BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Wakturepository.ump.ac.id/5251/4/MUTIARA NURUL LITA...

23

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biologi

Lingkungan Program Studi Pendidikan Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu

Pendidikan Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Penelitian dilakukan pada

bulan Mei-Juni 2016.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian adalah timbangan analitik, labu

Erlenmeyer 100 ml, tabung reaksi, rak tabung, beaker glass, pipet ukur, spatula,

gelas ukur, jarum ose, jarum inokulen, cawan petri, pembakar bunsen, batang

pengaduk, batang Drugalsky, Laminar Air Flow (LAF), autoclave, pipet tetes,

magnetic stirrer, mikroskop, gelas objek, gelas penutup, pipet kapiler, hot plate,

filler pump, jangka sorong, incubator, label, kasa, kertas saring, kertas jerami,

kompor listrik, tip, pinset, vortex, spidol, penggaris, sprayer, nampan plastik, tissue,

kapas, korek api, kantong plastik 2 kg, wrapping, aluminium foil.

3.2.1 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanah

perkebunan tomat, aquades, alkohol, Medium Nutrient Agar (NA), Medium

Nutrient Broth (NB), medium uji Tripe Sugar Iron Agar (TSIA), medium uji

Protease Broth (MR-VP), medium uji Simmons’s Citrate Agar, medium uji Urea

23

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI….. MUTIARA NURUL LITA AZIZAH, FKIP UMP 2016

24

Broth, medium Motility Test Medium (SIM), insektisida Chlorpyrifos, fungisida

Mancozeb, alkohol 70%, spirtus, reagen methyl red, reagen α-naphtol, kristal violet,

kalium iodide, safranin, larutan kovac, reagen katalase (H2O2) 3%, reagen

melachite green, enthelen, dan minyak imersi.

3.3 Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian isolasi dan identifikasi bakteri dari

tanah pertanian tomat adalah metode survey. Metode tersebut bertujuan untuk

mengetahui adanya bakteri pada lahan pertanian tomat yang menggunakan

insektisida Chlorpyrifos (Dursban 250EC) dan fungisida Mancozeb (Dithane M-

24) dengan cara sederhana, yaitu mengambil tanah pada lahan tanaman tomat

sebanyak 5 titik secara acak. Isolasi sampel dan identifikasi dilakukan di

laboratorium mikrobiologi dan biologi lingkungan. Data diperoleh dalam bentuk

nama jenis isolat, tumbuh atau tidaknya isolat pada medium yang mengandung

pestisida, dan zona bening yang terbentuk pada kultur. Selanjutnya data yang

diperoleh dianalisis secara deskriptif dan kuantitatif.

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan Medium

3.4.1.1 Medium Nutrien Agar (NA)

Medium NA dibuat dengan cara menimbang 1,5 gram beef ekstrak, 2,5 gram

pepton, 1 gram yeast ekstrak, dan 7,5 gram agar. Medium dimasukan ke dalam labu

Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen

dan panaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi

sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat serta memasukan 12 ml untuk medium NA


25

cawan. Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 1210C, tekanan 1,5

atm selama 15 menit.

3.4.1.2 Medium Nutrien Broth (NB)

Medium NB dibuat dengan cara menimbang 1,5 gram beef ekstrak, 2,5 gram

pepton, dan 0,5 gram potassodium nitrat. Medium dimasukan ke dalam labu


dan panaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi

sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat. Medium disterilkan menggunakan

autoclave pada suhu 1210C, tekanan 1,5 atm selama 15 menit.

3.4.1.3 Medium Triple Sugar iron Agar (TSIA)

Medium TSIA dibuat dengan cara menimbang 5 gram polipepton , 5 gram

laktosa, 5 gram sukrosa, 0,5 gram glukosa, 2,5 gram NaCl, 0,1 feroamoniun sulfat,

0,1 gram Na-thiosulfat, 0,0125 gram fenol red, dan 6 gram agar. Medium

dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml.

Medium diaduk hingga homogen dan dipanaskan hingga mendidih. Medium

dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat.

Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 1210C, tekanan 2 atm

selama 15 menit.

3.4.1.4 Medium Uji Protease Broth (MR-VP)

Medium MR-VP dibuat dengan cara menimbang 3,5 gram polipepton, 2,5

gram glukosa, dan 2,5 gram KH2PO4. Medium dimasukan ke dalam labu



26

dan dipanaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi


autoclave pada suhu 1210C, tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.1.5 Medium Uji Simmon Sitrat

Medium Simmon Sitrat dibuat dengan cara menimbang 0,1 gram magnesium

sulphate, 0,1 gram ammonium dihydrogen phosphate, 0,4 gram sodium ammonium

phosphate, 1 gram sodium citrate, 2,5 gram sodium chloride, 0,04 gram

bromothymol blue dan 7,5 gram agar. Medium dimasukan ke dalam labu


dan dipanaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi


autoclave pada suhu 1210C, tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.1.6 Medium Uji Urea Broth

Medium Urea Broth dibuat dengan cara menimbang 0,5 gram pepton, 0,5

gram dextrose, 0,6 gram disodium phosphat, 0,4 gram pottasium dihydrogen

phosphate, 2,5 gram sodium chloride, dan 0,004 gram phenol red. Medium

dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml.

Medium diaduk hingga homogen dan dipanaskan tidak sampai mendidih. Medium



selama 15 menit.


27

3.4.1.7 Medium Uji Sulfide Indole Motility (SIM)

Medium SIM dibuat dengan cara menimbang 10 gram trypton, 0,1 gram

ferrous ammonium sulphate, 0,2 gram sodium thiosulphate, dan 1,75 gram agar.

Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500

ml. Medium diaduk hingga homogen dan dipanaskan hingga mendidih. Medium



selama 15 menit.

3.4.2 Isolasi dan Seleksi

3.4.2.1 Medium untuk Isolasi dan Seleksi

Medium isolasi dan seleksi yang digunakan adalah NA yang masing-masing

mengandung 10% insektisida Chlorpyrifos dan 10% fungisida Mancozeb. Hal

tersebut diartikan sebagai cara membuat medium dengan menimbang 10 gram

pestisida dilarutkan dalam 100 gram NA.

3.4.2.2 Pengambilan Sampel

Sampel tanah diperoleh dari tanah pertanian tomat di Desa Kutabawa,

Kecamatan Karangreja, Kabupaten Purbalingga. Pengambilan sampel tanah

dilakukan pada satu lahan pertanian tomat dengan luas 588 m2 yang menggunakan

insektisida Chlorpyrifos dan fungisida Mancozeb. Pengambilan sampel tanah

dilakukan secara acak pada 5 titik (pinggir dan tengah dalam). Sampel tanah

diambil dari bagian permukaan tanah sampai kedalaman sekitar 20 cm (Lumantouw

et al., 2013). Tanah diaduk-aduk supaya homogen, kemudian diambil sebanyak 5

sendok makan lalu segera dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer steril,


28

dimasukkan ke dalam es box, dan dibawa ke laboratorium. Semua pekerjaan

dilakukan secara aseptis.

3.4.2.3 Prosedur Isolasi, Pemurnian dan Seleksi Bakteri

Setiap sampel tanah dari titik pengambilan dilakukan isolasi mikrobanya.

Sampel tanah tersebut secepatnya dibawa ke laboraturium untuk dilakukan isolasi

dengan waktu tidak melebihi 3 jam (Mudryk et al., 2009). Sampel tanah yang

diambil ditapis melalui penyaring untuk memisahkan tanah dari batu-batu dan

materi tumbuhan. Langkah-langkah isolasi bakteri dari tanah pertanian tomat

adalah sebagai berikut.

a. Menyiapkan alat terlebih dahulu yaitu tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml

aquades steril, pipet ukur 1 ml, dan medium NA cawan.

b. Mengambil sampel tanah menggunakan spatula secara aseptis sebanyak 1

gram, lalu memasukkannya ke dalam labu Erlenmeyer yang berisi 9 ml

aquades steril (pengenceran 10-1).

c. Mengambil 1 ml suspensi dari pengenceran 10-1 menggunakan pipet ukur steril

dan memasukannya pada tabung reaksi 9 ml aquades steril (pengenceran 10-2).

d. Mengambil kembali 1 ml suspensi dari pengenceran 10-2 dan memasukannya

pada tabung reaksi 9 ml aquades steril (pengenceran 10-3).

e. Mengambil suspensi bakteri (sampel tanah) pada pengenceran 10-1, 10-2, dan

10-3 sebanyak 0,1 ml untuk ditumbuhkan pada medium NA cawan secara

spread plate menggunakan batang Drugalsky yang masing-masing

mengandung 10% insektisida dan 10% fungisida. Menginkubasi biakan selama

2x24 jam pada suhu 37oC.


29

f. Menumbuhkan masing-masing koloni yang terpisah dan menunjukkan yang

berbeda-beda ke dalam medium NA cawan dengan cara streak qadrant.

Menginkubasi biakkan selama 2x24 jam pada suhu 37oC.

g. Memindahkan kembali koloni-koloni yang terpisah pada masing-masing

biakkan tersebut pada medium NA cawan dengan cara goresan sinambung

(zig-zag). Menginkubasi biakkan selama 2x24 jam pada suhu 37oC.

h. Pekerjaan point g dilakukan berulang-ulang sehingga diperoleh biakan yang

seragam.

i. Menginokulasi koloni-koloni dengan karakteristik yang telah seragam (biakan

murni) ke medium NA miring yang diduga bakteri dengan cara streak lurus,

menginkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37oC. Setiap isolat ditumbuhkan

pada dua medium. Medium yang digunakan mengandung 10% insektisida dan

10 % fungisida. Isolat pada tabung pertama digunakan untuk kerja (working

culture) yang diperbaharui setiap 1 bulan sekali, isolat pada tabung kedua

disimpan sebagai stock culture yang diperbaharui setiap 6 bulan sekali.

3.4.3 Pengamatan Karakteristik Bakteri

3.4.3.1 Pengamatan Karakteristik Makroskopis Morfologi Koloni Bakteri

Isolat-isolat murni yang telah diperoleh dari hasil isolasi ditumbuhkan pada

medium NB lalu dilakukan pengenceran hingga 10-7 kemudian ditumbuhkan pada

medium NA secara spread plate sebanyak 0,1 ml dan di inkubasi selama 1x24 jam

pada suhu 37oC untuk memperoleh koloni-koloni tunggal. Setelah diinkubasi dapat

melakukan pengamatan secara makroskopis pada koloni bakteri.


30

Karakteristik makroskopis yang dapat diamati meliputi bentuk koloni yaitu

berbentuk titik, bulat, tidak teratur, seperti akar, dan berfilamen atau berbenang,

serta kumparan. Tepi koloni dapat berbentuk utuh, berombak, berbelah, bergerigi,

berbenang, dan keriting. Warna koloni terdiri dari keputihan, kekuningan,

kemerahan, cokelat, jingga, orange, pink, hijau, dan ungu. Elevasi koloni meliputi

rata, timbul datar, melengkung, dan cembung. Struktur koloninya halus mengkilat,

kasar, berkerut, atau kering seperti bubuk. Selain itu, ukurannya pun beragam dapat

dilakukan denga mengukur diameter dari koloni bakteri yang tumbuh (Irianto,

2012).

Motilitas dilakukan untuk mengetahui arah sebar pertumbuhan bakteri pada

suatu permukaan medium. Menanam biakan murni bakteri pada media SIM dengan

cara tusuk atau stab inoculation, kemudian menginkubasi pada suhu 370C selama

2x24 jam. Hasil positif (motil) menunjukkan jika bakteri tumbuh pada seluruh

permukaan media, hasil negatif (nonmotil) jika bakteri hanya tumbuh pada daerah

tusukan saja. Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas

tusukan. (Maryanto et al., 2014).

3.4.3.2 Pengamatan Karakteristik Mikroskopis Bakteri

Pengamatan karakteristik mikroskopis bakteri dapat diamati menggunakan

mikroskopik dengan perbesaran 100x10 yang dapat ditambahkan dengan minyak

imersi agar sel bakteri lebih jelas. Pengamatan secara mikroskopis ini dilakukan

dengan beberapa cara yaitu pewarnaan Gram dan pewarnaan endospora

(Cappuccino & Sherman, 1987).


31

1) Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengetahui bentuk sel dan sifat Gram

bakteri. Pewarnaan dilakukan dengan membuat apusan bakteri dari isolat murni

yang berumur 2x24 jam menggunakan jarum ose pada kaca objek, lalu di lewatkan

di atas api. Meneteskan kristal violet pada apusan dan mendiamkan selama 1 menit,

mencuci zat warna menggunakan aquades mengalir. Meneteskan kalium iodide,

mendiamkan selama 1 menit, dan mencuci dengan aquades mengalir. Meneteskan

safranin, mendiamkan selama 1 menit dan mencuci dengan aquades mengalir.

Mengeringkan dengan tissue dan mengamati preparat di bawah mikroskop. Ada

dua hal kemungkinan yang terjadi, yaitu pertama warna tambahan terhapus

sehingga yang tampak adalah zat warna asli (ungu), dalam hal ini bakteri disebut

bakteri Gram positif. Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat

warna asli tidak nampak, dalam hal ini bakteri disebut bakteri Gram negatif

(Cappuccino & Sherman, 1987).

2) Pewarnaan Endospora

Endospora adalah spora yang terbentuk di dalam dinding sel bakteri untuk

perlindungan dari kondisi lingkungan di sekitar bakteri yang tidak

menguntungkan. Pewarnaan endospora dilakukan dengan cara mengulaskan isolat

murni yang berumur 2x24 jam menggunakan jarum ose di atas kaca objek

kemudian menutupnya dengan kertas merang. Pewarna pertama yang diteteskan

adalah malachite green sambil diletakkan di atas penangas air dijaga jangan sampai

kering, apabila kering ditambahkan malachite green lagi. Memindahkan kaca

objek dari penangas air, membilasnya dengan aquades mengalir, lalu meneteskan


32

safranin dan mendiamkannya selama 30 detik. Mencuci apusan tersebut dengan

aquades mengalir, kemudian mengeringkan dengan tissue. Lalu preparat diberi

minyak imersi terlebih dahulu kemudian amati dibawah mikroskop dengan

menggunakan lensa objektif perbesaran 1000x. Endospora akan bewarna hijau

sedangkan bagian sel lainnya bewarna merah (Cappuccino & Sherman, 1987).

3.4.4 Uji Biokimia Bakteri

Uji biokimia yang dilakukan adalah uji indol, uji fermentasi karbohidrat, uji

methyl red, uji voges proskauer, uji penggunaan sitrat, uji katalase, uji urease, dan

uji H2S (Cappucinno & Sherman, 1987)

3.4.4.1 Uji Indol

Uji indol dilakukan dengan menyiapkan medium SIM agar tegak terlebih

dahulu. Menginokulasi medium dengan isolat bakteri menggunakan stab (tusuk ke

bawah) menginokulasi biakan pada suhu 370C selama 2X24 jam, kemudian

menambahkan larutan kovac dan mengocoknya parlahan-lahan sampai terlihat

cincin merah pada permukaan medium. Hasil uji indol positif dapat diamati dengan

adanya cincin merah pada permukaan medium. Pengujian indol dilakukan untuk

mengamati kemampuan bakteri dalam mendegradasi asam amino triptofan

sehingga menghasilkan indol.

3.4.4.2 Uji Fermentasi Karbohidrat

Uji fementasi karbohidrat dilakukan dengan menyiapkan 2 medium TSIA

miring terlebih terlebih dahulu, satu medium sebagai kontrol. Bakteri

diinokulasikan ke medium TSIA miring tersebut lalu diinkubasi pada suhu 370


33

selama 1x24 jam. Pengujian dilakukan dengan mengamati adanya perubahan warna

medium pada bagian permukaan dan bagian dasar medium. Bagian permukaan

medium disebut slant, sedangkan bagian dasar medium disebut butt. Perubahan

warna medium tersebut adalah sebagai berikut.

Slant dan butt tidak mengalami perubahan warna, menunjukan tidak terjadi

fermentasi karbohidrat.

Slant berwarna merah, sedangkan butt berwarna kuning dengan atau tanpa

produksi gas. Kondisi tersebut menunjukkan telah terjadi fermentasi glukosa.

Slant dan butt berwarna kuning dengan atau tanpa produksi gas. Kondisi

tersebut menunjukan telah terjadi fermentasi sukrosa dan laktosa.

Butt berwarna kehitaman menunjukan adanya produksi gas H2S.

3.4.4.3 Uji MR (methyl red)

Uji methyl red dilakukan dengan menyiapkan medium MR-VP terlebih

dahulu. Membuat satu tabung medium sebagai kontrol. Menginokulasi medium

dengan isolat bakteri yang akan diuji. Lalu menginkubasi biakan pada suhu 370C

selama 1x24 jam. Pengujian dilakukan dengan menuangkan 1/3 suspensi biakkan

ke dalam tabung reaksi yang lain, kemudian meneteskan reagen methyl red

sebanyak 1-2 tetes ke dalam biakkan. Hasil uji positif dapat diamati dengan adanya

cincin merah pada permukaan medium. Pengujian metil merah dilakukan untuk

mengamati kemampuan bakteri dalam mengoksidasi glukosa sehingga

menghasilakan asam.


34

3.4.4.4 Uji VP (voges proskauer)

Uji voges proskauer dilakukan dengan menggunakan 2/3 sisa biakkan pada

uji methyl red. Pengujian dilakukan dengan meneteskan reagen α-naphtol sebanyak

15 tetes dan 40% KOH sebanyak 10 tetes. Mengocok biakkan sehingga terjadi

aerasi sempurna pada suspensi biakkan selam 30 menit. Hasil uji positif dapat

diamati dengan adanya warna merah pada medium. Medium voges proskauer untuk

mendeteksi adanya bakteri penghasil asetil metil karbonil dari asam organik dalam

metabolisme glukosa.

3.4.4.5 Uji Penggunaan Sitrat

Penggunaan sitrat dilakukan dengan menyiapkan medium simmon sitrat

miring terlebih terlebih dahulu. Menginokulasi medium dengan isolat bakteri yang

akan di identifikasi. Menginkubasi pada suhu 370C selama 2-4x24 jam. Uji positif

positif ditandai dengan terbentuknya warna biru pada medium. Uji sitrat digunakan

untuk melihat kemampuan mikroorganisme sitrat sebagai satu-satunya sumber

karbon dan energy.

3.4.4.6 Uji Katalase

Pengujian katalase dilakukan untuk mengetahui bakteri yang dapat

menghasilkan enzim katalas. Uji katalase dilakukan dengan menyiapkan 2 medium

TSA miring terlebih terlebih dahulu, satu medium untuk uji satu medium sebagai

kontrol. Bakteri diinokulasikan ke medium TSA miring tersebut lalu diinkubasi

pada suhu 370C selama 1x24 jam. Setelah diinkubasi kemudian reagen H2O2 3%


35

diteteskan ke koloni. Hasil uji katalase positif jika gelembung-gelembung gas pada

koloni bakteri.

3.4.4.7 Uji Urease

Uji urease dilakukan dengan menyiapkan medium cair urea broth terlebih

dahulu. Menginokulasi medium dengan isolate bakteri yang akan diidentifikasi.

Lalu menginkubasi biakan pada suhu 370C selama 1X24 jam. Hasil uji positif dapat

diamati dengan adanya perubahan warna dari merah jingga menjadi merah ungu,

hal ini menunjukan terjadinya hidrolisis urea. Pengujian urease dilakukan untuk

mengetahui kemampuan bakteri dalam mendegradasi urea dengan enzim urease.

3.4.4.8 Uji Hydrogen Sulfida (H2S)

Uji hydrogen sulfide dilakukan dengan menyiapkan medium SIM agar tegak

terlebih dahulu. Menginokulasi medium dengan isolat bakteri menggunakan stab

(tusuk ke bawah) menginkubasi biakan pada suhu 370C selama 2X24 jam. Hasil

positif dapat diamati dengan adanya reaksi Fe menjadi FeS yang berwarna hitam

atau terjadi penghitam karena pembentukan metal sulfide (blocking). Pengujian

hydrogen sulfide (H2S) dilakukan untuk mengamati kemampuan bakteri dalam

mengubah asam amino alanine dan H2S.

3.5 Identifikasi

Identifikasi bakteri dilakukan menggunakan buku identifikasi bakteri dari

Holt, dkk (1994) dalam Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th.


36

3.6 Uji Tantang Bakteri pada Beberapa Konsentrasi Insektisida dan

Fungisida

Pada pengujian tersebut, semua medium NA ditambahkan konsentrasi

kandungan masing-masing insektisida Chlorpyrifos dan fungisida Mancozeb yang

berbeda-beda yaitu 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. Pertama-tama, kultur murni

diisolasi lalu ditanam pada medium NA cawan dengan konsentrasi pestisida yang

berbeda-beda. Penanaman isolat bakteri dilakukan dengan cara streak lurus dengan

panjang 5 cm kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2x24 jam. Selanjutnya

dilakukan uji tantang bakteri dengan cara mengamati ada tidaknya zona bening

pada kultur (Hatmanti, 2009). Hasil (+) menunjukkan adanya zona bening. Jika

terdapat zona bening maka menandakan bakteri tersebut diduga mampu

menguraikan dan menggunakan senyawa insektisida Chlorpyrifos atau fungisida

Mancozeb menjadi senyawa yang lebih sederhana dan mudah larut dalam air karena

sifat racun teruraikan, kemudian diukur menggunakan jangka sorong sedangkan

jika hasil (-) tidak terdapat zona bening maka diduga bakteri tidak dapat

menguraikan atau menggunakan pestisida tersebut. Kemudian mengamati tumbuh

tidaknya bakteri pada medium NA pestisida tersebutdengan konsentrasi pestisida

yang berbeda-beda. Jika bakteri tumbuh pada media tersebut maka bakteri tersebut

mampu bertahan hidup (toleran).

3.7 Analisis Data

Data yang diperoleh meliputi nama jenis bakteri, tumbuh tidaknya bakteri

terhadap medium pestisida yang dianalisis secara deskriptif kualitatif sedangkan

data dari perhitungan diameter zona bening dianalisis secara deskriptif kuantitatif


37

menggunakan One Way of Analisis of Varian (ANAVA) pada taraf kepercayaan

95% (Uyanto, 2006).


BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Wakturepository.ump.ac.id/5251/4/MUTIARA NURUL LITA...

Documents

Transcript of BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Wakturepository.ump.ac.id/5251/4/MUTIARA NURUL LITA...