20

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi Unggas dan Veteriner;

Laboratorium Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan - Instirut Pertanian

Bogor, serta. di Balai Penelitian Ternak Ciawi Bogor. Penelitian dilaksanakan

mulai bulan Iuli 2002 sampai Maret 2004.

Materi PeDelitian

Hewan Perrobaaa

Pada penelitian ini dipergunakan ayam pedaging berumur 1 hari sebanyak

300 ekor yang akan dipelihara selama 7 minggu. Ayam dibagi menjadi 15

kelompok yaitu

a. Kontrol (tanpa probiotik dan antibiotik) dibagi 3 kelompok. yaitu tanpa

infeksi Salmonella (lA), diinfeksi S. enteritidis (18) dan infeksi S.

typhimurlum (IC).

h. Kelompok antibiotik (tanpa probiotik dan diberi antibiotik) dibagi 3

kelompok yaitu tanpa infeksi Salmtmella (2A), diinfeksi S. enteritidis

(2B) dan infeksi S. typhimurium (2C).

c. Kelompok. probiotik Bacillus apiorius dan flInpa antibiotik dibogi 3

kelompok yaitu tanpa infeksi Salmonella (3A), diinfeksi S. enteritidis

(3B) dan infeksi S. typhimurlum (3C).

d. Kelompok probiotik B. coagulans dan tanpa antibiotik dibagi 3

kelompok yaitu tanpa infeksi Salmonella (4A), diinfeksi S. enteritidis

(4B) dan infeksi S. typhimurium (4C).

e. Kelompok probiotik campuran Bacillus sp. (BM) dan tanpa antibiotik

dibagi 3 kelompok yaitu tanpa infeksi Salmonella (5A). diinfeksi S.

enteritidis (5B) dan infeksi S typhimurium (5C).

21

Bakteri Salmonella

Balten Salmonella yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah S.

enteritidis dan S. typhimurium yang berasal dari ayam. Isolat bakteri Salmonella

diperoleh dari Balai Penelitian Veteriner. Bakteri ditumbuhkan pa.da media

selektif Salmonella Shigella (SS) agar. Untuk identifikasi dilakukan pewamaan

Gram dan uji biokimia (Krieg and Holt. 1984 ; Sneath el al., 1986; Williams et

al., 1980).

Probiotik daD aotibiotik

Probiotik yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah :

a. Mengandung isolat B. apiarius 109 CFU/ml

b. Mengandung isolat 8. caagulans 10' CFU/ml

c. Mengandung campuran 6 spesies Bacillus sp. 109 CFUImI

Probiotik diperoleh dari Dr. I Putu Kompiang. APU, Balai Penelitian

Temak Ciawi Bagor. Probiotik berbentuk cairan dan diberikan setiap hari dengan

dosis 2 milliter air minum. Probiotik diberikan pada ayam secara peroral yang

dicampur dengan air minum. Antibiotik yang dipergunakan dalam penelitian ini

adalah zinc bacitrasin. Antibiotik diberikan dengan dicampur dengan pakan 0,1

glkg pakan. Pakan yang digunakan adalah pakan bmiler komersial.

Mctode Peneiitian

Karakterisasi BaciUlIS

Isolat probiotik (bakteri Bacl1/us apiarius dan B. coagulans)

dikarakterisasi. Bakteri ditumbuhkan pada media nutrient agar (NA), media cair

(nutrient brothINB) dan diamati sifat-sifat koloni dan perturnbuhan.

Kurva Pertumbuban

Metode yang digunakan untuk menghitung jumlah total bakteri (Bacillus

apiarius dan B. coagulans) adalah metode penghitungan cawan atau disebut

Total Plate Count (TPC) (MatuTin dan James, 1998). Kultur mumi ditumbuhkan

dalam media nutrien broth (NS) selama 24 jam pada suhu 3'fC, kemudian

22

disentrifugasi 500g selama 25 menit uotuk mendapatkan pelet. Pelet dirnasukan

ke dalam 2 ml NB dan dihomogenkan. Untuk menghitung konsentrasi bakteri.

diambil 1 ml isolat dan dicampurkan ke dalam 9 ml NaCI fisioiogis 0,96%,

kemudian dihomogenkan. Selanjutnya dilakukan pengenceran secara seri 10.2,

10'3, dan seterusnya sampai to-10, Masing-masing pengenceran dipupuk ke

dalam media nubi.en agar dan diinkubasikan selama 24 jam pada subu 3'fC.

Koloni yang tumbuh dihitung dan diketahui jumlah awat bakteri.

Untuk pengamatan kurva pertumbuhan isolat yang telah diketahui

jumlahnya diinkubasi pada 37"C. Pemupukan dilakukan padajam ke 2, 4, 8, \2,

16, 20, 24, 28, 32, 36, dan 40.

Uji Dambat Pertumbuhan Salmonellil secara in vitro

Vji hambat pertumbuhan bakteri Salmonella """"" in vitro dengan bakteri

probiotik (B. apiarius, B. coaguJans) dilakukan menurut metode Miyamoto et ai.

(2000) yang dimodifilcasi. Vji hambat pertumbuhan bakteri Salmonella dilakukan

dengan menanam SoJmonel/a enteritidis dan Salmonella typhimurium masing­

masing dalam media Mueller Hinton agar secara merata. Kemudian pada cawan

petri yang telah diinokulasi Salmonella tersebut diinokusasikan kertas cakram

yang berisi probiotik yang diuji yaitu isolat B. opiarius dan B. coagulans.

Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 31' C. Zona hambatan

pertumbuban yang terben\Uk diamati.

PemberiaD probiotik

Dalam penelitian ini digunakan I'8Ilcangan acak lengkap. Ayam dibagi

menjadi 15 kelompok, masing-masing terdiri dari 20 ekor seperti tercantum

diatas.

Dosis probiotik B. apiarius, B. coagulans dan probiotik BM adalah 2ml/

liter air minum. Probiotik diberikan setiap hari mulai umur 1 hari sampai umur 6

minggu. Kandidat Probiotik mengandung masing-masing B. apiarius 109 colony

forming unit (CFU)/ml dan B. coaguJans 109 CFU/ml da.., BM mengandung 109

CFU/ml bakteri penyusunnya. Antibiotik pemacu pertumbuhan (growth promoter)

yang dipergunakan adalah zinc bacitrasin yang dicampurkan ke dalam pakan

23

dengan dosis 0.1 gram/kg pakan. Pakan dan air minum diberikan secara ad

libitum.

InfeksiSabnoneUa

Biakan bakteri Salmonella (s. enteritidis dan S. typhimurium) diambil

koloni 1 loop dan ditanam pads media kaldu brain heart infusion (BHl) dan

diinkubasikan pada suhu 37' C selama 18-24 jam (Alisantosa et ai., 2000;

Desmidt ., al., 1997). Kemudian disentrifus (500g, 10 menil) sehingga terbentuk

pelet. Untuk memperoleh dosis inokulum, pelet diencerkan dengan Jarutao NaCI

fisiologis steril dan .kekeruhannya disamakan dengan standar McFarland no. 1

yang setara dengan 109 Colony fonning unit (CFU)/ml (Miyamoto, el al., 1998).

Pad, saat berumur 3 minggu 'yam diinfeksi dengan Salnwnella (S.

enteritidis dan S. typhimurium). Infeksi dilakukan peroral dengan dosis 10'

CFU/ml (Alisantosa., aI., 2000; Desmidt., aI., 1997).

Pengamatao Performan

Peubah perfonnan yang diamati adalah berat badan, pertamhahan berat

badan, konsumsi kumulatif dan nilaifeed conversion rate (FeR).

Berat bad .. daD pertambauD bera. badaD

Setiap minggu ayam percobaan ditimbang uotuk mengetahui berat badan

dan kenaikan berat badannya.

KODsumsi kumulatif dan Feed conversion rate (FeR)

Untuk mengetahui jumlah pakan yang dikonsumsi dan efisiensi

penggunaan pakan pada ayam percobaan maka dilakukan penimbangan pakan

yang diberikan. Setiap hari pakan yang diberikan (pagi dan sore) ditimbang,

kemudian pakan yang tersisa juga ditimbang, sehingga dapat diketahui jumlah

pakan yang dikonsumsi oleh ayam. Selanjutnya dilakukan penghitungan FeR.

24

Status Kesehatan

Untuk mengetahui status kesehatan hewan percobaan maka dilakukan

pemeriksaan gambaran darah yang meliputi jumlah eritrosit, lekosit, kadar

hemoglobin dan hematokrit (Packed cell vo/umeIPCV) serta kemampuan

fagositosis dan clearance sel heterofil (polimorfonuklearlPMN).

PemeriksaaD Gambaraa Dara"

Pemeriksaan gambaran darah pada ayam percobaan dilakukan uotuk

mengetahui status kesebatan ayam tersebut. Untuk pemeriksaan gambaran darah,

darah diambil dari vena brachialis selanjutnya dilakukan pemeriksaan :

Jam"" Eritrosit daD Lekosit

Jumlah eritrosit dan lekosit dihitung menurut metode hemositometer.

Darah dihisap det1gan aspilator pada pipet eritrosit abIU lekosit Kemudian

dengan pipet yang sarna dihisap tarutan Rees dan Ecker dan dikocok. Campuran

tersebut kemudian dimasukkan kedalam kamar hitung Neubauer dan jumlah

eritrosit dan lekosit dihitung.

Nilai He .... tokrit

Nilai hematokrit diukur dengan metode mikro hematokrit. Darah

dimasukkan ke dahun pipa kapiler. Kemudian disentrifus selama 15 menit dengan

kecepatan 3000 rpm. Nilai hematokrit dibaca dengan menggunakan

microhematocrit reader.

Kadar Hemoglobin (Hb)

Nilai hemoglobin diukur dengan metode Sianmedtemoglobin.

Uji Fagositosis set beterofil (PMN)

Uji fagositosis dilakukan uotuk mengetahui aktivitas dan kapasitas

fagositosis oteh sel !ekosit polimorfonuklear (PMNlhcterofil). Uji fagositosis

dilakukan pada saat ayam berumur 6 minggu pada kelompok lA, 2A, 3A, 4A dan

5A. Sampel darah diambil dan vena brachiaJis. Ke dalam tabung reaksi diisi 5

25

mllanltan ®ficoll faque dingin, kernudian secara perlahan-Iahan ke dalam tabuog

tersebut diisi 5 ml darah ayam dari setiap kelompok sehingga terbentuk 2 lapisan

(Andreasen dan Latimer, 1989). Campuran disentrifus (l500g, 15 meDit),

kemudian supematan dibuang. Endapan yang terdiri atas eritrosit dan PMN

ditambahkan larotan NH4CI 0,87% (pH 7,2) dingin sambil dikocok kuat hingga

terjadi hemolisa sempuma. Suspensi disentrifus dan dicuci beberapa kali hingga

endapan PMN terbebas dari eritrosit. Endapan PMN disuspensikan dalam larutan

RPM!.

Uji viabilitas sel PMN menggunakan larutan tripan blue 0.4% dalam

larutan NaC) 0,81% dan 0,06% Na2HPO. sterH dan penghitungan lekosit

menggunakan hemositometer.

Penentuan jumlah sel bakteri untuk uji fagositosis dilakukan secara

spektrofotometer (/.. 620 om, transmisi 10%). Suspensi bakteri dica.mpur dengan

suspensi PMN dengan perbandingan 1000 : 1 (Wibawan dan Laemmler, 1994).

Kemudlan campuran diinkubasikan selama 30 menit pada subu 37' C.

Untuk mengetahui aktivitas dan kapasitas fagositosis campuran PMN dan

bakteri dibuat preparat ulas dan diwamai dengan Giemsa. Aktivitas fagositosis

adalah jumlah sci PMN yang menelan bakteri per 100 PMN. Kapasitas

fagositosis adalah jumlah bakteri yang ditelan oleh sci PMN per 50 PMN yang

menunjukkan aktivitas fagositosis (Wibawan dan Laemmler, 1994).

Uji Kemampuan clearance sel PMN

Kemampuan clearance sel PMN dihitung menurut metode (Anderson et

al., 1984). Campuran suspensi bakteri Salmonella dan sel PMN yang telah

diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 3-tC. Kemudian disentrifus (500g)

selama 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supematan.

Untuk mengetahui jumlah CFU bakteri Salmonella yang tidak dimakan

oleh PMN. supematan ditumbuhkan pada media SS agar. diinkubasi selama 24

jam pada suhu 3 -tc. Sedangkan pelet yang mengandung sel PMN yang mernakan

bakreri Salmonella disuspensikan kembali dan diinkubasi selama 30 menit pada

suhu 3~C.

26

Setelah inkubasi kembali selarna 30 menit pada suspensi tersebut

ditambahkan aquades yang mengandung 0,01 % gelatin dan dikocok

menggunakan vortex selama 60 detik. Selanjutnya ditumbuhkan pada media SS

selama 24 jam agar dan CFU dihitung. Persentase yang bakteri Salmonella yang

dimakan dan mati dihitung rnenurut rumus Anderson el 01., 1984.

Persentase Salmonella yang dimakan PMN pada 30 menit dihitung dengan

rumus:

No : Jumlah CFU awal

N, : Jumlah CFU dalam supematan pada 30 menit

Persentase Salmonella yang mati oleh PMN pada 60 menit dihitung

deilgan nunus : r-:-:---cc:-------,

N2 -Nl xlOO N,

N, : Jumlah CFU dalam supernatan peda 30 menit

N, : Jumlah CFU peda pele! pada 60 menit

Reisolasi da. pengbitungaD jumlab SabnoneJJo. pada sekum

Untuk pemeriksaan reisolasi Salmonella, sampel yang diambil adalah

organ sekum. Organ sekum diambil dari setiap hewan percobaan. lsi organ

sekum ditimbang 1 gram, kemudian diencerkan dengan akuades steril secara

,bertingkat dan ditanam pada media SS agar (Lafont et a1., 1983; Miyamoto et al.,

1998; Seo et a1., 2000). Koloni yang tumbuh dihitung, sehlngga diketahui jumlah

CFU/gram. Selanjutnya dilakukan identifikasi.

27

Pemeriksaan Pases mati

Pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik dilakukan pada organ sistem

pencemaan yaitu usus dan hati; dan organ sistem pertahanan yaitu bursa Fabricius

yang merupakan organ limfoid primer dan sekal tonsil yang merupakan organ

Iimfoid selrunder. Serta dilakukan pemeriksaan morfometrik pada usus dan bursa

Fabricius.

Pemeriksaao makroskopik (patologi aDatomiIP A)

Pada I, 2, 3 dan 4 minggu pasco infeksi (pi) 4 ekor ayam dari setiap

kelompok dinekropsi. Pada saat nekropsi dilakukan pemeriksaan terhadap

perubahan patologi _i (pAimakroskopik) yang terjadi pada organ terutama

organ pencemaan (usus dan bati) dan organ pertahanan (bursa Fabricius dan sekol

tonsil). Pengan>a1an menggunakan sknr berdasarkan perkembangan lesie.

Pembuatan preparat histopatologi

Untok pemcriksaan mikroskopik (histopatologilHP) sampel organ

pencemaan dan pertahanan difiksasi dalam larutan buffer normal formalin (BNF)

100/., didehidrasi dengan a!kobol berbagai konsentras~ clearing dengan xylol dan

diembedded dalam parafin, Kemudian dipotong dengan ketebalan 5 ~m dan

sediaan diwarnai dengan hematoksilin eosin (HE), Pengamatan menggunakan

skor berdasarkan perkembangan lesio mikroskopik.

Pemerlksaa. orgaa sistem peaceraaaa daD perla ......

Organ pencernaan yang diamati terutarna adalah usus dan hati. sedangkan

organ pertahanan yang diamati ada1ah bursa Fabricius dan sekal tonsil.

Pemeriksaan yang dilakukan pada organ-organ tersebut adalah sebagai ,berlkut :

28

Organ Pencernaan

Organ usus

Berat relatif usus

Organ usus ditimbang untuk mengetahui herat relatif organ tersebut

Berat relatif dihitung dengan mernbagi berat organ dengan berat badan.

Laas permukaan usus (per villi)

Penghitungan luas pennukaan usus dilakukan pada yeyunum dan ileum.

Penghitungan luas pennukaan per villi usus dilakukan dengan membual preparaI

histopatologi u,::us dan diwamai dengan hematoksilin dan eosin (HE).

Penghitungan luas pennukaan per villi dihitung menggunakan mikroskop

(Olympus) dengan pembesaran objektif 4 leali dan video mikromder (Video

measuring gauge IV - 560, FOR A company limited) poda 10 Iapong pandang

pada setiap preparat histopatologi. Kemudian dihitung luas pennukaan villi

dengan penghitungan menurut metode Iji et aI. (2001):

Luas pennukaan per villi = (c + bl (b xa)

a = tinggi villi

b = lebar apikal vi IIi

c = lebar basal villi

Kerapatan villi usus

Kerapatan villi dihitung pada yeyunum dan ileum. Kerapatan villi dihitung

dengan menghitung jumlah villi pada I mm panjang usus dengan menggunakan

mikroskop (Olympus) dengan pembesaran objektif 4 leali dan viden mikrometer

(Video measuring gauge IV - 560, FOR A .company limited). Jumlah villi

dihitung pada 10 lapang pandang pada setiap preparat histopatologi.

Pengamatan makroskopik usus

Penilaian lesio makroskopik (Patologi anatomifPA) dilakukan dengan

memberikan skoring berdasarkan derajat perubahan yaitu :

o = tidak: ada perubahan

I = pembendunganlhiperemi pembuluh darah

2 = enteritis kataralis

3 = enteritis hemorhagika

4 = nekrotik

Lesio mikroskopik usus

29

Usus dibagi menjadi 4 bagian yaitu duodemnn. yeyunum, ileum dan

sekum. Penilaian dilakukan pada 10 Japang pandang pada setiap preparat.

Penilaian lesio dilakukan dengan memberikan skoring berdasarlam derajat

perubahan yaitu :

o ~ tidak ada perubahan

I ~ perubendunganlhiperemi pembuluh darah

2 = edema

3 ~ pendarahan

4 ~ infiltrasi sel radang

5 = deskuamasi epitel

Jumlah set radaDg pada usus

Sel radang yang dihitung adalah makrofag, heterofil (PMN), limfosit dan

sel plasma. Sel radang dihitung pada bagian lamina propia mukesa pada

duodenum, yeyunum dan ileum dengan pembesaran objektif 100 kali pada 10

lapang pandang pada setiap preparat Kemudian dirata-ratakan.

Orgao bati

Berat relatif bati

Organ hati ditimbang uotuk mengetahui berat relatif organ tersebut. Berat

relatif dihitung dengan membagi berat organ dengan berat badan.

Pengamatan makroskopik bati

Penilaian lesio makroskopik (Patologi anatomiIPA) dilakukan dengan

memberikan skoring berdasarkan derajat perubahan yaitu :

o = tidak ada perubahan

1 = pembendungan dan wama belang

2 = bengkak dan pucat

3 = rapuh

4 = pendarahan

5 = nekrotik

Lesio mikroskopik uti

30

PenHaian dilakukan pada lO lapang pandang pada setiap prepanat.

Penilaian lesio dilakukan dengan memberikan skoring berdasarkan derajat

perubahan yaitu :

0= tidak ada perubahan

1 = pembendunganlhiperemi pembuluh darah

2 = degenerasi hepatosit

3 = infiltrasi sel radang

4 = nekrotik bepatosit

Hiperemilpembendungan dibeti penilaian yaitu riDpD (+) apabila

kurang dari 30 % dari pembuluh darah yang mengalami hiperemi daIam 1 lapang

pandang, sedaog (++) bila 30 - 50 %, parah (+++) bila <50 -70% dan .. agot

parah (++++) bila diatas 70% dalam satu iapang pandang.

Derajal untuk degenerasi sel bali dengan katagori: riaga. (+) bilaleljadi

degenerasi individual dalam satu lapang panclang; sedaog (++) leljadi fokus

degenerasi; parall (+++) leljadi mu\tifokus degenerasi dan saogat parah

(++++) bila teljadi degenerasi yang bersifut difus.

31

Organ pertahanao

Organ sistem pertahanan yang diperiksa dalam penelitian ioi adalah bursa

Fabricius dan sekal tonsil.

Bursa Fabricius

Berat relataf bursa Fabricius

Organ bursa Fabricius ditimbang untuk mengetahui herat relatif organ

tersebut. Berat relatif dihitung dengan membagi herat organ dengan berat badan.

Pengamataa makroskopik bursa Fabricius

Penilaian lesio makroskopik (patologi anatomiIPA) dilakukan dengan

memberikan skoring berdasarkan derajat perubahan yaitu :

o ~ tidak ada perubahan

1 = membesar dan edema

2 ~ pendarahan

3 ~nekrotik

Lesio mikroskopik bursa Fabricius

Perubahan mikroskopik yang diamati adaIab persentase edema, persentase

deplesi, jumlah makrofag dan jumlah sellimfoid yang mengalami nekrose.

_ deplesi adalab rataan jnmlah folikel limfoid yang mengalami

deplesi pada 10 plika dibagi dengan rataan jum lab folikel Iimfoid pada 10 plika

pada setiap preparal histopatologi.

Persentase edema adalah jumlah plika yang mengalami edema dibagi

jumlab plika yang terdapat pada bursa Fabricius.

Jumlah sel limfoid yang mengaiami nekro~ dan jumlah makrofag pada

folikel limfoid dihitung pada setiap folikel limfoid pada 10 plika pada setiap

preparat histopatologi. Sel limfoid yang mengalami nekrose adalah sel Iimfoid

yang mempunyai ioti piknotik (karyopiknotik) atau reksis (karyoreksis).

32

Pengamatan morfometrik folikellimfoid bursa Fabricius

Pengamatan morfometrik folikel limfoid bursa Fabricius adalah ukuran

panjang dan lcbar folikel limfoid. Pengukuran dilakukan pada setiap folikel

Iimfoid yang terdapat pada 10 plika pada setiap preparat dengan menggonakan

mikroskop (Olympus) dengan pembesaran objektif 4 kali dan video mikrometer

(Video measuring gauge IV - 560, FOR A company limited).

Sekal toDsil

Pengamata. makrookopik sekaI toasil

Penilaian lesio makroskopik (Patologi anatomiIPA) dilakukan dengan

memberikao skoring berdasarkan derajat perubahan yaitu :

o = tidak ada perubahan

1 =beagkak

2 = pendsrahan

3 = nekrotik

Lesio mikroskopik sekal tODsH

Penilaian dilakukan pada 10 lapang pandang pada setiap preparat.

Penilaian lesio dilakukan dengan memberikan skoring berdasarkan derajat

perubahan yaitu :

o = tidak ada perubahan

1 = pembendunganlhiperemi pembuluh darah

2 = edema

3 = pendarahan

4 = infiltrasi sel radang

5 = deskuamasi epilel

Jumlah germinal alire, pada sekat tonsil

Jumlah germinal center (Ge) yang terdapat pada sekal tonsil dihitung

pada 10 lapang pandang dengan pembesaran objektif 10 kali pada setiap preparat

histopatologi.

33

Analisis Data

Data kuantitatif yang diperoJeh dalam penelitian ini diuji dengan analisa

sidik ragam dan dilanjutkan dengan uji multiple Duncan uotuk mengetahui

perbedaan antar perlakuan (Steel dan Torrie, 1991). Data non parametrik yang

diperoleh dalam penelitian ini dianalisa dengan uji Friedman. Data seianjutnya

dianalisis menggunakan software SAS release 8,2