26

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1. Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Sintesis, dan Laboratorium

Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang.

4.2. Alat Penelitian

4.2.1. Pembuatan Serbuk Simplisia

1. Mesin penggiling (Blender)

2. Pengayak mesh 20 dan 40

3. Timbangan analitik balance Scout Pro 400 g

4. Oven BINDER

4.2.2. Proses Fraksinasi

1. Timbangan analytical balance Scout Pro 400 g

2. Timbangan analytical balance Mettler Toledo

3. Penyaring Buchner

4. Oven BINDER

5. Toples

6. Pipet tetes

7. Batang pengaduk

8. Sudip

9. Erlenmeyer

10. Beaker glass

11. Cawan Porselen

12. RotarybevaporatorbvacuumbBuchibR-215

27

4.2.3. Identifikasi Senyawa dengan KLT

1. Analytical balance

2. Chamber

3. Vial

4. Lempeng KLT (Silika gel TLC 60 F254)

5. Vortex

6. Pipa kapiler 5µL

7. Hot plate

8. Pinset

9. Sinar UV 254 nm dan 365 nm

4.2.4. Pengujian Difusi Cakram

1. Autoklaf

2. Inkubator

3. Laminar Air Flow

4. Hot plate

5. Vortex

6. Timbangan analitik

7. Microwave

8. Mikropipet

9. Tabung reaksi

10. Bunsen

11. Erlenmeyer

12. Beaker glass

13. Penjepit

14. Cawan petri

15. Kawat ose

16. Eppendorf

17. Yellow tip

18. Blue tip

19. Blank discs

20. Cotton swab

28

4.2.5. Identifikasi Jamur Candida albicans

1. Mikroskop cahaya

2. Bunsen

3. Kawat ose

4. Object glass, cover glass

4.3. Bahan Penelitian

4.3.1. Bahan Uji

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging buah

Limonia acidissima L. yang didapatkan dari daerah Kecamatan Rasanae Barat,

Kota Bima, NTB (Nusa Tenggara Barat) dan telah diidentifikasi oleh UPT. Balai

Materia Medika, Dinas Kesehatan, Jawa Timur. Mikroba uji yang digunakan

adalah Candida albicans yang diperoleh dari laboratorium biomedik

Universitas Muhammadiyah Malang.

4.3.2. Proses Fraksinasi

1. Pelarut N-heksan teknis

2. Serbuk daging buah Kinca

4.3.3. Identifikasi Senyawa dengan KLT

1. N-Heksana pro analisis

2. Etil asetat pro analisis

3. Etanol pro analisis

4. Asam sulfat 10%

5. Larutan KOH 10%

6. FeCl3 1%

7. Pereaksi Dragendorff

8. Pereaksi Anisaldehida-Asam sulfat

4.3.4. Pengujian Difusi Cakram

1. Fraksi N-heksan daging buah Limonia acidissima L.

2. Potato Dextrose Agar (PDA)

3. Aqudest steril

4. Nistatin

29

5. Jamur Candida albicans

6. DMSO 10%

4.3.5. Identifikasi Jamur Candida albicans

1. Hasil peremajaan jamur Candida albicans

2. Lactophenol cotton blue (LPCB)

4.4. Variabel Penelitian

4.4.1. Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah komponen senyawa kimia yang

terdapat pada fraksi N-heksan daging buah Limonia acidissima dengan

konsentrasi fraksi sebesar 30, 50, dan 100.

4.4.2. Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini yaitu dimeter zona hambat yang

dihasilkan oleh senyawa uji. Senyawa uji pada penelitian ini merupakan senyawa

yang terdapat dalam fraksi N-heksan daging buah Limonia acidissima yang dapat

menghambat pertumbuhan jamur Candida albicans yang ditandai dengan adanya

daerah bening disekitar senyawa uji yang ada pada media. Daerah bening tersebut

akan digunakan sebagai parameter untuk menentukan diameter zona hambat (mm)

senyawa dari fraksi n-heksan.

4.5. Persiapan Sterilisasi Alat dan Bahan

Semua alat yang akan digunakan untuk pengujian antijamur perlu disterilkan

terlebih dahulu, yaitu dengan cara sterilisasi kering dan sterilisasi basah. Alat dan

bahan yang akan disterilkan antara lain yaitu, tabung reaksi, beaker glass,

erlenmeyer, Potato Dextrose Agar (PDA), dan alat serta bahan lain.

4.5.1. Sterilisasi Kering

Sterilisasi kering meliputi cara sterilisasi dengan api langsung dan cara

sterilisasi dengan oven pemanas.

1. Sterilisasi dengan api langsung

Sterilisasi ini dilakukan terhadap peralatan seperti jarum ose dan

pinset.

30

2. Sterilisasi dengan oven pemanas

Oven pemanas digunakan untuk sterilisasi peralatan gelas yang tidak

berskala, seperti cawan petri, tabung reaksi dan pipet. Alat-alat yang

disterilkan dimasukkan ke dalam oven setelah mencapai suhu 160°C

selama 1-2 jam.

4.5.2. Sterilisasi Basah

Sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang

disterilkan dengan sterilisasi basah diantaranya gelas ukur, Erlenmeyer, pipet

tetes, dan media pertumbuhan Candida albicans (PDA). Proses sterilisasi ini

dilakukan pada suhu 121°C selama 15 – 20 menit.

4.6. Metode Penelitian

4.6.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui

aktivitas antijamur senyawa dalam fraksi N-heksan daging buah Limonia

acidissima terhadap Candida albicans yang ditunjukkan dengan zona hambat

serta mengetahui golongan senyawa yang terdapat pada fraksi N-heksan daging

buah Limonia acidissima secara in vitro dengan metode difusi cakram.

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yakni

kelompok uji yaitu fraksi N-heksan dan kelompok kontrol yaitu nistatin.

Penelitian ini melalui beberapa tahapan, yaitu:

1. Penyiapan simplisia

2. Penarikan komponen senyawa dengan metode fraksinasi bertingkat

3. Pemisahan komponen senyawa dengan metode KLT

4. Pengujian antijamur dengan metode difusi cakram

31

4.6.2. Kerangka Operasional

Gambar 4. 1 Skema kerangka operasional

Analisis Data

Sterilisasi alat dan bahan untuk

pengujian antijamur

Preparasi media dan jamur

Candida albicans

Pengujian antijamur dengan metode

difusi cakram

Penyiapan simplisia

Pembuatan fraksi N-

heksan

Identifikasi senyawa

dengan KLT

Kelompok Kontrol:

Kontrol positif (Nistatin)

Kontrol negatif (Aquades +

DMSO 10%)

Kelompok Uji:

Fraksi N-heksan daging buah

Limonia acidissima dengan

konsentrasi 250 ; 300 ;

350mg/mL

32

4.7. Prosedur Kerja

4.7.1. Preparasi Simplisia

Sampel yang diteliti adalah daging buah Limonia acidissima. Daging buah

dicuci dengan air hingga bersih dan dilakukan pengeringan pada suhu 40°C.

Setelah kering kemudian dihaluskan dengan mesin penggilingan, sehingga

diperoleh serbuk halus. Serbuk halus tersebut kemudian diayak menggunakan

Shieve Shaker dengan derajat kehalusan tertentu.

4.7.2. Proses Fraksinasi Bahan Uji

Pada proses fraksinasi yang dilakukan, digunakan tiga macam pelarut yaitu,

n-heksana, etil asetat, dan etanol. Dalam pembuatan ekstrak menggunakan serbuk

buah Limonia acidissima L menggunakan pelarut n-heksan yang direndam selama

24jam. Proses yang dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Serbuk halus daging buah Limonia acidissima yang ditambah dengan pelarut

N-Heksana sebanyak 13 L dimasukkan ke dalam sebuah bejana bermulut besar

2. Rendam selama 24 jam, kemudian saring dengan corong buchner dan

didapatkan filtrat 1 dan residu 1

3. Residu 1 dimaserasi kembali dengan N-heksan sebanyak 6500 mL

(perbandingan 1:5), direndam selama 24 jam. Kemudian saring dan didapat

filtrat 2 dan residu 2

4. Residu 2 dimaserasi kembali dengan N-heksan sebanyak 6500 mL

(perbandingan 1:5), direndam selama 24 jam. Kemudiaan saring dan didapat

filtrat 3 dan residu 3

5. Proses maserasi ini dilakukan dengan cara yang sama dan berulang sampai

filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan pelarut

N-heksan yang ditandai dengan tidak adanya noda pada plat KLT. Filtrat yang

ditotolkan masing-masing sebanyak 5 μl untuk melihat kepekatannya

6. Filtrat dikumpulkan lalu dipekatkan dengan rotary evaporator vacuum dengan

suhu 40⁰C sampai didapat larutan yang kental. Kemudian pindahkan larutan

kental tersebut ke dalam cawan porselen

7. Larutan kental yang didapat (fraksi) tersebut kemudian dikeringkan di oven

pada suhu 40⁰C, ditimbang hingga konstan, dan disimpan pada lemari

pendingin

33

Gambar 4.2 Bagan alur proses pembuatan fraksi N-heksan daging buah kinca

4.7.3. Pemisahan Senyawa dengan KLT

Fraksi N-heksan daging buah Limonia acidissima sebanyak 0,5 gram

dihidrolisis dengan 5 mL HCl 2N dan didihkan lalu tutup dengan corong berisi

kapas basah selama 50 menit. Setelah dingin, tambahkan ammonia (NH4OH)

sampai basa, kemudian ekstraksi dengan 4-5 mL N-Heksana sebanyak dua kali,

lalu uapkan sampai tersisa 0,5 mL, totolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL.

Kemudian eluasi dengan berbagai macam fase gerak. Eluen yang memiliki

kemampuan terbaik dalam memisahkan komponen senyawa, akan digunakan pada

pengujian aktivitas antijamur dengan metode difusi cakram.

Serbuk halus daging buah Limonia acidissima sebanyak 1300 g

Tambahkan N-heksan sebanyak 13000 mL, rendam selama 24 jam, saring dengan corong buchner, dan tampung filtrat

Residu 1 Dimaserasi kembali dengan etanol

sebanyak 6500 mL, direndam selama 24 jam, saring dan tampung filtrat

Residu 2

Filtrat 1

Dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 mL, direndam selama 24

jam, saring dan tampung filtrat

Residu 3 Proses ini dilakukan dengan cara yang

sama dan berulang sampai filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang

tertarik dengan pelarut

Filtrat 2

Filtrat 3

Pekatkan seluruh filtrat dengan rotary evaporator vacuum sampai diperoleh

larutan kental

Dikeringkan di oven pada suhu 40⁰C

34

a. Fase diam : Silika Gel TLC 60 F254

b. Optimasi fase gerak:

1. N-Heksana : Etil Asetat (8 : 2)

2. N-Heksana : Etil Asetat (6 : 4)

3. N-Heksana : Etil Asetat (4 : 6)

4.7.4. Identifikasi Komponen Senyawa

Terhadap komponen senyawa yang telah dipisahkan dengan metode KLT,

dilakukan identifikasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada fraksi N-

heksan dengan penampak noda sebagai berikut:

a. Alkaloid : Pereaksi dragendorff (noda yang dihasilkan berwarna jingga)

b. Terpenoid : Pereaksi anisaldehida-asam sulfat. Plat dipanaskan pada suhu

100°C selama 5-10 menit (noda yang dihasilkan berwarna ungu)

c. Flavonoid : Pereaksi uap amonia atau asam sulfat 10% (noda yang

dihasilkan berwarna kuning intensif)

d. Polifenol dan tanin : Pereaksi besi (III) klorida (FeCl3) 10% (noda yang

dihasilkan berwarna hitam)

e. Antrakuinon : Pereaksi larutan kalium hidroksida (KOH) 10% dalam etanol

(noda yang dihasilkan berwarna jingga atau merah)

4.7.5. Pembuatan Konsetrasi Larutan Uji

Pembuatan variasi konsentrasi larutan uji dibuat sebagai berikut:

a. Timbang fraksi N-heksanl daging buah Limonia acidissima sebanyak 250

mg, larutkan dalam 0,1 mL DMSO 10%, ditambahkan aquadest steril

sampai 1 mL, sehingga diperoleh larutan uji sebanyak 250mg/mL.

b. Timbang fraksi N-heksan daging buah Limonia acidissima sebanyak 300

mg, larutkan dalam 0,1 mL DMSO 10%, ditambahkan aquadest steril

sampai 1 m, sehingga diperoleh larutan uji sebanyak 300mg/mL.

c. Timbang fraksi n-heksan daging buah Limonia acidissima sebanyak 350

mg, larutkan dalam 0,1 mL DMSO 10%, ditambahkan aquadest steril

sampai 1 mL, sehingga diperoleh larutan uji sebanyak 350mg/Ml.

35

4.7.6. Preparasi Media

Dalam penelitian ini digunakan satu media yakni Potato Dextrose Agar

(PDA) dan dalam pembuatan suspensi mikroba menggunakan aquades steril

dengan meremajakan jamur sehari sebelum penggunaan.

Menurut Bridson, (2006), media Potato Dextrose Agar dibuat dengan cara

melarutkan sebanyak 39 g dalam 1 liter air suling. Didihkan campuran tersebut

sampai larut. Sterilkan dengan sterilisasi basah (autoklaf) pada suhu 121°C selama

15 menit. Aduk rata dan tuangkan ke dalam cawan Petri steril.

Akan tetapi pada penelitian kali ini, dibuat PDA dengan melarutkan

sebanyak 3,9 gram dalam 100 mililiter air kemudian mendidihkan hingga larut

dan kemudian disterilkan pada suhu 121°C selama 15 menit.

4.7.7. Identifikasi Jamur Candida albicans

Dari hasil biakan jamur Candida albicans yang dibuat untuk pengujian

aktivitas antijamur, dilakukan identifikasi dengan metode makroskopis dan

mikroskopis. Untuk uji makroskopis dilakukan dengan pengamatan secara visual

pada agar. Koloni Candida albicans berwarna putih kekuningan, timbul di atas

permukaan media, mempunyai permukaan yang halus dan licin kemudian dapat

agak keriput dengan bau ragi yang khas (Mutiawati, 2016).

Untuk uji mikroskopis dilakukan dengan pewarnaan dengan pewarna

lactophenol cotton blue (LPCB). Pewarnaan ini dilakukan dengan meneteskan

setetes alkohol 70% pada object glass. Kemudian sterilkan jarum inokulasi diatas

api bunsen, ambil biakan jamur dengan jarum inokulasi tersebut, dan letakkan

diatas object glass yang telah ditetesi alcohol 70%. Lalu tambahkan satu atau dua

tetes pewarna LPCB sebelum alkohol mongering, dan tutup dengan cover glass.

Lakukan pengamatan dengan mikroskop (Leck, 1999).

4.7.8. Preparasi Jamur

Pada proses peremajaan, jamur Candida albicans yang berasal dari biakan

murni diambil satu ose kemudian ditanamkan pada cawan petri yang berisi media

Potato Dextrose Agar. Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC

(WHO, 2009).

36

Dalam pembuatan suspensi jamur Candida albicans, jamur dari hasil

peremajaan diambil sebanyak 1 ose. Siapkan tabung reaksi yang berisikan ±4 mL

aquadest steril. Untuk mendapatkan tingkat kekeruhan jamur 1.5 × 108 CFU/mL

(sesuai standar McFarland 0,5), masukkan jamur yang telah diambil sebanyak 1

ose tersebut ke dalam tabung reaksi yang berisikan 4 mL aquadest steril

(Gholampour-Azizi, Samaneh, dan Fahimeh, 2015). Kemudian vortex suspensi

jamur tersebut hingga homogen. Setelah itu suspensi jamur dilihat kekeruhannya

dibandingkan dengan standar McFarland, dengan dilihat secara visual.

Sebelumnya, dibuat terlebih dahulu standar McFarland 0,5 dengan menggunakan

0,05 mL BaCl2 1% dan 9,95 mL H2SO4 1% (Sutton, 2011).

Tabel 4. 1 Standar kekeruhan McFarland (Sutton, 2011)

Skala McFarland CFU (108/mL) 1% BaCl2/ 1%H2SO4 (mL)

0,5 <300 0,05/9,95

Dari tabung reaksi yang berisi suspensi jamur, ambil larutan dengan cotton

swab steril, untuk menghilangkan kelebihan cairan pada cotton swab, putar

beberapa kali dan tekan dengan kuat ke dinding dalam tabung, kemudian

inokulum dioles keseluruh permukaan media sebanyak 3 kali dengan memutar

cawan dengan sudut 60° untuk setiap pengolesan. Lalu oleskan cotton bud steril

ke sekeliling pinggiran permukaan agar. Biarkan inokulum mengering selama

beberapa menit pada suhu ruang dengan cawan tertutup (WHO, 2009).

4.7.9. Pengujian Metode Difusi Cakram

Proses pengujian antijamur untuk metode difusi cakram, antara lain

sebagai berikut :

1. Siapkan vial yang telah berisi larutan uji dengan konsentrasi 250mg/ml,

300mg/ml, 350mg/ml.

2. Disiapkan preparasi bakteri dalam media cair dengan volume total kurang

dari 100 ml.

3. Jamur yang telah dipreparasi diambil dengan cara mencelupkan kapas lidi

steril satu kali, lalu diletakan pada tepi tabung reaksi, kemudian kapas lidi

37

steril diputar agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu banyak.

Setelah itu dioleskan pada PDA dan diratakan.

4. Media yang telah dioleskan jamur C albicans dibiarkan dulu 5 menit agar

mongering. Disk kertas saring dengan berdiameter 6 mm sebanyak 3 buah

yang telah ditetesi sampel uji dengan dipipet menggunakan pipet 70 dan

control positif (nistatin), dan diletakan pada media pembenihan dengan

jarak tiap cakram 24 mm dan dari tepi lempeng sebesar 15 mm. disk kertas

saring ditekan lembut dengan menggunakan pinset pada permukaan

lempeng agar. Jarak diatur sedemikian rupa sehingga satu disk dengan

disk lainnya berjauhan.

5. Kemudian media PDA diinkubasi pada suhu 37 selama 24 jam.

6. Dilakukan pengamatan setiap 24 jam dengan melihat adanya zona bening

disekitar disk kertas saring.

7. Zona hambatan diukur dengan penggaris dalam satuan millimeter (mm)

dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali

38

Gambar 4. 2 Bagan prosedur pengujian antijamur metode difusi cakram

Media potato dextrose agar diinkubasi pada suhu 37°C

selama 24 jam

Dilakukan replikasi tiga kali untuk tiap

ekstrak yang diuji

Analisis data

2

K- 1 3

K+

3 cm

2 cm

2 cm

2 cm

2 cm

1 (250) 2 (300) 3 (350) K - (Aquadest +

DMSO 1%)

K +

(Nistatin)

Sampel uji, kontrol positif,

dan kontrol negatif diteteskan

pada disk cakram

39

4.7.10. Analisis Data

Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan pengamatan

terhadap pengukuran diameter zona hambat dari daerah yang berwarna bening

pada masing-masing perlakuan baik kelompok kontrol maupun kelompok uji

fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L.