III. METODOLOGI

3.1. ALAT DAN BAHAN

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain adalah peralatan gelas seperti erlenmeyer 250 ml, gelas piala, labu rotary evaporator, sudip, buchner , cawan porselen. Selain peralatan gelas, penelitian ini menggunakan peralatan lain yaitu shaker, timbangan analitik, pompa vakum, saringan vakum, , rotary evaporator, eppendorf, lempeng silika, oven, HPLC, tanur, desikator, kertas saring,.

Bahan-bahan yang digunakan yaitu simplisia daun, batang, akar sambiloto yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional B2P2TO & OT Tawang Mangu, etanol 95%, asam klorida encer P, kloroform P, metanol P, metanol pro-analisis, larutan pembanding (Andrographolid 0.1%).

3.2. METODE

3.2.1. Standarisasi Simplisia

3.2.1.1. Kadar Abu (AOAC, 1970)

Simplisia yang telah dihaluskan, ditimbang sebanyak 2 sampai 3 gram dan dimasukkan ke dalam krus platina atau krus silika yang telah dipijarkan dan ditara. Kemudian diarangkan dan dipijarkan perlahan hingga arang habis, dinginkan dalam desikator dan ditimbang. Jika dengan cara tersebut arang belum dapat dihilangkan, maka perlu ditambahkan air panas, dan disaring menggunakan kertas saring bebas abu. Kemudian dipijarkan sisa dan kertas saring tersebut dalam krus yang sama. Selanjutnya fitrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan, dan dipijarkan hingga bobot tetap, dan ditimbang. Kadar abu dihitung berdasarkan rumus berikut.

3.2.1.2. Kadar Sari Larut Etanol (Materia Medika, 1995)

Serbuk simplisia sebanyak 5 gram dimaserasi menggunakan 100 ml etanol 95% didalam labu bersumbat sambil dikocok berkali-kali selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Selanjutnya disaring cepat untuk menghindarkan penguapan etanol 95%. Filtrat sebanyak 20 ml diuapkan dalam cawan dangkal yang telah ditara hingga kering. Sisa penguapan dipanaskan didalam oven pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung berdasarkan rumus berikut.

Kadar Abu = Bobot Simplisia X 100%

Bobot Abu

Kadar Sari larut Etanol = Bobot Sari X 100 X 100%

Bobot Simplisia 2

13

 

3.2.1.3. Kadar Sari Larut Air (Materia Medika, 1995)

Serbuk simplisia sebanyak 5 gram dimaserasi menggunakan 100 ml air-chloroform P didalam labu bersumbat sambil dikocok berkali-kali selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Selanjutnya disaring cepat untuk menghindarkan penguapan etanol 95%. Filtrat sebanyak 20 ml diuapkan dalam cawan dangkal yang telah ditara hingga kering. Sisa penguapan dipanaskan didalam oven pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung berdasarkan rumus berikut.

3.2.2. Penentuan Washing Time (List PH dan Schmidt PC, 2000)

Simplisia ditimbang sebanyak 20 gram, dimaserasi menggunakan 200 ml etanol 95% di dalam erlenmeyer 250 ml dengan waktu 5, 10, 20, 40, sampai 120 menit sambil digoyang-goyang menggunakan shaker. Kemudian disaring menggunakan saringan yang dilengkapi dengan pompa vakum, diukur volume dan filtrat yang diperoleh di oven hingga bobot konstan dan kemudian hitung rendemen yang diperoleh. Motode ini merupakan modifikasi dari sumber yang telah ada.

3.2.3. Pembuatan Ekstrak

3.2.3.1. Maserasi (List PH dan Schmidt PC, 2000)

Simplisia sebanyak 10 gram dimaserasi menggunakan 100 ml etanol 95% di dalam Erlenmeyer 250 ml selama 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 jam sambil digoyang-goyangkan menggunakan shaker. Kemudian disaring menggunakan saringan yang dilengkapi dengan pompa vakum, filtrat yang diperoleh diukur volumenya dan selanjutnya di evaporasi menggunakan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

3.2.3.2. Remaserasi (List PH dan Schmidt PC, 2000)

Simplisia sebanyak 10 gram dimaserasi dengan 100 ml etanol 95% selama 2 jam sambil digoyang-goyangkan menggunakan shaker, selanjutnya disaring cepat dan filtrat yang diperoleh diukur volumenya, volume 1. Residu sisa penyaringan ditambahkan lagi 100 ml etanol 95% yang baru, dan di maserasi kembali selama 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 jam, kemudian disaring cepat dan filtrat yang diperoleh diukur volumenya yaitu volume 2. Filtrat 1 dan filtrat 2 digabungkan dan dievaporasi menggunakan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Metode ini merupakan modifikasi dari sumber yang ada.

Kadar Sari Larut Air = Bobot Sari X 100 X 100%

Bobot Simplisia 2

Rendemen = Bobot Ekstrak X 100% Bobot Simplisia

14

 

3.2.3.3. Perkolasi (List PH dan Schmidt PC, 2000)

Simplisia sebanyak 10 gram dimaserasi dengan 100 ml etanol 95% selama 2 jam sambil digoyang-goyangkan menggunakan shaker, selanjutnya disaring cepat mengunakan saringan berpompa vakum dan filtrat yang diperoleh diukur volumenya, volume 1. Residu sisa penyaringan dimasukkan kedalam kolom perkolator dan dialiri pelarut etanol 95% secara perlahan selama 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 jam. Pelarut yang melewati simplisia diukur volumenya yaitu volume 2, dan digabungkan dengan filtrat 1. Kemudian dievaporasi menggunakan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

3.2.3.4. Reperkolasi (List PH dan Schmidt PC, 2000)

Simplisia sebanyak 10 gram dimaserasi dengan 100 ml etanol 95% selama 2 jam sambil digoyang-goyangkan menggunakan shaker, selanjutnya disaring cepat mengunakan saringan berpompa vakum dan filtrat yang diperoleh diukur volumenya, volume 1. Residu sisa penyaringan dimasukkan kedalam kolom perkolator dan dialiri pelarut etanol 95% secara perlahan, pelarut yang telah melewati simplisia disirkulasi kembali ke atas dan dilewatkan kembali melalui simplisia selama 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 jam. Filtrat yang diperoleh diukur volumenya dan digabungkan dengan filtrat 1, kemudian dievaporasi menggunakan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Metode ini merupakan modifikasi dari sumber yang ada.

3.2.4. Analisis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Ekstrak sebanyak 10 mg diencerkan menjadi 1000 ppm dengan menambahkan 1 ml metanol. Dari hasil pengenceran tersebut diambil sebanyak 100 µl dan kemudian ditambahkan kembali 900 µl methanol. Kemudian dilarutkan dengan bantuan menggunakan sentrifuse. Setelah larut, dimasukkan ke dalam botol vial dan diinjekkan ke dalam KCKT.

Bahan analisis yang telah siap kemudian di analisis menggunakan KCKT dengan kondisi operasi sebagai berikut: Jenis kolom : Sunfire TM C18 Panjang kolom : 15 cm Diameter kolom : 4.6 mm Fase gerak : metanol: air Flow rate : 1ml/menit Pressure limit : 200kg/cm2

Volume sampel : 20 µl Panjang gelombang : 223 nm Detektor : DAD detector Pompa : K-1001

15

 

Perbandingan fase gerak yang digunakan disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Perbandingan Fase Gerak

Waktu (menit) Laju alir (ml/menit) Methanol (%) Air (%)

0 1 20 80

5 1 20 80

7 1 30 70

10 1 30 70

12 1 45 55

20 1 45 55

22 1 60 40

27 1 60 40

30 1 70 30

35 1 70 30

37 1 85 15

45 1 85 15

47 1 100 0

5 1 100 0