28

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Ekstraksi dan Fraksinasi

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel kulit buah

manggis. Sebelum maserasi dilakukan, kulit buah manggis dibersihkan dari

kotoran kemudian dirajang kecil-kecil. Sampel dibersihkan agar tidak

mengandung banyak senyawa-senyawa atau kotoran pengganggu. Proses

perajangan sampel dilakukan untuk memperluas permukaan sentuh sampel,

karena luas permukaan mempengaruhi proses maserasi. Semakin kecil ukuran

partikel sampel maka luas permukaan semakin besar. Rajangan sampel kulit buah

manggis diangin-anginkan sampai kering tanpa sinar matahari. Hal ini dilakukan

karena sinar matahari dapat merusak senyawa-senyawa aktif yang terkandung di

dalam sampel. Proses pengeringan berguna untuk mengurangi kadar air dalam

sampel, karena itu dapat mempengaruhi proses penarikan zat aktif dalam sampel.

Rajangan sampel kulit buah manggis diperkecil ukuran partikelnya

sehingga menjadi serbuk. Sampel kulit buah manggis sebanyak 500 gram

dimaserasi menggunakan pelarut metanol dalam suhu kamar terlindung dari

cahaya. Pelarut metanol digunakan dalam maserasi karena bersifat universal yang

dapat mengikat semua komponen kimia yang terdapat dalam tumbuhan bahan

alam baik yang bersifat non polar, semi polar, dan polar. Metanol adalah cairan

penyari yang masuk ke dalam sel melewati dinding serbuk kulit buah manggis.

Selama proses perendaman sampel, akan terjadi proses pemecahan dinding dan

membran sel akibat perbedaan tekanan di dalam dan di luar sel. Sehingga

metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik

dan senyawa akan terekstraksi sempurna (Lenny, 2006). Sehingga senyawa zat

aktif dapat terekstrak keluar bersama cairan penyari.

Maserasi dilakukan selama 3 kali 24 jam, dimana setiap 24 jam ekstrak

metanol disaring dan dimaserasi kembali dengan pelarut metanol yang baru.

Ekstrak metanol kulit buah manggis yang diperoleh, diuapkan dengan

menggunakan penguap putar vakum (rotary vacum evaporator) pada suhu 30-

29

40oC sampai terbentuk ekstrak kental metanol. Tujuan dari evaporasi yaitu untuk

menguapkan pelarut yaitu metanol, sehingga yang tersisa hanya senyawa aktif

atau ekstrak kental metanol. Ekstrak kental metanol yang dihasilkan dari maserasi

yaitu 35,59 gram berwarna merah kehitaman.

Ekstrak kental metanol sebanyak 10 gram disuspensi menggunakan air dan

metanol dengan perbandingan 2:1, dimana volume air 100 mL dan volume

metanol 50 mL. Hasil suspensi ini dipartisi menggunakan corong pisah dengan

pelarut n-heksan yang bersifat non polar dengan volume 100 mL. Sehingga

terbentuk dua lapisan, lapisan atas merupakan fraksi n-heksan yang berwarna

kuning dan lapisan bawah merupakan fraksi air yang berwarna kecoklatan. Hal ini

terjadi karena massa jenis n-heksan 0,4 gram/mL yang lebih kecil dari massa jenis

air yaitu 1 gram/mL. Pemisahan tersebut memberikan hasil yang tidak maksimal

karena masih terdapat sedikit fraksi n-heksan yang tecampur pada fraksi air.

Untuk mengoptimalkan pemisahan, maka dilakukan ekstraksi kembali dengan

menggunakan partisi. Partisi dilakukan sebanyak 4 kali, setiap partisi

ditambahkan n-heksan sebanyak 100 mL. Hal ini dilakukan agar zat yang bersifat

non polar benar-benar terdistribusi ke pelarut non polar (n-heksan). Partisi ini

menghasilkan fraksi n-heksan dan fraksi air.

Fraksi n-heksan dievaporasi pada suhu 30-40oC, suhu rendah digunakan

untuk menjaga agar senyawa aktif tidak mengalami kerusakan. Fraksi n-heksan

menghasilkan ekstrak kental sebanyak 0,50 gram. Fraksi air yang tersisa dipartisi

kembali dengan pelarut etil asetat yang bersifat semi polar dengan perbandingan 1

:2, dimana volume air 150 mL dan etilasetat 300 mL. Sehingga terbentuk dua

lapisan, lapisan atas merupakan fraksi etil asetat dan lapisan bawah merupakan

fraksi air. Fraksi etil asetat berada pada lapisan atas karena memiliki massa jenis

0,66 gram/mL yang lebih kecil massanya dari fraksi air yaitu 1 gram/mL. Partisi

dilakukan sebanyak tiga kali, setiap partisi ditambahkan etil asetat sebanyak 300

mL. Hal ini dilakukan agar senyawa aktif yang bersifat semi polar terdistribusi

kepelarut semi polar. Sehingga menghasilkan fraksi etil asetat dan fraksi air. Hasil

partisi dari masing-masing fraksi dievaporasi pada suhu 30-40oC sehingga

diperoleh ekstrak kental fraksi etil asetat sebanyak 2,58 gram dan ekstrak kental

30

fraksi air sebanyak 2,46 gram. Hasil rendemen dapat dilihat pada Tabel 4.1

berikut.

Tabel 4.1 Hasil Rendemen Fraksi n-heksan, Etilasetat dan Air Ekstrak

Metanol Kulit Buah Manggis.

Berat

ekstrak

metanol (g)

Fraksi Berat Wadah

Kosong (g) + fraksi (g)

Fraksi

kental (g)

Rendemen

%

10 gram

n-heksan

Etil Asetat

Air

12,67 g 13,17 g

10,00 g 12,58 g

9,86 g 12,32 g

0,50 g

2,58 g

2,46 g

5 %

25,8 %

24,6 %

Hasil rendemen urutan tingkatannya berturut-turut yaitu fraksi etilasetat,

fraksi air dan fraksi n-heksan. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang

terkandung pada ekstrak kental metanol lebih besar senyawa semi polar yaitu

dengan rendemen 25,8 %. Rendemen fraksi air juga cukup banyak yaitu 24,6 %

karena pada kulit buah manggis mengandung senyawa-senyawa polar seperti

flavonoid. Untuk fraksi n-heksan menghasilkan rendemen yang sangat sedikit

yaitu 5 %, kemungkinan besar senyawa non polar yang terkandung dalam kulit

buah manggis sangat sedikit.

4.2 Uji Fitokimia

Uji fitokimia bertujuan untuk mengidentifikasi kandungan senyawa

metabolit sekunder yang terdapat dalam sampel. Ekstrak kental metanol dan hasil

fraksinasi n-heksan, etilasetat dan air diuji fitokimia meliputi Uji flavonoid,

alkaloid, saponin, steroid dan terpenoid.

Berdasarkan uji fitokimia yang telah dilakukan, senyawa flavonoid

terdeteksi pada semua ekstrak yaitu ekstrak metanol, n-heksan, etilasetat dan air.

Pada uji alkaloid tidak terbentuk endapan pada semua ekstrak. Senyawa saponin

terdeteksi pada semua ekstrak kecuali ekstrak n-heksan. Senyawa steroid positif

pada semua ekstrak sedangkan terpenoid hanya terdeteksi pada ekstrak metanol,

fraksi etilasetat dan air.

Senyawa flavonoid positif ditandai dengan perubahan warna, alkaloid

positif jika terbentuk endapan ketika ditambahkan pereaksi alkaloid yaitu pereaksi

31

Hager, Wagner dan Mayer. Positif saponin ditandai dengan terbentuknya

busa/buih, terpenoid ditandai dengan perubahan warna menjadi merah, ungu,

hingga kecokelatan, steroid ditandai dengan perubahan warna dari hijau hingga

kebiruan.

Tabel 4.2 Hasil Uji Fitokimia Berbagai Fraksi

Fraksi Uji

Fitokimia

Pereaksi Perubahan dengan pereaksi Hasil

Uji

Ekstrak

Metanol

Flavonoid

Alkaloid

Saponin

Steroid

Terpenoid

Mg-HCl

H2SO4

NaOH

Mayer

Wagner

Hager

Aquades panas

Liebarman

Bauchar

Liebarman

Bauchar

Jingga-Orange tua

Jingga-merah bata

Jingga-merah bata

kehitaman

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Terbentuk busa

Warna hijau

Warna merah kecoklatan

+

+

+

-

-

-

+

+

+

n-Heksan

Flavonoid

Alkaloid

Saponin

Steroid

Terpenoid

Mg-HCl

H2SO4

NaOH

Mayer

Wagner

Hager

Aquades panas

Liebarman

Bauchar

Liebarman

Bauchar

Kuning muda-kuning keruh

Kuning muda-kuning tua

Kuning muda-orange tua

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak ada busa/buih

Warna hijau

Tidak terbentuk warna

merah kecoklatan

+

+

+

-

-

-

-

+

-

32

Tabel 4.3 Hasil Uji Fitokimia Berbagai Fraksi

Fraksi Uji

Fitokimia

Pereaksi Perubahan dengan pereaksi Hasil

Uji

Etilasetat

Flavonoid

Alkaloid

Saponin

Steroid

Terpenoid

Mg-HCl

H2SO4

NaOH

Mayer

Wagner

Hager

Aquades panas

Liebarman

Bauchar

Liebarman

Bauchar

Jingga-Orange tua

Jingga-merah bata

Jingga-coklat kehitaman

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Terbentuk busa

Warna hijau

Warna merah kecoklatan

+

+

+

-

-

-

+

+

+

Air

Flavonoid

Alkaloid

Saponin

Steroid

Terpenoid

Mg-HCl

H2SO4

NaOH

Mayer

Wagner

Hager

Aquades panas

Liebarman

Bauchar

Liebarman

Bauchar

Jingga-orange tua

Jingga-merah bata

Jingga-coklat kehijauan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Terbentuk busa/buih

Warna hijau

Warna merah kecoklatan

+

+

+

-

-

-

+

+

+

Berdasarkan hasil ini ekstrak metanol, fraksi n-Heksan, fraksi etilasetat

dan fraksi air mengandung senyawa-senyawa metabolit sekunder yaitu flavonoid,

alkaloid, saponin, steroid dan terpenoid.

1) Flavonoid

Ekstrak metanol, fraksi n-heksan, fraksi etilasetat dan fraksi air

memberikan hasil positif mengandung flavonoid, yang dibuktikan dengan

perubahan warna pada flavonoid dengan pereaksi Mg-HCl, NaOH, dan H2SO4.

33

Salah satu contoh senyawa flavonoid yang bereaksi dengan HCl akan terbentuk

garam flavilium yang ditandai dengan perubahan warna merah tua.

Gambar 4.1. Mekanisme reaksi pembentukan garam flavilium

(Achmad,1986 dalam Marliana dan Suyono, 2005)

2) Uji Alkaloid

Berdasarkan hasil uji fitokimia pada tabel 4.2 dan 4.3 ekstrak metanol,

fraksi n-heksan, fraksi etilasetat dan fraksi air memberikan hasil negatif pada

senyawa alkaloid. Hal ini terjadi kemungkinan dalam sampel tidak mengandung

senyawa alkaloid yang dibuktikan dengan tidak terbentuknya endapan pada

sampel. Berikut gambar struktur reaksi antara alkaloid dengan pereaksi apabila

terbentuk endapan.

Pereaksi Mayer

HgCl2 + 2KI HgI2 + 2KCl

HgI2 + 2KI K2 [HgI2]

Kaliumtetraiodomerkurat (II)

Gambar 4.2. Perkiraan reaksi uji Mayer (Achmad,1986 dalam Marliana

dan Suyono, 2005)

34

Pereaksi Wagner

Gambar 4.3. Perkiraan reaksi uji Wagner (Achmad,1986 dalam Marliana

dan Suyono, 2005)

3) Saponin

Saponin merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat sebagai sabun

serta dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan

menghemolisis sel darah. Saponin ada pada seluruh tanaman dengan konsentrasi

tinggi pada bagian-bagian tertentu, dan dipengaruhi oleh varietas tanaman dan

tahap pertumbuhan. Berikut struktur reaksi saponin dengan air. Untuk uji saponin

yang memberikan hasil positif yaitu ekstrak metanol, fraksi etilasetat dan fraksi

air sedangkan pada fraksi n-heksan memberikan hasil negatif. Terbentuknya

busa/buih dikarenakan senyawa saponin memiliki sifat fisik yang mudah larut

dalam air dan akan menimbulkan busa ketika dikocok (Suharto, 2010 dalam

Saman, 2013).

Gambar 4.4. Reaksi hidrolisis saponin dalam air (Marliana

dan Suyono, 2005)

4) Uji Steroid dan Terpenoid

Uji yang banyak digunakan untuk mengidentifikasi adanya triterpenoid

dan steroid adalah reaksi Lieberman-Bouchard (anhidrid asetat-H2SO4 pekat)

35

(Harborne, 1987). Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml dietil eter kemudian

ditambahkan dengan 10 tetes asam asetat anhidrid dan 3 tetes H2SO4 pekat.

Kebanyakan triterpenoid memberikan warna merah-violet sedangkan steroid

memberikan warna hijau-biru. Hasil uji fitokimia menunjukan bahwa hampir

semua ekstrak menunjukan adanya steroid dan triterpenoid namun, pada ekstrak

metanol, etil asetat dan air memberikan hasil yang kuat adanya triterpenoid dan

steroid, sedangkan untuk ekstrak n-heksan hanya memberikan hasil yang lemah

adanya triterpenoid dan steroid.

4.3 Pemisahan dan Pemurnian

Ekstrak kental metanol dari hasil uji fitokimia, dianalisis dengan

menggunakan kromatografi lapis tipis yang bertujuan untuk melihat ada berapa

senyawa yang terkandung di dalam sampel melalui bercak noda. Hal ini terjadi

karena sampel masih mengandung banyak senyawa yang sangat sulit untuk

dianalisis menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Sehingga dilakukan

pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Kolom agar terjadi pemisahan

yang sesuai dan dapat dianalisis menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT).

Pada pemisahan kromatografi kolom, pengisian fasa diam ke dalam kolom

dilakukan dengan cara basah. Fasa diam (silika gel) diubah menjadi bubur silika

(slurry) dengan yang digunakan dalam fasa gerak pelarut (n-heksan). Pelarut n-

heksan dimasukkan dalam kolom dengan batas tertentu dan slurry dialirkan

melalui dinding kolom secara perlahan menggunakan pipet tetes dengan kran

terbuka. Hal ini dilakukan agar silika dapat mengisi tempat dan padat secara

teratur, tidak mengalami pematahan dalam kolom. Pelarut n-heksan dialirkan

secara terus menerus minimal 3 jam dan maksimalnya semakin lama maka

silikanya semakin padat.

Ekstrak kental metanol sebanyak 3 gram dilarutkan dengan metanol dan

kemudian dicampurkan dengan fase diam silika gel GF60 sampai benar-benar

kering. Sampel dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom yang berisi fase diam

(silika gel), selanjutnya fasa gerak (n-heksan) dialirkan secara perlahan ke dalam

kolom dengan keadaan kran terbuka sampai terbentuk pita. Jika fasa gerak yang

36

menetes sudah tidak berwarna, maka divariasikan perbandingan eluen yang

sesuai.

Variasi eluen yang digunakan berturut-turut yaitu fasa gerak n-heksan:

etilasetat (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (5:5), (4:6), (3:7), (2:8), (1:9), perbandingan ini

digunakan juga pada variasi eluen selanjutnya etilasetat:metanol sampai terjadi

pemisahan dan eluet ditampung pada botol vial. Hasil pemisahan kromatografi

kolom diperoleh sebanyak 67 fraksi. Keseluruhan hasil fraksi dianalisis dengan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dan bercak nodanya dilihat dengan

menggunakan lampu UV. Pola noda dari 67 fraksi ini dapat dilihat pada Gambar

4.5 di bawah ini :

Gambar 4.5. Profil KLT hasil pemisahan kromatografi kolom

Semua fraksi hasil pemisahan dianalisis dengan kromatografi lapis tipis

untuk melihat pola noda yang sama dan harga Rf-nya yang sama digabung. Dari

67 fraksi diperoleh 5 fraksi. Hasil KLT penggabungan fraksi kromatografi kolom

dari ekstrak kental metanol kulit buah manggis dengan perbandingan eluen

etilasetat:metanol (8:2) diberikan pada Tabel 4.4 di bawah ini.

Tabel 4.4. Hasil KLT penggabungan fraksi dari kromatografi kolom

Fraksi Berat

(gr)

Warna Jumlah noda Rf

A1(1-17) 0,30 Kuning 1(bulat) 0,60

A2(18-34) 0,28 Kuning kecoklatan 1 (panjang) 0,63

A3(35-40) 0,33 Kuning 2 (bulat) 0,53;0,60

A4(44-46) 0,28 Kuning 1 (panjang) 0,60

A5(47-53) 0,30 Coklat kehitaman 1(panjang) 0,60

37

Fraksi A1, A2, A3, A4 dan A5 dilakukan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

dengan fasa gerak etilasetat:metanol (8:2) seperti pada Gambar 4.6 berikut ini:

Gambar 4.6. Profil KLT A1, A2,A3, A4 dan A5 fasa gerak etilasetat:metanol (8:2)

Hasil yang didapatkan dari fraksi A1 hasil kromatografi kolom

menghasilkan bercak noda tunggal. Isolat berupa senyawa yang berbentuk

padatan kristal jarum berwarna kuning yang diduga sebagai senyawa murni.

Gambar 4.7. Profil KLT isolat murni A1 fasa gerak etilasetat:metanol (8:2)

4.4 Uji Kemurnian

Isolat yang diduga murni yaitu isolat pada fraksi A1. Sebelum diuji

kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer IR, fraksi ini diuji

kemurniannya secara kromatografi lapis tipis dua dimensi dengan menggunakan

eluen bergradien yang cocok dengan beberapa perbandingan, yaitu n-

heksan:etilasetat (7:3) dan etilasetat:metanol (8:2) dengan nilai Rf yang diperoleh

dari masing-masing perbandingan adalah 0,66 dan 0,78. Hasil Kromatografi Lapis

Tipis (KLT) dua dimensi dapat dilihat pada gambar 4.8 di bawah ini.

38

(I) (II)

Gambar 4.8. Profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dua dimensi, fasa

diam silika gel GF254 ukuran plat 5x5 cm, fasa gerak n-

heksan:etilasetat (7:3) dan etilasetat:metanol (8:2)

4.5 Uji Fitokimia Isolat Murni

Isolat ini diuji flavonoid untuk mengetahui apakah senyawa yang

terkandung di dalamnya hanya flavonoid atau masih terdapat senyawa lain.

Tabel 4.5. Hasil Uji Fitokimia Isolat Murni

No Uji Fitokimia Pereaksi Fitokimia Perubahan dengan Pereaksi Hasil Uji

1 Flavonoid Mg-HCl

NaOH

H2SO4

Kuning bening-kuning keruh

Kuning bening-kuning orange

Kuning bening-orange

+

+

+

2

Alkaloid

Uji Mayer

Uji Wagner

Uji Hager

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

-

-

-

3 Steroid Liebarman Bauchar Tidak terbentuk warna hijau

kebiruan

-

4 Saponin Aquadest panas Tidak terbentuk buih/busa -

5 Terpenoid Liebarman Bauchar Tidak terbentuk warna merah

bata

-

4.6 Karakterisasi Isolat Murni

Karakterisasi isolat murni dilihat dari gugus fungsi melalui nilai panjang

gelombang dan absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer IR.

4.6.1 Spektrofotometri Inframerah (IR)

Spektrum inframerah senyawa isolat ditunjukan dalam gambar dan data

interpretasi spektrum inframerah (gelombang, bentuk pita, intensitas, dan

penempatan gugus terkait) disajikan dalam tabel.

39

Gambar 4.9. Spektrum inframerah dari isolat murni

Tabel 4.6. Interpretasi Spektrum Inframerah (Bilangan Gelombang,

Bentuk Pita, Intensitas dan Penempatan Gugus Fungsi) dari isolat.

Bilangan Gelombang(cm-1

)

Bentuk

Pita

Intensitas

Kemungkinan

Gugus Fungsi Isolat Sukadana

(2010)

Pustaka

Creswell,et

all,

Silverstein

Akbar

2010

Arisandy

2010

3342.97 3000-3500 3200-3400 3350-

3200

3500-

3000

Melebar Lemah Uluran O-H

2946.89

2834.86

2800-2950 2700-3000 - 3000-

2700

Tajam

Tajam

Lemah

Lemah

Uluran C-H

alifatik

1417.97

1449.48

1400-1650 1500-1475 - 1650-

1450

Tajam Lemah Uluran C=C

aromatik

1113.97 1000-1300 1330-1260 - - Tajam Lemah Tekuk OH

1023.81 990-1100 1000-1260 1260-

1000

1230-

1000

Tajam Kuat C-O alkohol

633.42 630-1000 630-1000 - 900-630 Tajam Lemah C-H aromatik

Pada spektroskopi inframerah bahwa serapan dikatakan kuat apabila

memiliki puncak yang tinggi transmitan rendah (0-35%), serapan dikatakan

sedang apabila puncaknya tinggi dan memiliki transmitan sedang (75-35%),

serapan dikatakan lemah apabila puncaknya pendek dan memiliki transmitan

tinggi (90-75%) (Gandjar,2012).

40

Berdasarkan nilai serapan spektrum inframerah, memperlihatkan bahwa

senyawa yang diperoleh menunjukkan serapan melebar dan lemah pada daerah

bilangan gelombang 3342.97cm-1

yang diduga adalah serapan uluran dari gugus

O-H. Serapan O-H dikatakan lemah karena berada pada transmitan 92% hal ini

didukung serapan lemah apabila berada pada transmitan 90-75% (Justik, 2010

dalam Saman, 2013). Hal ini diperkuat oleh adanya serapan tajam dan lemah

tekukan O-H aromatik pada panjang gelombang 1113.97cm-1

. Karena pada

serapan ini memiliki transmitan di atas 97%. Serapan uluran C-H alifatik yang

tajam dan lemah muncul pada daerah bilangan gelombang 2946.89cm-1

dan

2834.86cm-1

. Hal ini diperkuat oleh tekuk C-H aromatik pada serapan 633.42cm-1

.

Serapan tajam dan lemah pada cincin aromatik C=C muncul pada daerah bilangan

gelombang 1449.48cm-1

dan 1417.97cm-1

. Serapan tajam dan kuat uluran C-O

muncul pada daerah bilangan gelombang 1023.81cm-1

. Gugus-gugus fungsi yang

ditentukan dari hasil panjang gelombang IR hasil penelitian isolat murni

merupakan gugus-gugus fungsi yang terdapat pada senyawa flavonoid. Dengan

daerah spektra yang terbaca berkisar antara 3000-500 cm-1

dan termasuk dalam IR

tengah. Sehingga isolat murni yang didapatkan pada hasil penelitian dapat diduga

merupakan senyawa flavonoid.

4.7 Uji Aktivitas Antioksidan

Sampel yang diuji aktivitas antioksidan yaitu ekstrak kental metanol dan

fraksi hasil partisi yang dilakukan pada tindakan awal. Fraksi tersebut yaitu fraksi

n-heksan, fraksi etilasetat dan fraksi air. Uji aktivitas antioksidan pada keempat

sampel ini untuk melihat senyawa yang bersifat sebagai antioksidan berdasarkan

kepolarannya.

4.7.1 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan menggunakan metode DPPH

Pengujian aktivitas antioksidan dari berbagai fraksi menggunakan metode

DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Metode ini dipilih karena metode ini sangat

sederhana untuk mengukur aktivitas antioksidan dari senyawa bahan alam. DPPH

merupakan senyawa radikal bebas yang berwarna ungu gelap dengan serapan

maksimal pada panjang gelombang 517 nm. Reaksi antara antioksidan terhadap

senyawa radikal bebas (DPPH) ditandai dengan berubahnya warna DPPH dari

41

ungu gelap menjadi warna kuning. Peredaman tersebut dihasilkan oleh

bereaksinya molekul difenil pikrilhidrazil dengan atom hidrogen yang dilepaskan

oleh senyawa antiosidan sehingga terbentu senyawa difenil pikril hidrazil yang

stabil.

+ O2N

NO2

NO2

N

N

A + O2N

NO2

NO2

NH

N

AH

Antioksidan + (1,1-difenil-2-pikrihidrazil) → 1,1-difenil-2-pikrihidrazin + antioksidan

Gambar 4.10. Reaksi DPPH dengan antioksidan

Tahapan pertama yang dilakukan dalam pengujian aktivitas antioksidan

adalah pembuatan kurva standar dengan menggunakan antioksidan standar yaitu

vitamin C. Konsentrasi vitamin C secara berturut-turut adalah 25, 50, 100, 200,

400 ppm. Vitamin C sebanyak 2,5 ml direaksikan dengan 2,5 ml DPPH dan

diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Waktu maksimal untuk reaksi antara

senyawa antioksidan standar dengan senyawa radikal bebas adalah selama 30

menit (Miryanti, A. 2011). Hal ini ditandai dengan berubahnya warna ungu

menjadi agak kekuningan seperti terlihat pada Gambar 4.11 .

Gambar 4.11. Kurva standar setelah 30 menit.

Selanjutnya, diukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm

dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. Dibuat kurva standar

hubungan antara konsentrasi (x) dengan absorbansi (y) untuk mendapatkan nilai

ŷ= ax+b. Kurva standar terlihat pada Gambar 4.12.

42

Gambar 4.12. Kurva baku vitamin C (asam askorbat)

Selanjutnya, analisis aktivitas antioksidan pada sampel dilakukan dengan

menimbang 50-100 mg sampel dan diencerkan dengan menggunakan pelarut

metanol. Sampel yang telah divariasikan dicampur dengan larutan DPPH. Sampel

diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit dan diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 517 nm. Hasil analisis sampel dikonversi menjadi nilai AEAC

(Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity). Nilai AEAC digunakan untuk

membandingkan sampel dengan vitamin C. Nilai AEAC merupakan nilai

kapasitas atau antioksidan bahan dalam mereduksi radikal bebas DPPH yang

setara dengan kemampuan peredaman radikal bebas oleh asam askorbat atau

vitamin C (Kusuma dkk., 2012).

Ket. : nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom menunjukan

tidak berbeda nyata (Uji Duncan α=5%). *(Rata-rata ± SD).

Gambar 4.13. Nilai AEAC pada masing-masing ekstrak

y = 0,0014x - 0,0166

R² = 0,9979

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 100 200 300 400 500A

bso

rban

si

Konsentrasi (ppm)

0

10

20

30

40

Air n-heksan etil asetat metanol

84,44 ± 0,25b

5,11 ±

0,184a

384,52 ±

2,12d

196,12 ±

3,76c

Ak

tivit

as

an

tiok

sid

an

(mg A

EA

C/g

)

43

Dari data di atas dapat dilihat bahwa ekstrak etilasetat memiliki nilai

konversi yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak yang lain. Ekstrak etil

asetat memiliki nilai 384,52 ± 2,12d

mg AEAC/g. artinya adalah 1 gram ekstrak

kering etil asetat setara dengan 384,52 mg vitamin C. sedangkan ekstrak metanol,

ekstrak air dan ekstrak n-heksan memiliki nilai konversi yang lebih kecil

dibandingkan dengan ekstrak etilasetat. Hasil analisis statistik dengan

menggunakan anova satu jalur dilanjutkan dengan Uji Duncan pada taraf

kepercayaan α=5% didapatkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata aktivitas

antioksidan dari masing-masing ekstrak. Aktivitas antioksidan terbesar diberikan

oleh ekstrak etilasetat.

Diduga bahwa tingginya aktivitas antioksidan pada ekstrak etilasetat

dikarenakan senyawa fenolik yang terkandung di dalamnya. Hal ini dapat

dibuktikan dengan uji fitokimia bahwa pada ekstrak etil asetat positif mengandung

senyawa flavonoid. Beberapa penelitian melaporkan bahwa ekstrak etilasetat

memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar di bandingkan dengan ekstrak

yang lainnya. Salah satunya adalah ekstrak etilasetat pada rimpang jeringau

memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak

lainnnya.

4.7.2 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan IC50

Pengujian aktivitas antioksidan dilanjutkan dengan menggunakan

parameter IC50. Nilai IC50 merupakan bilangan yang menunjukan konsentrasi

ekstrak yang mampu menghambat aktivitas radikal sebesar 50% (Molyneux,

2003). Nilai IC50 dari berbagai fraksi dapat dilihat pada Gambar 4.14.

44

Gambar 4.14. Nilai IC50 pada masing-masing fraksi

Dari data diatas dapat dilihat bahwa aktivitas antioksidan terbesar

diberikan oleh ekstrak etilasetat yaitu sebesar 108,6 ppm. Nilai IC50 yang lebih

kecil memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar. Menurut Blois (2005) dalam

Ukieyanna (2012) suatu senyawa memiliki antioksidan sangat kuat apabila nilai

IC50 kurang dari 50 ppm, kuat apabila nilai IC50 antara 50-100 ppm, sedang

apabila nilai IC50 berkisar 100-150 ppm dan lemah apabila nilai IC50 berkisar 150-

250 ppm. Nilai IC50 yang dimiliki oleh ekstrak etilasetat, ekstrak air, ekstrak

metanol tergolong dalam aktivitas antioksidan sedang dan pada ekstrak n-heksan

tergolong lemah.

0

50

100

150

200

250

Air N-heksan Etil asetat Metanol

117,4

212,1

108,6 118,32

Nil

ai

IC5

0

Fraksi