BAB IVANALISA KUALITATIF PROTEIN

A. Pre-lab

1. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode ninhidrin ?Prinsip dari percobaananalisis protein dengan metode ninhidrin adalah Ninhidrin beraksi dengan asam amino bebas pada protein menghasilkan warna biru. Reaksi ini termasuk yang paling umum dilakukan untuk analisis kualitatif protein dan produk hasil hidrolisisnya. Reaksi ninhidrin dapat pula dilakukan terhadap urin untuk mengetahui adanya asam amino atau untuk mengetahui adanya pelepasan protein oleh cairan tubuh (Pine, 2008).

2. Bagaimana prinsip analisa protein dengan metode biuret ? Prinsip dari percobaananalisa protein dengan metode biuret adalah Cupri sulfat (CuSO4) dalam suasana basa bereaksi dengan senyawa yang mengandung dua ikatan peptida atau lebih memberikan senyawa kompleks ungu. Keadaan warna ungu menunjukkan jumlah ikatan peptida dalam protein. Reaksi menunjukkan hasil positif terhadap dua senyawa yang mengandung dua gugus karbonil yang dihubungkan melalui satu atom N dan C (Poedjaji, 2005).

3. Mengapa pengujian protein selalu di lakukan pada kondisi alkali/basa ?Sifat protein yang amfoter yaitu protein dalam suasana pelarut yang bersifat asam akan bertindak sebagai basa atau memberikan proton pada basa kuat dan dalam suasana pelarut yang bersifat basa bertindak sebagai asam atau menerima proton dari basa kuat. Selain itu pada pH alkali/basa, dapat menyebabkan pembentukan cross-link pada protein sehingga protein tidak mudah pecah (Winarno, 2004).

TINJAUAN PUSTAKA

1.1 Definisi ProteinProtein merupakan senyawa polimer organik yang berasal dari monomer asam amino yang mempunyai ikatan peptida. Istilah protein berasal dari bahasa Yunani “protos” yang memiliki arti “yang paling utama” (Harrow, 2006).

1.2 Struktur ProteinStruktur protein ada 4 tingkatan yaitu :a. Struktur primer menunjukkan jumlah, jenis dan urutan asam amino dalam molekul protein (rentetan asam amino dalam suatu molekul protein)b. Struktur sekunder menunjukkan banyak sifat suatu protein, ditentukan oleh orientasi molekul sebagai suatu keseluruhan, bentuk suatu molekul protein (misalnya spiral) dan penataan ruang kerangkanya (ikatan hidrogen antara gugus N-H, salah satu residu asam amino dengan gugus karbonil C=O residu asam yang lain)c. Struktur tersier menunjukkan keadaan kecenderungan polipeptida membentuk lipatan tali gabungan (interaksi lebih lanjut seperti terlipatnya kerangka untuk membentuk suatu bulatan)d. Struktur kuartener menunjukkan derajat persekutuan unit-unit protein.

Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam 2 golongan yaitu:a. Protein sederhana yang merupakan protein yang hanya terdiri atas molekul-molekul asam aminob. Protein gabungan yang merupakan protein yang terdiri atas protein dan gugus bukan protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas karbohidrat, lipid atau asam nukleat (Winarno, 2004).

(Arsyd, 2004).

1.3 Sifat atau Karakteristik1. Protein bisa dirusak oleh panas yang berlebihan, pengadukan yang berlebihan terhadap

solusi protein, bahan kimia dan adanya penambahan asam serta basa. 2. Bisa berubah tidak hanya dengan zat kimia, namun juga dengan pengaruh fisik. Protein

dapat dalam ratusan dan dapat diubah menjadi pengendapn atau gel.

3. Protein dalam larutan dapat membentuk film atau selaput. Polmerisasi, protein dapat terpecah atau terurai menjadi bentuk yang lebihsederhana lagi. Inidapat terjadi jika protein beraksi dengan basa, asam atau pun enzim (Arsyd, 2004).

1.4 Metode Pengujian Kualitatif proteinReaksi-reaksi khas pada protein (uji kualitatif) :a. Reaksi Ninhidrin.

Ninhidrin beraksi dengan asam amino bebas pada protein menghasilkan warna biru. Reaksi ini termasuk yang paling umum dilakukan untuk analisis kualitatif protein dan produk hasil hidrolisisnya. Reaksi ninhidrin dapat pula dilakukan terhadap urin untuk mengetahui adanya asam amino atau untuk mengetahui adanya pelepasan protein oleh cairan tubuh.

b. Reaksi Biuret. Bila larutan protein dalam suasana basa kuat direaksikan dengan larutan CuSO4 pekat, akan dihasilkan warna ungu. Warna yang dihasilkan dari reaksi tersebut disebabkan oleh ikatan koordinasi antara ion Cu2+ dengan pasangan elektron bebas dari N yang berasal dari protein dan pasangan elektron bebas dari O molekul air.

c. Reaksi Uji Millon untuk Tirosin. Reagen Millon adalah larutan asam nitrat yang mangandung raksa (I) nitrat dan raksa (II) nitrat. Bila reagn millon dicampurkan dengan larutan yang mengandung protein akan terbentuk endapan putih yang akan berubah merah bila dipanaskan.

d. Uji Penetralan Titik Isoelektrik. Titik isoelektrik adalah daereah pH tertentu diman protein mempunyai selisih muatan, sehinggatidak bergerak dalam muatan listrik (Riawan, 2004).

1.5 Reaksi dan fungsi ReagenBiuretLarutan Protein + NaOH + CuSO4 = lembayung. Berlaku untuk senyawaan yang mempunyai

jumlah ikatan peptida > 1. Reaksi ini dapat dipakai untuk penentuan protein secara kualitatif

dan kuantitatif.

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat, apabila

pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat

berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol,

karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein

yang mengandung tirosin akan memberikan reaksi positif (Poedjaji, 2005).

DAFTAR PUSTAKA

Arsyad,  M. Natsir. 2004. Kamus Kimia Arti dan Penjelasan Istilah. Jakarta: Gramedia.

Fessenden dan Fessenden. 2007. Kimia Organik Jilid 2. Jakarta: Erlangga.

Harrow, Benjamin. 2006. Textbook of Biochemistry. London: W. B. Saunder Company.

Poedjiadi, A. 2005. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

Pine, Stanley H. dkk. 2008. chemistry 2. Bandung: ITB Press.

Riawan, S. 2004. Kimia Organik Edisi 1.  Jakarta: Binarupa Aksara.

Winarno, F, G. 2004. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

1.6 Tinjauan Alat dan Bahan Aquades

Aquades adalah air dari hasil penyulingan (diuapkan dan disejukan kembali) dan memiliki kandungan murni H2O.

TelurZat gizi utama yang terkandung dalam telur adalah protein kualitas tinggi. Protein telur terdiri atas asam-asam amino esensial yang lengkap dalam jumlah yang sama atau di atas pola asam amino esensial yang di anjurkan FAO.

Gelatin Gelatin adalah suatu jenis protein yang diekstraksi dari jaringan kolagen kulit, tulang atau

ligamen (jaringan ikat) hewan. Skim

Skim adalah bagian susu yang tertinggal setelah krim diambil sebagian atau seluruhnya. Pemanis Sitetik Rendah Kalori

Bahan organic sintetik ialah senyawa kimia yang tersusun dari rantai karbon, terdiri atas 1000 atom atau lebih pada tiap makro molekulnya. Biasanya bahansintetik terdiri atas campuran molekul sejenis dengan ukuran yang berbeda.

MSG Glutamat adalah salah satu dari 20 asam amino penyusun protein. Sebagai asam amino, glutamate termasuk dalam kelompok non esensial, yang artinya tubuh mampu memproduksi sendiri.

Tabung reaksi, sebagai tempat meletakkan sampel yang akan direaksikan dengan reagen

Rak tabung reaksi, sebagai tempat meletakkan tabung reaksi agar tidak tumpah

Pipet ukur + bulb, untuk mengambil larutan reagen (Fesendenn, 2007).

B.Diagram Alir

1. Uji Ninhidrin

Diambil masing-masing 2 mlKe dalam tabung reaksi

Dimasukan pada air mendidih dalamGelas beker selama 15-20 detik

Diamati warna larutan yang terbentuk

2. Uji Biuret

Diambil masing-masing 3 mlke dalam tabung reaksi

Dikocok

Diamati warna larutan yang terbentuk

C. Hasil Percobaan dan Pengamatan :1. Uji Ninhidrin

Sampel

2 ml larutan ninhidrin

Hasil

Sampel

1ml NaOH

5 teteslarutasn CuSO4 0,1%

Hasil

a. Tuliskan data hasil uji Ninhidrin

No Sampel Sebelum Pemanasan Sesudah Pemanasan Hasil Uji1.

MSGTak berwarna Berwarna ungu

kehitaman+

2. Aspartam Warna putih Berwarba ungu, endapan putih

+

3. Gelatin Tak berwarna Tak berwarna -4. Susu skim Warna putih Berwarna ungu +5. Putih telur Kuning bening putih -

b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Ninhidrin dari beberapa sampel dalam percobaan ini!

Uji ninhidrin merupakan uji umum untuk protein yang spesifik untuk asam amino. Dalam percobaan kali ini menggunakan sampel MSG, aspartam, gelatin, susu skim dan putih telur. Dari data hasil praktikum di atas menunjukkan hasil yang berbeda-beda tiap sampel. Dengan percobaan ini dapat diketahui sampel mana yang positif mengandung protein dilihat dari ada atau tidaknya kandungan asam aminonya.

Percobaan pertama diawali dengan sampel MSG. Mula-mula MSG dimasukkan pada tabung

reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet volume, selanjutnya aspartam dimasukkan pada

tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet volume. Selanjutnya gelatin dimasukkan

pada tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet tetes. selanjutnya susu skim

dimasukkan pada tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet volume, dan yang terakhir

putih telur dimasukkan pada tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet volume.

Kemudian masing-masing sampel ditambahkan ninhidrin sebanyak 2 ml. Kemudian secara

bersamaan ke-lima sampel tersebut dimasukkan dalam gelas beker yang berisi air mendidih

selama 15-20 detik. Kemudian secara bersamaan pula ke-lima sampel diangkat dari gelas

beker.  Selanjutnya diamati perubahan warna yang terjadi pada kelima sampel tersebut.

Perubahan warna pada masing-masing sampel:1. Sampel Aspartam menghasilkan Warna Ungu.2. Sampel MSG menghasilkan Warna Ungu kehitaman.3. Sampel Gelatin menghasilkan Warna Tak berwarna.4. Sampel Susu Skim menghasilkan Warna Ungu.5. Sampel Telur menghasilkan Warna Putih.

Analisa perubahan warna pada sampel sebagai berikut:1. Sampel Aspartam mengalami perubahan warna dari berwarna putih menjadi ungu.

2. Sampel MSG mengalami perubahan warna dari tak berwarna menjadi ungu kehitaman.

3. Sampel Susu Skim mengalami perubahan warna dari putih menjadi ungu.4. Sampel Telur mengalami perubahan warna dari kuning bening menjadi putih.5. Sampel Gelatin tidak mengalami perubahan warna namun tetap tak berwarna.

Perbandingan masing-masing sampel terhadap perubahan warnanya:- Sampel Aspartam,MSG,dan Susu Skim menghasilkan warna ungu yang berarti

sampel positif mengandung gugus asam amino.- Sedangkan Putih Telur,dan Sampel Gelatin tidak menghasilkan warna ungu

melainkan warnanya tetap meski telah dipanaskan yaitu Gelatin tak berwarna dan Telur kuning bening menjadi putih yang berarti sampel negatif.

Analisa jenis sampel pada uji Ninhidrin adalah:1. Sampel Aspartam, MSG, Susu Skim termasuk sampel positif karena mengalami

perubahan warna menjadi ungu sehingga dapat dipastikan jika ketiga sampel tersebut mengadung adanya asam amino bebas.

2. Sampel Gelatin dan Telur tidak berubah warna menjadi ungu melainkan putih dan tak berwarna meski telah dipanaskan karena tidak mengandung kadar asam amino bebas sehingga tidak membentuk senyawa kompleks warna ungu.

Mekanisme reaksi yang terjadi pada uji Ninhidrin adalah:Pada uji Ninhidrin dihasilkan warna biru pekat sampai ungu dikarenakan adanya proses reduksi reagen Ninhidrin oleh Asam α amino.Setelah reaksi itu terjadi akan diperoleh Ninhidrin yang tereduksi,Aldehid,dan NH3 disertai dengan terlepasnya gas CO2

Kemudian Ninhidrin tereduksi dengan Aminia ditambah dengan Ninhidrin yang lain.Hal ini menyebabkan terjadinya proses Kondensasi yang melepaskan 3 molekul H2O dan menghasilkan garam diketo-Hyrihalide-diketo-Hydramine.Garam tersebutlah yang menyebabkan warna biru pekat sampai ungu.

Reaksi yang terjadi pada uji ninhidrin ini adalah :

Pada percobaan ini telah sesuai dengan literatur bahwa sampel aspartam, susu skim, dan

MSG memiliki hasil uji positif karena adanya perubahan warna ungu. Sedangkan pada telur

dan gelatin memiliki hasil uji negatif karena tidak adanya perubahan warna ungu meski telah

dipanasakan (Riawan, 2004).

2. Uji Biuret

a. Tuliskan data hasil uji Biuret

No Sampel Sebelum Ditambah Reagen

Setelah Ditambah Hasil Uji

1. MSG Tak berwarna Tak berwarna -2. Aspartam Warna putih Tak berwarna -3. Gelatin Tak berwarna Tak berwarna -4. Susu skim Warna putih Berwarna ungu +5. Telur Kuning bening Berwarna ungu +

b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Biuret dari beberapa sampel dalam percobaan ini!

Uji biuret merupakan uji umum untuk protein yang spesifik untuk ikatan peptida. Dalam percobaan kali ini menggunakan sampel MSG, aspartam, gelatin, susu skim dan putih telur. Dari data hasil praktikum di atas menunjukkan hasil yang berbeda tiap sampel. Dengan percobaan ini dapat diketahui sampel mana yang positif mengandung protein dilihat dari ada atau tidaknya ikatan peptida

Percobaan pertama diawali dengan sampel  MSG. Mula-mula MSG dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet volume, kemudian ditambah reagen NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO4 menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya. Sampel kedua yaitu aspartam, aspartam dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet volume, kemudian ditambah reagen  NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah  itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO4

menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya. Sampel ketiga yaitu gelatin, gelatin dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet tetes, kemudian ditambah reagen  NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah  itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO4 menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya. Sampel keempat yaitu susu skim, susu skim dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet volume, kemudian ditambah reagen  NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah  itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO4 menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya. Terakhir sampel kelima yaitu putih telur, putih telur dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet volume, kemudian ditambah reagen  NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah  itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO4 menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya.

Perubahan warna pada masing-masing sampel:

1. Sampel Aspartam menghasilkan warna tak berwarna.2. Sampel MSG menghasilkan warna tak berwarna.3. Sampel Susu Skim menghasilkan warna ungu.4. Sampel Gelatin menghasilkan warna tak berwarna.5. Sampel Telur menghasilkan warna ungu.

Analisa perubahan warna pada tiap-tiap sampel:

1. Sampel Aspartam mengalami perubahan warna dari putih menjadi tak berwarna.2. Sampel MSG tidak mengalami perubahan warna melainkan tetap dari tak

berwarna menjadi tak berwarna lagi.3. Sampel Susu Skim mengalami perubahan warna dari putih menjadi warna ungu.4. Sampel Gelatin tidak mengalami perubahan warna melainkan tetap dari tak

berwarna menjadi tak berwarna kembali.5. Sampel Telur mengalami perubahan warna dari kuning bening menjadi warna

ungu.

Perbandingan masing-masing sampel terhadap perubahan warnanya:

- Sampel Susu Skim dan Telur termasuk sampel positif karena menghasilkan warna ungu setelah dipanaskan

- Sampel Aspartam, MSG, dan Gelatin termasuk sampel negatif karena tidak menghasilkan warna ungu meski telah dipanaskan

Analisa jenis sampel:

- Sampel Susu Skim dan Telur ternyata setelah proses pemanasan kedua sampel tersebut menghasilkan warna ungu dikarenakan pada sampel tersebut mengandung ikatan peptida yang berarti sampel tersebut merupakan sampel positif.

- Sampel Aspartam, MSG, dan Gelatin hasil ujinya adalah negatif,  karena setelah direaksikan warnanya tidak berubah dan tidak membentuk warna ungu. Hal ini dikarenakan MSG tidak memiliki ikatan peptida, sedangkan aspartam hanya memiliki satu ikatan peptida.

Mekanisme reaksi yang terjadi pada uji Biuret adalah :

Terjadinya reaksi pembentukan kompleks Cu2+ yang dihasilkan dari CuSO4 dengan gugus CO dan NH pada ikatan peptida dan melarutkan dalam suasana basa.Sehingga menghasilkan senyawa kompleks yang berwarna biru pekat sampai ungu.Penambahan NaOH bertujuan untuk memberikan suasana basa/alkalis. Reaksi yang terjadi pada uji biuret ini adalah :

Persamaan dan Perbedaan dengan Literatur :

Persamaan : pada uji biuret sampel aspartam dan MSG sama-sama berninalai negatif karena tidak adanya perubahan warna ungu, dan pada sampel telur dan susu skim menghasilkan warna ungu sehingga bernilai positif karena adanya ikatan peptida

Perbedaan : pada uji biuret untuk sampel gelatin pada literatur hasil ujinya positif, karena setelah direaksikan dengan reagen pada permukaannya warnanya berubah menjadi ungu. Hal ini disebabkan karena ketiganya memiliki ikatan peptida lebih dari dua sehingga bisa diidentifikasi dalam uji biuret ini, dan hasil ujinya positif. Apabila warnanya ungu maka ikatan peptidanya panjang, apabila warnanya kemerahmudaan maka ikatan peptidanya pendek. Pada gelatin, susu skim dan putih telur sama-sama permukaannya berwarna ungu

jadi ketiganya sama-sama memiliki ikatan peptida yang panjang (Winarno, 2004). Kesalahan dan ketidak tepatan hasil percobaan dengan literatur desebabkan antara lain karena terlalu lama didiamkan setelah ditambah ninhidrin dan air yang digunakan belum mendidih dengan sempurna.

PERTANYAAN

1. Bagaimana mengidentifikasi adanya gugus amino pada sampel dengan menggunakan uji Ninhidrin?

Dengan memasukkan reagen ninhidrin pada sampel, karena asam amino akan bereaksi dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Sehingga indikasi adanya asam amino ditunjukkan oleh perubahan warna sampel pada saat sesudah direaksikan dan dipanaskan, yakni apabila ia mengandung asam amino makan akan berwarna ungu. Namun ada juga yang tanpa dipanaskan sudah menghasilkan warna ungu, misalnya MSG (Harrow, 2006).

2. Bagaimana reaksi yang terjadi antara sampel dengan reagen pada uji Biuret?

Dalam uji biuret ini, sampel harus dalam suasana basa agar polipeptida sampel dapat bereaksi dengan Cu2+ dari biuret. Uji ini sendiri didasarkan pada reaksi pembentukan kompleks Cu2+

yang dihasilkan oleh CuSO4, dengan gugus –CO dan –Na pada ikatan peptida dalam larutan bersuasana basa dan menghasilkan senyawa kompleks berwarna biru hingga ungu. Setelah direaksikan dengan sampel, warna yang terbentuk mudah pudar, hal ini dikarenakan ion Cu 2+

mengikat 2 ikatan peptida dan jika lama dibiarkan ikatan tersebut semakin lemah (tidak stabil) sehingga itu yang menyebabkan warnanya jika dibiarkan lama akan memudar (Fesendenn, 2007).

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil percobaan dapat diperoleh beberapa kesimpulan yaitu:

1. Tujuan dari percobaan ini yaitu praktikan dapat mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein serta mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode yaitu uji Ninhidrin dan uji Biuret.

2. Dalam percobaan uji kualitaif protein digunakan 2 metode yaitu uji Ninhidrin dan uji Biuret. Masing-masing dari metode tersebut menggunakan sampel yang sama yakni aspartam, susu skim, MSG, telur, dan gelatin dan keduanya juga sam-sam melalui tahap pemanasan agar diketahui perubahan warna yang tejadi.

Pada uji Ninhidrin yang termasuk sampel positif yaitu aspartam, susu skim, dan MSG karena mengalami perubahan warana menjadi ungu sehingga sampel tersebut diketahui mengandung kadar asam amino bebas. Sedangkan sampel telur dan gelatin tidak mengadung kadar asam amino bebas karena tidak membentuk senyawa kompleks warna ungu. Pada uji Biuret yang termasuk sampel positif yaitu telur dan susu skim karena membentuk senyawa kompleks ungu sehingga dipastikan mengadung protein. Sedangkan pada sampel aspartam, MSG, dan gelatin tidak mengalami perubahan warna ungu sehingga termasuk sampel negatif dan tidak mengandung protein.

3. Prinsip dari masing-masing metode yang digunakan dalam uji kualitaif protein yaitu :Uji Ninhidrin, menguji ada tidaknya protein dengan penambahan reagen Ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas bereaksi dengan Ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks unguUji Biuret, menguji ada tidaknya protein dengan penambahan NaOH dan CuSO4

berdasarkan ada tidaknya peptida. Dimana ion Cu2+ dari pereaksi biret dalam suasana basa akan bereaksi dengan ikatan peptida yang menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks ungu.