banyak dari yang dibutuhkan untuk replikasi DNA komplet adalah bentuk pemborosan untuk memastikan replikasi komplete tiap kromosome.

FIGURE 8-30 Langkah Pembentukan Complek Prereplikasi (Pre-RC). Perakitan pre-RC adalah proses pesanan yang diinisiasi oleh asosiasi komplek pengenalan origin dengan replikator. Sekali terikat pada replikator, ORC merekrut sedikitnya dua protein tambahan, Cdc6 dan Cdt1. Tiga fungsi protein ini bersama-sama merakit helicase DNA eukariotik komplek Mcm2-7 pada replikasi dan menyelesaikan pembentukan pre-PRC.

Pembentukan Complek Prereplikasi Adalah Langkah Pertama Inisiasi Replikasi Dalam Eukariotik

Inisiasi replikasi dalam sel eukariotik melibatkan dua peristiwa yang terjadi pada waktu yang berbeda dalam siklus sel (lihat chapter 7); seleksi replikator dan aktivasi origin. Seleksi replikator adalah proses indentifikasi urutan yang akan mengarahkan inisiasi replikasi dan terjadi dalam C1 (lebih utama ke fase S). Proses ini menghantarkan perakitan dari complek multiprotein pada setiap replikator dalam genome. Aktivasi origin hanya terjadi setelah sel masuk fase S dan memicu replikator-yang menghubungkan komplek protein untuk memulai pelepasan gulungan DNA dan pengambilan DNA polimerase.

Pemisahan seleksi replikator dan aktivasi origin berbeda dari situasi dalam sel prokariotik, dimana pengenalan DNA replikator pada hakekatnya digabungkan ke pelepasan gulungan DNA dan pengambilan polimerase. Seperti yang akan kita lihat dibawah ini, pemisahan sementara dua peristiwa ini selama siklus sel eukariotik memastikan bahwa setiap kromosom direplikasi hanya sekali selama tiap siklus sel (sel bakteri memecahkan perbedaan masalah ini, lihat Box 8-7).

Seleksi replikator diperantarai oleh pembentukan komplek prereplikasi (pre-RCs) (Fig. 8-30). Pre-RC terdiri dari empat pecahan protein yang dirakit sesuai perintah pada setiap replikator. Langkah pertama dalam pembentukan pre-RC adalah pengenalan replikator oleh inisiator eukariotik, ORC. Sekali ORC diikat, merekrut dua helicase pengisian protein (Cdc6 dan Cdt1). Secara bersama-sama ORC dan pengisian protein merekrut helicase rangkai replikasi eukariotik, komplek Mcm 2-7. Menariknya, keduanya ORC dan protein Cdc6 adalah anggota famili AAA+ dari protein seperti DnaC dan subunit dari lapisan pengisi clamp. Penelitian dari perakitan pre-RC menyarankan bahwa protein ini menggunakan ATP binding dan hidrolisis untuk menigisi ring-shape komplek Mcm2-7 disekitar dsDNA. Secara konsiten dengan komplek Mcm2-7 lingkaran dsDNA, pembentukan pre-RC tidak menghantarkan segera melepaskan gulungan asal DNA atau pengambilan polimerase DNA. Sebagai gantinya, pre-RCs yang dibentuk selama G1 hanya diaktivasi untuk melepas gulungan DNA dan inisiasi replikasi setelah sel dilepaskan dari G1 ke fase S dari siklus sel.

Pre-Rcs diaktivasi untuk memulai replikasi oleh dua protein kinase; Cdk (cyclin-dependent kinase) dan Ddk (Dbf4-dependent kinase) (Fig. 8-31). Protein kinase adalah protein yang berikatan kovalen dengan menyertakan grup phosphat ke protein target (lihat chapter 5). Setiap kinase ini tidak aktif dalam G1 dan hanya diaktivasi saat sel masuk fase S. Sekali diaktivasi, target kinase ini adalah pre-PRC dan protein replikasi lainnya. Posporisasi protein ini menghasilakan pengambilan banyak replikasi protein tambahan ke origin dan inisiasi replikasi (lihat Fig. 8-13). Protein baru ini terdiri tiga polimerase DNA eukaariotik dan satu protein lainnya yang dibutuhkan untuk rekrutmen mereka. Menariknya, polimerase dirakit dengan pesanan tertentu. Awalnya penyatuan DNA Pol dan Pol , diikuti Pol /primase. Pesanan ini memastikan bahwa semua tiga polimerase DNA mengarah pada origin lebih dulu untuk sintesis RNA primer pertama (oleh DNA Pol /primase).

Hanya sebuah protein subset yang dirakit di origin berfungsi sebagai bagian replisome eukariotik. Dalam tambahan pada tiga polimerase DNA, komplek Mcm dan banyak faktor dibutuhkan untuk pengambilan polimerase DNA menjadi bagian proses rangkai replikasi. Mirip pengisian helicase DNA E. Coli (DnaC), faktor lainnya (seperti Cdc6 dan Cdt1) dilepaskan atau dihancurkan setelah peran mereka selesai (lihat Fig. 8-31).

Pembentukan dan Aktivasi pre-RC Diatur Hanya Untuk sekali Putaran Replikasi Selama Tiap Siklus Sel.

Bagaimana sel eukariotik mengontrol aktivitas ratusan atau bahkan ribuan origin replikasi yang tidak satu diaktifkan bahkan lebih sekali selama siklus sel? Jawabannya ada pada pengaturan yang ketat pembentukan dan aktivasi pre-RCs oleh cyclin-dependent kinase (Cdks).

Cdks mempunyai dua peran berlawanan yang tampak dalam pengaturan fungsi pre-RC (Fig. 8-32). Pertama, seperti yang kita bicarakan diatas, mereka dibutuhkan untuk aktivasipre-RCs untuk memulai replikasi DNA. Kedua, Cdk bekerja menghambat pembentukan pre-RCs baru.

Hubungan erat antara fungsi pre-RC, level Cdk, dan siklus sel memastikan bahwa genome eukariotik direplikasi hanya sekali per siklus sel (Fig. 8-33). Level Cdk rendah selama G1, sedangkan level elevasi Cdk hadir selama sisa siklus sel (S, G2, dan fase M). Seperti itu, selama tiap siklus sel, hanya satu kesempatan pre-RCs terbentuk (selama G1) dan hanya satu kesempatan untuk pre-Rcs diaktivasi (selama S, G2, dan M meskipun dalam kenyataannya, semua pre-RCs diaktivasi atau diganggu oleh rangkai replikasi dalam fase S.

FIGURE 8-31 Aktivasi pre-RC mengarahkan perakitan garpu replikasi eukariotik. Ketika sel masuk kedalam fase S siklus sel, Cdk dan Ddk memfosforilasi protein replikasi untuk memicu inisiasi replikasi. Aktivasi kinase ini mengarahkan pelepasan Cdc6 dan Cdt1. Pada kasus Cdc6, bentuk fosforilasi protein adalah subyek untuk proteolisis cepat. Peristiwa yang mengarahkan pelepasan gulungan DNA pada origin belum dipahami tetapi mungkin membutuhkan aktivitas komplek Mcm dan hasil dalam pengambilan suatu alat bantu faktor replikasi dan DNA Pol dan Pol . DNA Pol /primase hanya direkrut setelah DNA Pol dan Pol . Sekali hadir pada origin, DNA Pol /primase mensintesis RNA primer dan dengan singkat meluas. Menghasilkan primer:templete junction yang dikenali sliding clamp loader (RF-C), yang mana merakit sliding clamp (PCNA) pada site ini. DNA Pol mengenali primer ini dan memulai sintesis leading-strand. Setelah periode pelepasan gulungan DNA, DNA Pol /primase mensintesis primer tembahan, yang mana mengisinkan inisiasi sintesis lagging-strand DNA oleh DNA Pol .

FIGURE 8-32 Efek Aktivitas Cdk pada Pembentukan dan Aktivasi pre-RC. Aktivitas tinggi Cdk diperlukan untuk pengeluaran komplek pre-RC untuk memulai replikasi DNA. Peningkatan aktivitas Cdk yang sama ini dengan sepenuhnya menghambat pembentukan komplek pre-RC baru. Sebaliknya aktivitas Cdk yang rendah merengsang pembentukan pre-RC baru tetapi tidak cukup untuk mencetuskan inisiasi replikasi DNA oleh bentuk komplek pre-RC yang baru.

FIGURE 8-33 Pengaturan Siklus Sel pada Aktivitas Cdk dan Pembentukan pre-RC. Dalam Cdk tingkat G1 adalah rendah dan komplek pre-RC baru bisa dibentuk tetapi belum bisa diaktivasi. Selama fase S, penignkatan aktivitas Cdk mencetuskan inisiasi replikasi DNA dan mencegah setiap pembentukan komplek pre-RC baru pada DNA yang di replikasi. Sekali pre-RC digunakan untuk inisiasi replikasi, itu adalah pembukaan penting (dikatakan sedikitnya satu komponen kunci dari pre-RC, komplek Mcm, menjadi bagian garpu replikasi). Dengan cara yang sama, replikasi pre-RC-associated DNA juga menghancurkan komplek tersebut (tidak tampak). Dikarenakan sisa level Cdk tinggi sampai akhir mitosis, tidak ada komplek pre-RC baru dapat dibentuk sampai pemisahan kromosome selesai. Tanpa komplek pre-RC baru, reinisiasi adalah tidak mungkin.

Pre-RCs dilepaskan setelah mereka diaktivasi atau setelah DNA yang telah diikat direplikasi. (lihat Fig. 8-29). Pengarahan replikator ini yang kemudian tersedia untuk formasi pre-RC baru dan mengikat dengan cepat ke ORC. Disamping kehadiran inisiator pada site ini, peingkatan level aktivitas Cdk dalam S, G2, dan fase M sel mencegah penggabungan anggota lain complek pre-RC dengan ORC. Itu hanya bila sel memisahkan kromosome mereka dan devisi sel yang lengkap dimana aktivitas Cdk dieleminasi dan complek pre-RC baru dapat dibentuk.

Kesamaan Antara Inisiasi Replikasi DNA Eukariotik dan Prokariotik

Saat ini kita telah menjelaskan inisiasi dalam eukariotik dan prokariotik, itu sudah jelas bahwa prinsip umum inisiasi replikasi adalah sama pada keduanya. Langkah pertama adalah pengenalan replikator melalui protein inisiator. Protein inisiator dalam kombinasi dengan satu atau lebih helicase mengisi protein mengikat helicase DNA pada replikator. Helicase itu (dan protein potensial lainnya pada origin dalam eukariote) menghasilkan regio ssDNA yang bisa bekerja sebagai templete untuk sintesis RNA primer. Sekali primer disintesis, komponen sisa replisome merakit sampai interaksi dengan menghasilkan primer:juntional templete.

Walaupun peristiwa inisiasi adalah sama, pengaturan replikasi pada bakteri dan sel eukariotik jelas berbeda. Sebagai contoh, tidak seperti sel eukariotik, cepatnya pembagian sel bakteri memulai replikasi lebih dari sekali per siklus sel. Langkah pengaturan dengan lebih ketat juga berbeda. Sel eukariotik fokus regulasi pada memulai penggabungan helicase MCM dengan DNA, sedangkan sel bakteri fokus regulasi pada pengikatan protein inisiator DnaA ke DNA (Box 8-7, Replikasi DNA E. Coli diatur oleh DnaA-ATP Levels dan SeqA).

ADVANCED CONSEPTS

BOX 8-7 Replikasi DNA E. Coli diatur oleh DnaA-ATP Levels dan SeqA

Dalam semua organisme, adalah kritis bahwa inisiasi replikasi dikontrol dengan ketat untuk memastikan sisa kromosome dan sel seimbang. Walaupun keseimbangan ini diregulasi dengan sangat ketat dalam sel eukariotik, E. Coli juga mencegah duplikasi kromosome dengan menghambat origin yang direplikasi dari reinisiasi. Beberapa mekanisme berbeda bertindak reinisiasi replikasi cepat dari oriC.

Satu metode mengekplotasi pergantian dalam daerah yang dimetilasi pada DNA sebelum dan sesudah replikasi DNA (Box 8-7 Fig.1). dalam sel E. Coli, enzim yang dinamakan metiltransferase menambahkan kelompok metyl ke A disepanjang setiap urutan GATC (catatan bahwa urutan itu merupakan ungkapan). Secara khas, genom dimetilasi penuh di urutan GATC. Situasi ini diganti setelah setiap urutan GATC direplikasi. Karena residu A dalam strand DNA terbaru yang disintesis tidak dimetilasi, site yang telah direplikasi baru-baru ini akan dimetilasi hanya pada satu strand (disebut sebagai hemimetilasi),

Daerah yang di hemimetilasi pada oriC yang baru direplikasi dideteksi oleh protein yang dinamakan SeqA. SeqA mengikat dengan ketat ke urutan GATC, tetapi hanya pada saat telah dihemimetilasi. Disana kelimpahan urutan GATC dengan seketika bersebelahan ke oriC. Sekali replikasi diinisiasi, SeqA mengikat pada site ini sebelum mereka bisa menjadi bentuk yang dimetilasi penuh oleh Dam metiltransferase.

Pengikataan SeqA mempunyai dua konsekuensi. Pertama, sangat damatis pengurangan rate yang mana ikatan site GATC dimetilasi. Kedua, pada saat mengikat site proximal oriC ini, SeqA mencegah DnaA dari penggabungan dengan oriC dan memulai putaran replikasi baru. Seperti itu, konversi site proximal GATC oriC dari yang dimetilasi ke yang di hemimetilasi (suatu peristiwa bahwa konsekuensi langsung inisiasi replikasi dari oriC) menghantarkan penghambatan pengikatan DnaA dan oleh karena itu mencegah reinisiasi cepat dari replikasi dari dua salinan anak perempuan oriC baru yang disintesis.

BOX 8-7 FIGURE 1 Pengikatan SeqA pada hemimetilasi DNA Menghambat Reinisiasi dari origin anak perempuan yang baru direplikasi. (a) Lebih dulu replikasi DNA, keseluruhan urutan GATC genome. Coli dimetilasi pada kedua strand (dimetilasi penuh). Catatan bahwa keseluruhan gambar, kelompok metyl diwakili oleh hexagon merah. (b) Replikasi DNA mengkonversi site ini menjadi daerah hemimetilasi (hanya satu strand DNA dimetilasi). (c) Hemimetilasi urutan GATC adalah pengikatan cepat oleh SeqA. (d) Pengikatan protein SeqA menghambat metilasi penuh urutan ini dan pengikatan oriC oleh protein DnaA (untuk sederhana, hanya satu dari dua molekul anak perempuan digambarkan pada bagian d, e, dan f). (e) Pada saat dengan jarang SeqA delepaskan dari site GATC, urutan dapat kembali dimetilasi penuh, oleh Dam DNA metiltransferase, menghambat pengikatan kembali oleh SeqA. (f) Pada saat site GATC dimetilasi penuh, DnaA dapat mengikat urutan 9-mer dan mengarahkan putaran baru replikasi dari replikator oriC anak perempuan.