BAB III Met as Nukleat

87
Kita telah menjumpai nukleotida berulang-kali selama explorasi kita dalam biokimia. Nukleotida bertindak sebagai pre kursor bagi asam nukleat, sebagai unsur-unsur yang sangat penting dalam metabolisme energi, sebagai pengangkut metabolit aktif untuk biosintesis (seperti gula nukleotida difosfat), sebagai pembentuk struktur koenzim, dan yang terakhir sebagai molekul penanda dan regulator metabolisme (terutama, siklis AMP). Dalam bab ini akan diuraikan jalur biosintesis dan degradasi nukleotida purin dan pirimidin, dan juga akan dipelajari regulasi dalam proses-proses itu – yang merupakan jalur penting ke arah replikasi DNA. Juga akan didiskusikan enzim-enzim yang berperan dalam biosintesis nukleotida sebagai target obat antimikroba dan anti kanker. Selain itu juga akan diuraikan hal-hal yang berkaitan dengan konsekuensi metabolisme akibat perubahan genetik tertentu pada metabolisme nukleotida. Sebelum memulai pembicaraan dalam bab ini, kita perlu berhati-hati tentang perbedaan pengertian antara nukleosida dan nukleotida. Pada hidrolisis sempurna, satu molekul nukleosida menghasilkan 1 molekul gula dan satu molekul basa heterosiklis, sedangkan hidrolisis satu molekul nukleotida akan menghasilkan 1 molekul gula, satu Semi QUE V-2004 38

Transcript of BAB III Met as Nukleat

Page 1: BAB III Met as Nukleat

Kita telah menjumpai nukleotida berulang-kali selama explorasi kita dalam biokimia.

Nukleotida bertindak sebagai pre kursor bagi asam nukleat, sebagai unsur-unsur yang

sangat penting dalam metabolisme energi, sebagai pengangkut metabolit aktif untuk

biosintesis (seperti gula nukleotida difosfat), sebagai pembentuk struktur koenzim,

dan yang terakhir sebagai molekul penanda dan regulator metabolisme (terutama,

siklis AMP). Dalam bab ini akan diuraikan jalur biosintesis dan degradasi nukleotida

purin dan pirimidin, dan juga akan dipelajari regulasi dalam proses-proses itu – yang

merupakan jalur penting ke arah replikasi DNA. Juga akan didiskusikan enzim-enzim

yang berperan dalam biosintesis nukleotida sebagai target obat antimikroba dan anti

kanker. Selain itu juga akan diuraikan hal-hal yang berkaitan dengan konsekuensi

metabolisme akibat perubahan genetik tertentu pada metabolisme nukleotida.

Sebelum memulai pembicaraan dalam bab ini, kita perlu berhati-hati tentang

perbedaan pengertian antara nukleosida dan nukleotida. Pada hidrolisis sempurna,

satu molekul nukleosida menghasilkan 1 molekul gula dan satu molekul basa

heterosiklis, sedangkan hidrolisis satu molekul nukleotida akan menghasilkan 1

molekul gula, satu basa heterosiklis, dan sedikitnya satu fosfat anorganik.

Mononukleotida terdiri dari hanya 1 molekul gula dan 1 molekul basa, tetapi

fosfatnya lebih dari satu. Jika memang terdiri lebih dari satu fosfat, misalnya tiga

fosfat, maka disebut dengan nukleotida trifosfat. Deoksiribonukleotida, yang

digunakan untuk sintesa DNA, terbentuk dari ribonukleotida (pembentuk RNA) pada

suatu jalur yang akan didiskusikan kemudian dalam bab ini.

A. Jalur Metabolisme Nukleotida

1. JALUR BIOSINTETIK : JALUR DE NOVO DAN SALVAGE

Berbeda dengan kelas-kelas metabolit lain yang telah ditemui, baik nukleotida,

basa dan nukleosida dari mana mereka terbentuk, tidak diperlukan untuk

memenuhi kebutuhan gizi, terkecuali pada beberapa parasit protozoa. Sebagian

besar organisme dapat mensintesis purin dan nukleotida pirimidin dari molekul

Semi QUE V-2004 38

Page 2: BAB III Met as Nukleat

kecil dalam jumlah yang dapat mencukupi kebutuhan mereka. Jalur De novo ini

memiliki kesamaan dalam seluruh dunia biologi (Gambar 3. 1).

Gambar 3.1 Metabolisme Nukleotida.

Akan tetapi sebagian besar organisme dapat juga melakukan sintesis nukleotida

dari nukleosida atau basa yang berasal dari makanan yang dikonsumsi atau

karena penguraian enzimatik asam nukleat. Proses ini disebut dengan jalur

salvage (penyelamatan), sebab pada proses itu melibatkan pemanfaatan kembali

campuran purin dan pirimidin yang akan hilang karena adanya biodegradasi, jika

tidak dimanfaatkan kembali. Seperti yang akan kita bahas berikut ini, jalur

salvage merupakan target penting dalam pengobatan penyakit mikrobial atau

penyakit yang disebabkan parasit, juga merupakan lokasi penting untuk

memanipulasi sistem biologi (misalnya dalam studi mutagenesis atau dalam

pembuatan antibodi monoklonal), dan juga merupakan proses-proses biologi

penting di mana perubahan genetik pada proses-proses itu akan menyebabkan

konsekwensi yang sangat luas dan parah.

Semi QUE V-2004 39

Page 3: BAB III Met as Nukleat

2. DEGRADASI ASAM NUKLEAT DAN PENTINGNYA PENYELAMATAN NUKLEOTIDA

Oleh karena penyelamatan, atau penggunaan kembali basa purin dan pirimidine,

melibatkan pelepasan molekul akibat degradasi asam nukleat, berikut dengan

singkat kita mulai membicarakan proses ini (Gambar 3.2). Degradasi dapat terjadi

secara intrasellular (akibat degradasi mRNA yang tidak stabil atau saat terjadi

perbaikan DNA), atau sebagai hasil dari kematian sel, atau, dalam hewan dan

manusia, melalui pencernaan asam nukleat yang ada dalam makanan.

Gambar 3.2 Reutilisasi (Penggunaan kembali) Purin & Pyrimidin.

Dalam hewan dan manusia hidrolisis ekstrasellular dari asam nukleat yang

dicernakan merupakan jalur utama terbentuknya basa dan nukleosida. Proses-

proses penguraian yang terjadi analog dengan yang terjadi pada pencernaan

protein. Proses-proses degradasi dimulai pada ikatan internal – dalam hal ini,

ikatan phosphodiester. Katalisis terjadi melalui endonuklease, seperti pada

Semi QUE V-2004 40

Page 4: BAB III Met as Nukleat

ribonuklease pankreas atau deoksiribonuklease, yang berfungsi untuk mencerna

asam nukleat didalam usus halus. Pemecahan endonucleolitik menghasilkan

oligonukleotida, yang kemudian dibelah secara exonukleolisis (pada ikatan

fosfodiester di ujung molekul) dengan enzim nonspesifik yang disebut dengan

phosphodiesterase. Produk yang dihasilkan adalah mononukleotida – nukleotida

5'- atau 3'- monofosfats, tergantung pada kekhususan dari enzim yang dilibatkan.

Nukleotida kemudian bisa dibelah secara hidrolisis, oleh suatu kelompok

phosphomonoesterases yang disebut dengan nukleotidase, untuk menghasilkan

orthofosfat dan nukleosida yang bersesuaian. Walaupun pada hasil nukleosida

terjadi penguraian secara hidrolisis, jalur penguraian basa yang paling umum

melibatkan aktivitas dari suatu nukleotida phosphorylase. Seperti glycogen

phosphorylase, enzim nukleotida phosphorylase membelah suatu ikatan

glycosidic dengan menambahkan unsur-unsur fosfat anorganik kedalamnya, untuk

menghasilkan basa yang sesuai ditambah dengan ribose-1- fosfat (atau

deoksiribose-1-fosfat jika substrate-nya adalah suatu deoksiribonukleotida):

Reaksi ini dapat balik, artinya suatu nukleotida phosphorylase dapat juga

mengkatalisasi tahap pertama dalam sintesa salvage nukleotida dari nukleosida

bebas. Manakala hal itu terjadi, produk nukleosida dapat di-fosforilasi oleh ATP

melalui aktivitas nukleotida kinase. Enzim seperti ini tidak bersifat universal,

artinya tidak aktif jika substratnya/nukleosidanya berbeda. Sebagai contoh, pada

sel binatang ditemukan baik guanosine kinase maupun suatu uridine

phosphorylase, walaupun enzim ini juga ditemukan dalam organisme lain.

Jika basa atau nukleotida tidak digunakan kembali untuk sintesa asam nukleat

melalui jalur salvage, basa-basa purin dan pirimidin akan terdegradasi lebih

lanjut, secara berturut-turut menjadi asam urat untuk purin dan β –

ureidopropionate untuk pirimidin, seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 3.2.

Semi QUE V-2004 41

Page 5: BAB III Met as Nukleat

3. PRPP: METABOLITE PUSAT DALAM DE NOVO DAN JALUR

SALVAGE

Sebuah alternatif jalur salvage, juga ditunjukkan pada Gambar 3.2, mensintesis

nukleotida 5'-fosfats secara langsung dari basa-basa tak terikat. Jalur ini

melibatkan suatu kelas enzim yang disebut dengan phosphoribosyltransferases

dan sebuah fosfat gula aktif, 5-phospho-α-D- ribosyl-1- pyrofosfat (PRPP). Zat

ini bertindak sebagai suatu intermediate dalam biosintesis histidine dan

tryptophan. PRPP adalah suatu kunci intermediate dalam sintesa de novo, baik

bagi nukleotida purin maupun pirimidin. PRPP dibentuk melalui aktivitas PRPP

synthetase, yang mengaktifkan carbon no 1 dari ribose-5-fosfat dengan

memindahkan bagian pyrofosfat dari ATP kedalamnya:

Aktivitas phosphoribosyltransferase mengkatalis perpindahan yang dapat balik

dari suatu basa bebas terhadap ribose PRPP, yang menghasilkan suatu nukleotida

monofosfat dan pyrofosfat. Karena analog, deoksiribose dari PRPP transferase

tidak terdapat dalam sebagian besar sel, enzim ini tidak dilibatkan secara

langsung dalam metabolisme deoksiribonukleotida.

Pada prinsipnya reaksi seperti di atas dapat mengambil bagian dalam penguraian

nukleotida. Namun, secara in vivo, pyrofosfat secara cepat dibelah oleh

pyrofosfatase untuk mendapatkan fosfat anorganik. Hal ini menunjukkan bahwa

phosphoribosyltransferase paling umum bekerja ke arah biosintesis

nukleotida.

Semi QUE V-2004 42

Page 6: BAB III Met as Nukleat

B. Biosintesis Nukleotida Purin secara De novo

1. STUDI AWAL ATAS SINTESA PURIN DE NOVO

Reaksi biosintesis purin nukleotida de novo dikenali pada sekitar tahun 1950-an,

di dalam laboratorium milik Yohanes Buchanan dan Robert Greenberg.

Penjelasan mengenai jalur ini dimulai dengan pembuktian bahwa burung-burung

mengeluarkan sebagian besar kelebihan senyawa nitrogen mereka dalam wujud

asam urat, yaitu suatu purin yang teroksidasi. Dengan demikian, peneliti bisa

mengidentifikasi prekursor berat-molekul rendah dengan menyuntikkan campuran

yang berlabel isotop ke merpati, mengkristalkan asam urat dari kotoran merpati,

lalu dengan degradasi kimia yang selektif, mereka menentukan posisi mana yang

telah terlabel oleh precursor-nya. Prosedur ini menghasilkan pola yang

ditunjukkan pada Gambar 3.3.

Gambar 3.3 Asal atom-atom penyusun basa purin.

Pada waktu itu, 10-formyltetrahydrofolate belum dikenal, tetapi campuran seperti

formate atau serine terlabel dalam hydroxymethyl karbon yang dalam asam urat

diberi label sebagai C-2 dan C-8.

Berikutnya, dua zat antibiotik yang berkaitan, azaserine dan 6-diazo-5-

oxonorleucine (DON), dikenali sebagai penghambat kuat bagi sintesa nukleotida

purin. Mengingat bahwa senyawa ini secara struktur analog dengan glutamin,

makahal itumenyarankan suatu pembuktian bahwa azaserine dan 6-diazo-5-

oxonorleucine merupakan penghambat tidak dapat balik dari suatu kelas enzim

yang disebut glutamine amidotransferase, yang mengkatalisis transfer ATP dari

amido nitrogen glutamine kepada suatu akseptor (penerima) tertentu. Tiga reaksi

di bawah ini terjadi pada sintesa nukleotida purin (dan satu dalam sintesa

nukleotida pirimidin) (Gambar )

Semi QUE V-2004 43

Page 7: BAB III Met as Nukleat

Di dalam eksperimen selanjutnya, suatu bakteri diberi perlakuan dengan obat

sulfonamida, misalnya sulfanilamid. Ternyata bakteri tersebut mengeluarkan

sejumlah besar campuran merah yang dikenal sebagai produk oksidasi 5-

aminoimidazole-4-carboxamide ribonukleotida (AICAR), yang menyerupai suatu

nukleotida purin yang tidak sempurna. Hal ini menunjukkan bahwa AICAR

adalah suatu intermediate biosintetik yang penggunaannya, entah bagaimana,

dihalangi oleh obat. Karena sulfonamide menghalangi sintesa koenzim folate,

maka akumulasi AICAR yang menunjukkan bahwa suatu coenzyme folate terlibat

dalam reaksi berikutnya. Selain itu, pengamatan ini juga menunjukkan bahwa

jalur langsung menuju tingkatan nukleotida, atau dengan kata lain, bahwa cincin

purin tersusun selagi mereka telah terkait dengan bagian ribose-5-fosfat.

2.SINTESA PURIN DARI PRPP KE ASAM INOSINAT

Gambar 3.4 meringkas jalur yang berasal dari PRPP, intermediate pertama, ke

arah purin nukleotida pertama yang terbentuk secara penuh, inosine 5'-monofosfat

(IMP), yang juga disebut asam inosinat.senyawa ini adalah 5'-ribonukleotida dari

purin berbasis hypoxanthine. Perhatikan bahwa ada dua reaksi glutamine

amidotransferase dalam proses ini, reaksi 1 dan 4. Mereka berbeda secara

mekanis karena pada PRPP amidotransferasi (reaksi 1) tidak memerlukan ATP

karena substrate telah diaktifkan oleh ATP dalam langkah yang sebelumnya.

Suatu pembalikan konfigurasi terjadi dalam reaksi 1, saat nitrogen amido

mengganti bagian pyrofosfat. Yang disebut terakhir merupakan kelompok sisa-

sisa sempurna, memberi suatu nukleotida sederhana (5-phosphoribosylamine),

yang membawa konfigurasi β pada karbon ke-1 gula, seperti halnya semua

nukleotida umumnya.

Semi QUE V-2004 44

Page 8: BAB III Met as Nukleat

Dalam reaksi 2, satu molekul glisina ditransfer, dengan bantuan ATP, ke nitrogen

phosphoribosylamine. Hal ini diikuti oleh suatu reaksi transformylasi, di mana

suatu kelompok formyl ditransfer dari 10-formyltetrahydrofolate kedalam cincin

purin yang sedang terbentuk. Seperti yang telah kita teliti, reaksi 4 dikatalisis oleh

suatu ATP-dependent amidotransferase. Reaksi 5 adalah suatu penutupan cincin

yang tergantung pada adanya ATP (ATP dependent), memberikan imidazole pada

cincin purin.

Reaksi 6 adalah suatu reaksi carboxylasi yang dapat balik. Penting untuk

disebutkan di sini bahwa reaksi ini tidak memerlukan biotin. Reaksi 7 dan 8

menghasilkan perpindahan nitrogen dari aspartate, dengan suatu mekanisme yang

serupa dengan pengkonversian citrulline menjadi arginine dalam siklus urea.

Pertama, semua molekul aspartate ditransfer ke kelompok carboxyl yaitu 4-

carboxy-5-aminoimidazole ribonucleotida (reaksi 7). Suatu reaksi eliminasi α,β-

yang mengikuti (reaksi 8), menghasilkan AICAR, intermediate yang ditunjukkan

untuk menghimpun bakteri yang diberi perlakuan obat sulfonamida, seperti

dijelaskan sebelumnya. Reaksi 9 adalah salah satu reaksi transformilasi lainnya,

dengan suatu kelompok carbon tunggal yang ditransfer dari 10-

formyltetrahydrofolate. Terakhir, suatu reaksi kondensasi internal (reaksi 10)

menghasilkan cincin purin pertama kali dalam senyawa asam inosinat.

Sel-sel hewan bertulang belakang dapat melakukan beberapa aktivitas diatas

karena adanya enzim multifungsional. Fakta ini menjadi jelas ketika gen dari

enzim ini yang telah diklon (diisolasi) lalu ditransfer ke dalam E. coli, dan gen

tunggal yang diklon (cloned) ditemukan untuk melengkapi (yaitu, untuk

menggantikan fungsi dari) dua atau tiga gen bakteri berbeda. Sebagai contoh,

cDNA klon tunggal mampu menopang pertumbuhan bakteri yang kehilangan 3

macam enzim (E2, E3, atau E5) yang diperlukan pada biosintesis purin. Analisa

berikutnya menunjukkan bahwa DNA yang diklon dari hewan bertulang belakang

itu menyandikan polypeptide tunggal (protein satu sub unit) yang mengkatalisasi

ketiga reaksi di atas. Pengamatan serupa menegaskan bahwa reaksi 6 dan 7

dikatalisasi oleh enzim tunggal bifungsional.

Kedua enzim transformylase, yang mengkatalisasi reaksi 3 dan 9, tidak berperan

sebagai enzim rantai tunggal bifungsional, tetapi sebagai kompleks multiprotein,

Semi QUE V-2004 45

Page 9: BAB III Met as Nukleat

dalam kaitannya dengan serine transhydroxymethylase dan suatu enzim

trifungsional, formylmethenyl – methylene – tetrahydrofolate synthetase (Gambar

3.

Gambar 3.4 Biosintesis de novo nukleotida purin, dari PRPP hingga asam

inosinat.

Semi QUE V-2004 46

Page 10: BAB III Met as Nukleat

Protein yang disebut belakangan menyelesaikan tiga aktivitas sintesa coenzyme

folate. Apakah aktifitas-aktifitas tersebut dilakukan dalam suatu enzim

multifungsional atau suatu multienzyme kompleks, masih belum jelas, tetapi

keuntungan yang didapat dari penyejajaran lokasi katalitis, telah sangat jelas,

yaitu melindungi coenzymes tetrahydrofolate yang labil, dan secara bersama-

sama mengatur aktivitas enzim sequential (yang berurutan), dan "channeling"

intermediate-intermediate yang konsentrasinya rendah (yaitu dengan

memudahkan perpindahan langsung dari satu lokasi katalitis menuju lokasi

katalitis berikutnya).

Kendali atas biosintesis asam inosinat diberikan melalui pengaturan umpan balik

(feedback inhibition) pada tahap-tahap awal dalam sintesa nucleotida purin. PRPP

Synthetase dihambat oleh berbagai nukleotida purin -- terutama sekali AMP, ADP

dan GDP – dan PRPP amidotransferase (reaksi 1 Gambar 3.4) dihambat secara

allosteris oleh AMP, ADP, GMP, dan GDP. Di E. coli, ekspresi gen yang

menyandikan enzim ini dikendalikan oleh suatu repressor protein, suatu produl

gen purR.. Protein ini mengikat baik hypoxanthine maupun guanine, kemudian

protein kompleks ini mengikatkannya ke suatu ujung DNA yang menyandikan

beberapa gen enzim-enzim yang diperlukan untuk sintesa purin (dan pirimidin),

dengan demikian transkripsi mereka dihambat.

Gambar 3.5 Reaksi transformilase dalam sintesa nukleotida purin.

Semi QUE V-2004 47

3 9

Page 11: BAB III Met as Nukleat

3.SINTESA ATP DAN GTP DARI ASAM INOSINAT

Asam inosinat mewakili suatu titik cabang dalam sintesa nukleotida purin.

Gambar 3.6 melukiskan konversi senyawa ini baik ke adenosine 5'-monofosfat

dan maupun ke guanosine 5'-monofosfat. Jalur ke guanine nukleotida; dimulai

dengan suatu NAD+ - dependent hydroxylasi (hidroksilasi yang memerlukan

NAD+) dari cincin purin, menghasilkan suatu nukleotida xanthosine monofosfat

(XMP); XMP berisi basa xanthine. Kemudian reaksi glutamine-dependent

amidotransferase mengikutinya, menghasilkan GMP. Jalur menuju AMP

melibatkan transfer nitrogen dari aspartate ke IMP, oleh suatu mekanisme yang

serupa dengan reaksi 7 dan 8 dalam sintesa de novo cincin purin. Pertama

terbentuknya sebuah intermediate succinylonukleotida, dan kemudian suatu reaksi

eliminasi α,β- menghasilkan AMP ditambah dengan fumarate. Sesungguhnya,

enzim yang sama mengkatalisasi kedua reaksi eliminasi. Perhatikan pada Gambar

3.6 bahwa energi yang menyebabkan reaksi perpindahan aspartat tidak datang

dari ATP tetapi dari GTP. Hal ini mungkin menunjukkan suatu cara untuk

mengendalikan proporsi IMP yang menuju ke sintesis nukleotida adenina dan

guanina. Akumulasi GTP akan cenderung untuk membuat suatu jalur ke arah

nukleotida adenina. Juga, karena konversi XMP ke GMP adalah bersifat ATP-

dependent, akumulasi ATP bisa menimbulkan terjadinya sintesa guanina

nukleotida.

Nukleotida aktif dalam metabolisme terutama berwujud nukleotida trifosfat. GMP

dan AMP dikonversi ke bentuk trifosfatnya yang sesuai melalui dua reaksi

phosphorylasi yang terjadi berurutan. Konversi terhadap difosfat melibatkan suatu

kinase kkhusus yang bersifat ATP-dependent.

GMP + ATP Guanylate kinaseGDP + ADP

AMP + ATP Adenylate kinase2ADP

Fosforilasi ADP ke ATP terjadi melalui metabolisme energi – oxidative

fosforilasi atau substrate - level substrate fosforilasi atau (dalam tumbuhan)

Semi QUE V-2004 48

Page 12: BAB III Met as Nukleat

fotofosforilasi. ATP dapat juga dibentuk dari ADP melalui aktivitas adenylate

kinase, tetapi dengan arah yang berlawanan dari arah yang ditunjukkan di atas.

Pada sebagian besar organisme, biosintesis deoksiribonucleotida digunakan untuk

sintesa DNA dan dimulai pada tingkatan ribonukleotida difosfat, dengan reduksi

bagian ribose menjadi 2' deoksiribose. Proses ini akan dibicarakan secara rinci

kemudian. Dalam metabolisme purin, fosforilasi oleh kinase nukleotida difosfat

menghasilkan deoksiribonukleotida trifosfat; dATP dan dGTP.

Mari kita dengan singkat meringkas poin-poin regulasi umpan balik (feedback)

dalam biosintesis purin de novo. Kita telah menguraikan kendali sintesa IMP,

terutama melalui regulasi umpan balik dari PRPP amidotransferase. Di luar titik

tersebut, GMP mengendalikan sendiri biosintesis dengan menghambat konversi

IMP menjadi XMP, dan AMP mengendalikan pembentukannya sendiri dengan

menghambat sintesa adenylosuksinat. Kendali tambahan digunakan pada

tingkatan biosintesis deoksiribonukleotida, seperti yang akan kita diskusikan

kemudian.

Semi QUE V-2004 49

Page 13: BAB III Met as Nukleat

Gambar 3.6 Jalur-Jalur dari asam inosinat menuju GMP dan AMP.

4. PEMANFAATAN NUKLEOTIDA ADENINE DI (DALAM) COENZYME BIOSYNTHESIS

Suatu peran penting purin nukleotida berkenaan dengan metabolisme terjadi

dalam sintesa coenzymes, terutama yang mengandung bagian adenylate. Hal ini

meliputi nukleotida flavin, nicotinamide nukleotida, dan coenzyme A.

C. Degradasi Purin dan Kekacauan Klinis dari Metabolisme Purin

1.PEMBENTUKAN ASAM URAT

Katabolisme nukleotida purin menghasilkan asam urat, dengan jalur yang

ditunjukkan dalam Gambar 3.7. Jalur-jalur spesifik berbeda-beda tergantung pada

jenis organisme dan jenis jaringan dalam organisme tersebut. Sebagai contoh,

AMP mengalami deaminasi untuk menghasilkan asam inosinat (IMP) atau

mengalami hydrolisis untuk menghasilkan adenosine. Deaminasi terutama sekali

aktif terjadi didalam otot, sedangkan hidrolisis mendominasi didalam hampir

semua jaringan-jaringan binatang.

Di dalam jalur-jalur degradasi, adenosine mengalami deaminasi oleh adenosine

deaminase (ADA) untuk menghasilkan inosine. Baik inosine dan guanosine dapat

terbentuk melalui hidrolisis dari nukleotida monofosfat, yang dilakukan oleh

enzim purin nukleotida phosphorylase (PNP) untuk menghasilkan hypoxanthina

dan guanina, secara berturut-turut. Guinina mengalami deaminasi menjadi

xanthine oleh guanine deaminase, suatu enzim sangat banyak jumlahnya dalam

hati dan otak mammalia. Hypoxanthine mengalami oksidasi dan kemudian

menjadi xanthine, dan xanthine menjadi asam urat, oleh oxidase xanthine. Enzim

ini, yang mengoxidasi beberapa campuran nitrogen heterosiklis lain, terdiri dari

FAD terikat pada molibdenum, dan besi nonheme. Elektron yang diperoleh dari

oksidasi substrate-substrate diteruskan ke masing-masing pembawa, yang

akhirnya mengurangi oksigen menjadi H202, yang dilakukan oleh katalase.

Semi QUE V-2004 50

Page 14: BAB III Met as Nukleat

Gambar 3.7 Katabolisme nukleotida purin dalam menghasilkan asam urat.

Katabolisme purin dalam primata berakhir pada asam urat, yang dikeluarkan

lewat pencernaan. Namun, sebagian besar binatang mengoksidasi cincin purin

lebih lanjut, menjadi allantoin dan kemudian menjadi asam allantoat, yang juga

dikeluarkan (pada beberapa ikan) atau dikatabolisme lebih lanjut menjadi urea

(pada sebagian besar ikan, beberapa kerang-kerangan, dan binatang ampibi) atau

menjadi amonia (dalam beberapa hewan laut tak bertulang belakang). Gambar 3.8

menunjukkan jalur dari asam urat sampai menjadi C02.

2.AKUMULASI ASAM URAT BERLEBIHAN: GOUT [REMATIK]

Asam urat dan garam urat cukup sulit dilarutkan. Sifat ini menguntungkan bagi

binatang yang bertelur (egg-laying), karena menyediakan suatu jalur disposisi

kelebihan nitrogen dalam suatu lingkungan tertutup: secara sederhana, materi sisa

ini akan mengendap di tempat asalnya.

Namun, ketidak-larutan urat ini dapat memunculkan berbagai kesulitan didalam

metabolisme mammalia. Pada manusia, sekitar 3 di antara 1000 individu

menderita penyakit hyperuricemia – ketinggian kronis asam urat darah di luar

batas normal. Walaupun pertimbangan biokimia untuk terjadinya hyperuricemia

sangat beragam, kondisi ini disebut dengan nama klinis tunggal yaitu rematik.

Akut dan berkepanjangannya kadar asam urat dalam darah menyebabkan

pengendapannya, sebagai kristal sodium urate (Na-Urat) di dalam cairan

persendian synovial. Pengendapan ini menyebabkan radang, penyebab radang

sendi (arthritis) yang menyakitkan, yang jika tidak segera diobati, akan

Semi QUE V-2004 51

Page 15: BAB III Met as Nukleat

menyebabkan kerusakan persendian yang parah. Makanan dan minuman yang

mengandung banyak purin cenderung merangsang serangan rematik akut terhadap

individu yang peka. Karena makanan seperti itu, termasuk materi "kaya gizi"

seperti hati, daging, kelenjar perut anak sapi, sejenis ikan hering kecil, dan

anggur.

.

Rematik secara historis dihubungkan dengan suatu gaya

hidup yang serba berlebihan

Rematik disebabkan oleh produksi purin nukleotida yang

berlebihan, atau dari sintesa asam urat yang juga berlebihan,

atau dari cacat ekskresi asam urat melalui ginjal. Beberapa

cacat enzimatik tertentu dapat menyebabkan terjadinya

sintesa purin yang berlebihan, seperti yang ditunjukkan

dalam Gambar 3.9. Salah satu bentuk rematik ditandai oleh

tingginya aktivitas PRPP synthetase (defect 1), yang dapat

diakibatkan oleh ketidakpekaan terhadap hambatan umpan

balik oleh purin nukleotida. Karena aktivitas PRPP

amidotransferase mungkin sebagian dikendalikan oleh

konsentrasi substrate, suatu peningkatan – posisi stabil

cadangan PRPP meningkatkan fluks melalui reaksi

Semi QUE V-2004 52

Gambar 3.8 Jalur degradasi asam

urat sampai menjadi C02.

Gambar 3.9 Cacat enzimatik dalam tiga macam rematik fberlebihan

Page 16: BAB III Met as Nukleat

amidotransferase, yang merupakan suatu titik kendali utama

didalam biosintesis purin de novo (lihat Gambar 3.4).

Rematik dapat juga diakibatkan oleh mutasi didalam PRPP amidotransferase yang

membuatnya kurang sensitif terhadap hambatan umpan balik oleh purin

nukleotida (defect 2 dalam Gambar 3.9). Hilangnya kendali ini juga

meningkatkan fluks melalui langkah utama yang telah diatur sebelumnya. Bentuk

rematik lainnya diakibatkan oleh kekurangan enzim salvage hypoxanthine-

guanine phosphonribosyltransferaste (HGPRT) (defect 3). Hal ini merupakan

salah satu jenis phosphoribosyltransferases dalam metabolisme purin binatang;

sedangkan yang lain bersifat spesifik untuk adenine.

Kita masih belum mengetahui secara persis mengapa suatu kekurangan HGPRT

dapat meningkatkan tingkat sintesa purin nukleotida. Penjelasan yang masuk akal

adalah bahwa aktifitas HGPRT, pada saat aktif, akan mengkonsumsi PRPP.

Penurunan fluks melalui reaksi ini, pada saat enzim tak mencukupi, bisa

menaikkan tingkat posisi stabil PRPP, dengan demikian menyebabkan

peningkatan aktivitas intracellular PRPP amidotransferase melalui aktivitas massa

(mass action) karena bertambahnya substrat.

Seperti yang disebutkan lebih awal, rematik juga diakibatkan oleh ekskresi asam

urat yang rusak. Pasien yang memiliki beberapa bentuk penyakit simpanan

glycogen memiliki kecenderungan rematik. Yang jelas, hypoglykemia (kadar gula

darah yang rendah) yang berlarut-larut menyebabkan akumulasi asam organik

(laktat dan semacamnya), dan akumulasi ini mempengaruhi sekresi tubular asam

urat dalam ginjal. Di samping itu Rematik bisa jugamerupakan suatu konsekwensi

dari kemoterapi terhadap kanker, sebagai hasil dari jumlah Purin yang banyak

sekali hasil degradasi asam nukleat dari sel-sel tumor yang mati karena

kemoterapi.

Banyak kasus rematik yang dengan sukses diobati menggunakan antimetabolite

allopurinol, sebuah analog struktural (strukturnya mirip) hypoxanthine

sehingga mampu menghalangi oxidasi xanthine. Hambatan ini menyebabkan

akumulasi hypoxanthine dan xanthine, yang kedua-duanya menjadi lebih mudah

larut, dan karenanya, akan lebih siap di ekskresi dibanding dengan asam urat.

Semi QUE V-2004 53

Page 17: BAB III Met as Nukleat

3.KONSEKUENSI DRAMATIS DARI SUATU DEFISIENSI PARAH

HGPRT:

a. Sindrom Lesch-Nyhan

Analisa seksama terhadap pasien yang menderita rematik sederhana sebagai

akibat defisiensi HGPRT menunjukkan tingkat residual yang rendah namun

penting terhadap enzim yang dipengaruhinya. Jelaslah bahwa mutasi melibatkan

perubahan aktivitas katalitis dari enzim tetapi tidak menghapus sepenuhnya.

Konsekuensi yang lebih serius diakibatkan oleh "null mutations," yang

menyebabkan enzim tidak ada sama-sekali dalam sel itu. Kondisi ini untuk

pertama kalinya dijelaskan pada tahun 1964 oleh mahasiswa kedokteran Michael

Lesch dan penasihat fakultasnya, William Nyhan. Sindrom Lesch-Nyhan adalah

suatu ciri sex-linked (berhubungan dengan jenis kelamin), karena gen struktural

untuk HGPRT terletak pada chromosome X. Pasien dengan kondisi seperti ini

menunjukkan suatu kecenderungan radang sendi yang parah, tetapi mereka juga

mempunyai suatu malfungsi dalam sistem syaraf, ditunjukkan dalam kerusakan

tingkah laku, kesulitan belajar, dan perilaku agresif atau bermusuhan, sering kali

bersifat self-directed (terhadap dirinya sendiri). Di dalam kasus yang paling

ekstrim, para pasien menggigit ujung jarinya atau, jika dicegah, mereka akan

menggigiti bibir mereka, yang dapat menyebabkan mutilasi-diri yang parah.

Pandangan biokimia tentang pola tingkah laku yang aneh ini masih belum

diketahui, tetapi kasus ini, sungguhpun jarang, telah menjadi sebuah daya tarik

karena semua penyimpangan disebabkan terutama karena kekurangan suatu

enzim tunggal yang mempengaruhi konsentrasi HGPRT. Sampai sekarang ini,

belum ada perawatan yang berhasil, dan individu penderita radang sendi parah,

jarang sekali dapat hidup sampai melebihi usia 20 tahun. Namun, kondisi ini

dapat didiagnosa pada saat belum terjadinya kelahiran (prenatal) melalui

amniocentesis, karena sel dari janin Lesch-Nyhan tidaklah mampu meng-

inkorporasi radiolabeled hypoxanthine ke dalam asam nukleat.

b. Konsekwensi Tak Terduga Dari Kerusakan Catabolisme Purin:

Immunodeficiency [Penurunan Kekebalan]

Semi QUE V-2004 54

Page 18: BAB III Met as Nukleat

Suatu gambaran metabolisme purin manusia yang mengejutkan tampak pada

tahun 1972, melalui studi atas suatu kondisi turun temurun yang disebut dengan

sindrom immunodeficiency akut gabungan. Pasien dengan kondisi seperti ini

akan menjadi peka, dan secara fatal akan mudah terserang penyakit yang mudah

menular. Hal ini disebabkan oleh karena suatu ketidak-mampuan total untuk

mengadakan suatu respon kekebalan terhadap rangsangan antigen. Dalam kondisi

seperti ini, baik limfosit B dan T (sel-sel darah putih) telah terpengaruh/ cacat

dalam mensintesis antibodi. Dalam banyak kasus seperti ini, immunodeficiency

disebabkan karena tidak adanya enzim degradative: adenosine deaminase (ADA)

yang terjadi secara turun temurun.

Apa yang mendasari hubungan yang tak terduga ini?

Pertama, adenosine deaminase selalu aktif mendegradasi deoksiadenosine hasil

degradasi DNA. Kedua, sel darah putih mempunyai enzim salvage yang

melimpah, mencakup nukleotida; jadi, adenosine dan deoksiadenosine yang

berkumpul siap dikonversi kedalam sel darah putih menjadi masing-masing

nukleotida-nya. Nukleotida-nukleotida ini meliputi dATP, yang dikenal sebagai

suatu penghambat kuat replikasi DNA, karena dATP menghalangi sintesa

deoksiribonukleotida dari ribonukleotida. Sel darah putih harus berkembang biak

untuk terjadinya respon kekebalan. Pada gilirannya, perkembangbiakan

memerlukan banyak sekali sintesa DNA dan juga precursor-nya. Mekanisme

tambahan juga dilibatkan, karena dATP telah berfungsi untuk membunuh sel

darah putih bahkan ketika mereka tidak sedang berkembang biak. Salah satu

mekanisme seperti ini muncul pada tahun 1997, pada saat dATP disebutkan

menjadi suatu agen pemberi isyarat yang membantu memicu terjadinya

metabolisme yang mengakibatkan apoptosis.

Semi QUE V-2004 55

Menghambat replikasi sel darah

putih

Page 19: BAB III Met as Nukleat

Kekurangan adenosine deaminase (ADA) adalah kasus pertama yang pernah

diobati dengan therapy gen. Pada tahun 1995, dua anak perempuan dengan

kondisi seperti diatas telah diobati dengan viral vektor kedalam mana gen untuk

deaminase adenosine telah disambung dengan teknologi recombinant DNA,

dengan harapan bahwa engineered virus (virus hasil rekayasa gen) akan

memasukkan dirinya sendiri dalam sel-sel inang (sel-sel pasien) untuk kemudian

gen yang dibawanya akan menghasilkan cukup enzim sehingga mampu

mendegradasi campuran deoksiadenosine yang terkumpulkan. Tiga tahun setelah

perawatan yang bersifat percobaan, kedua pasien dilaporkan menjadi sehat.

Suatu immunodeficiency yang tidak begitu akut dapat diakibatkan oleh

kekurangan enzim purin degradative lainnya, seperti purin nukleotida

phosphorylase (PNP). Penurunan aktivitas enzim ini menyebabkan suatu

akumulasi terutama pada dGTP. Akumulasi ini juga mempengaruhi replikasi

DNA, tetapi jauh lebih ringan jika dibandingkan dengan kelebihan dATP. Yang

menarik adalah bahwa defesiensi phosphorylase ini menghancurkan hanya

lymphocytes (sel darah putih) jenis T, tetapi lymphocyt B tidak.

D. METABOLISME NUKLEOTIDA PIRIMIDIN

1. BIOSINTESIS CINCIN PIRIMIDIN DE NOVO

Sekarang kita akan mengalihkan perhatian kita ke biosintesis nukleotida

pirimidin, yang sangat lebih sederhana dibanding pembentukan purin nukleotida

yang jauh lebih rumit. Seperti biosintesis purin, jalur ini serupa didalam hampir

semua organisme yang telah dipelajari. Seperti yang diringkas dalam Gambar

3.10, namun, ada dua perbedaan utama dari jalur purin. Pertama, cincin pirimidin

dirancang sebagai basa bebas, dengan konversi kepada nukleotida yang terjadi

kemudian dalam jalur, pada saat basa asam orotic dikonversi menjadi orotidine

monofosfat, atau OMP. Ke dua, jalur pirimidin tidak bercabang. Uridine trifosfat,

salah satu dari ribonudeoside trifosfats yang paling umum dan karenanya

merupakan hasil akhir suatu jalur, adalah juga merupakan substrate untuk

pembentukan cytidine trifosfat yang merupakan hasil akhir yang lain.

Semi QUE V-2004 56

Page 20: BAB III Met as Nukleat

2. KENDALI BIOSINTESIS PIRIMIDIN DALAM BAKTERI

Sintesa pirimidin dimulai dengan pembentukan carbarmoyl fosfat, suatu reaksi

yang ditunjukkan dalam reaksi 1 dalam Gambar 3.10. Namun, reaksi pertama

yang terjadi semata-mata untuk sintesa pirimidin adalah pembentukan carbamoyl

aspartate dari carbamoyl fosfat dan aspartate, yang dikatalisasi oleh aspartate

transcarbamoylase, atau ATCase (reaksi 2). Dalam bakteri enterik, enzim ini

menunjukkan suatu contoh kontrol feedback yang bagus sekali. Perlu diingat

bahwa enzim dihambat oleh hasil akhir CTP dan diaktifkan oleh ATP, yang

belakangan disebutkan mungkin menunjukkan suatu mekanisme untuk

memelihara agar purin dan pirimidin biosynthesis seimbang. Bakteri juga

mengatur metabolisme pirimidin melalui kendali sintesa ATCase dan enzim

lainnya. Tingkat suatu transkripsi dari suatu operon encoding (pengendali gen)

dari kedua- subunit ATCase sangatlah beragam yaitu sekitar 150-kali, tergantung

pada konsentrasi

intracellular dari UTP. Semakin tinggi konsentrasi UTP, semakin rendah tingkat

transkripsi gen-gen ini.

3. ENZIM MULTIFUNGSIONAL DALAM SINTESA PIRIMIDIN EUKARIOT

Aspartate transcarbamoylase (ATCase) dalam eukariot sangatlah berbeda dari

enzim sejenis di E. coli. Hal ini diketahui melalui analisa penghalangan ATCase

oleh N-Phosphonoacetyl-L-Aspartate (PALA).

Senyawa ini, disintesiskan sebagai suatu analog untuk transisi putatif kompleks antara

kedua substrate, menghalangi sintesa pirimidin di dalam sel mammalia. Namun, sel

juga sekaligus mengembangkan perlawanan terhadapnya, sebab tingkatan ATCase

dalam sel ini naik diluar kapasitas PALA untuk menghalangi semua aktivitas yang

Semi QUE V-2004 57

Page 21: BAB III Met as Nukleat

ada. Tapi anehnya, sel resistan ini berisi turunan tingkat carbamoyl fosfat synthetase

(lihat reaksi 1 dalam Gambar 3. 10) dan dihydroorotase (reaksi 3).

Gambar 3.10 Sintesa De Novo pada nukleotida pirimidin.

Penjelasan terhadap pengamatan ini muncul bersamaan dengan penemuan dari

suatu protein yang berisi tiga rantai polypeptide yang identik, masing-masing

dengan Mr sekitar 230,000, yang mengkatalisasi ketiga reaksi tersebut. George

Stark telah memberi istilah untuk enzim trifunctional dengan singkatan CAD (dari

Semi QUE V-2004 58

1

2 3 4

5

6

78

9

Page 22: BAB III Met as Nukleat

huruf permulaan masing-masing enzim). Ia menunjukkan bahwa protein

berkumpul dalam sel PALA-resistant sebab gen yang menyandikan protein itu

menjadi meningkat sebagai konsekwensi dari tekanan yang selektif yang

diberikan oleh PALA; sel resistan juga mempunyai lebih banyak kopi gen

dibandingkan komplemen normal dua kopi dari setiap diploid sel. Fenomena

pembesaran gen ini sekarang telah sering diamati dalam sel eukaryot yang dipapar

dengan suatu tekanan/stress tertentu.

Di dalam sel mammalia, reaksi 5 dan 6 dalam Gambar 3.10 juga dikatalisis oleh

protein tunggal, yang disebut dengan UMP synthase. Kita belum mengetahui

banyak tentang bagaimana hal ini mempengaruhi regulasi biosintesis pirimidin,

namun penyejajaran sisi aktif dapat menyebabkan “channeling”, seperti yang

disebutkan untuk protein multifungsional dalam sintesa purin. Kita masih harus

mempelajari lebih banyak tentang bagaimana, atau apakah, intermediate

biosintetik pirimidin di-channel-kan, sebab dihydroorotate dehydrogenase (lihat

reaksi 4 dalam Gambar 3. 10) ditempatkan dalam membran mitochondrial luar,

sedangkan enzim-enzim bifungsional dan trifunctional ada di dalam sitoplasma.

Dengan mengetahui bahwa intermediate harus bergerak kedalam dan kemudian

ke luar dari mitochondria, keuntungan kinetik yang didapatkan dengan

channeling dari langkah-langkah pertama dan terakhir sepertinya menjadi

ditiadakan. Logika dari metabolisme channeling tidak sempurna ini belum

dapat dipahami.

Lokasi lain untuk mengendalikan sintesa nukleotida pirimidin adalah

amidotransferase, CTP synthetase, di mana enzim ini mengkonversi UTP menjadi

CTP (reaksi 9). Enzim ini terhambat secara allosteris oleh produknya sendiri yaitu

CTP dan diaktifkan oleh GTP.

4. SINTESA SALVAGE [PENYELAMATAN] DAN KATABOLISME PIRIMIDIN

Nukleotida pirimidin juga disintesakan oleh jalur salvage yang melibatkan

phosphorylase dan kinase, yang dapat dibandingkan dengan apa yang telah

dibahas untuk Purin. Jalur-jalur katabolis untuk Pirimidin yang diringkas dalam

Gambar 3.11, lebih sederhana dibanding jalur-jalur untuk Purin. Karena

Semi QUE V-2004 59

Page 23: BAB III Met as Nukleat

intermediate-nya secara relatif dapat larut, maka diketahui hanya ada sedikit

gangguan penguraian pirimidin. Salah satu produk degradasinya adalah β-

alanine, yang digunakan dalam biosintesis coenzyme A.

Gambar 3.11 Jalur katabolis untuk metabolisme nukleotida Pirimidin

E. BIOSINTESIS DAN METABOLISME DEOKSIRIBONUKLEOTIDA

Sebagian besar sel mengandung 5 sampai 10 kali RNA lebih banyak dibanding DNA.

Selain itu, seperti yang telah kita saksikan, ribonukleotida mempunyai berbagai peran

dalam metabolisme, sementara deoksinbonukleotida berperan hanya sebagai

Semi QUE V-2004 60

Page 24: BAB III Met as Nukleat

konstituen pembentukan DNA. Oleh karena itu, sebagian besar karbon yang mengalir

sepanjang jalur nukleotida sintetik memasuki ribonukleotida trifosfat (rNTP). Namun,

fraksi-fraksi yang relatif berukuran kecil yang dialihkan kedalam sintesa

deoksiribonukleotida trifosfats (dNTPs) menjadi sangat penting dalam hidup sel..

Selanjutnya, terdapat hubungan regulatori antara sintesa DNA dan metabolisme

dNTP – kurang lebih seperti ini juga hubungan antara biosynthesis macromolecular

lain dan jalur yang menyediakan precursornya. Keseluruhan jalur biosintesis dNTP

ditunjukkan dalam Gambar 3.12.

Semi QUE V-2004 61

Page 25: BAB III Met as Nukleat

Gambar 3.12 Biosinthesis deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP).

Perlu diingat bahwa DNA berbeda secara kimiawi dari RNA dalam wujud gulanya

dan dalam identitas basa pirimidin-nya. Kita dapat memusatkan pembahasan kita

tentang biosintesis deoksiribonukleotida pada dua proses spesifik – yaitu konversi

ribose menjadi deoksiribose, dan konversi uracil menjadi thymine. Kedua proses ini

terjadi pada tingkat nukleotida. Selain itu kedua proses secara mekanis sangatlah

menarik untuk dijadikan lokasi target pada kemoterapi kanker ataupun penyakit

menular dan juga menarik dari sudut pandang regulasinya. Selanjutnya kedua proses

akan diuraikan secara lebih detil.

1.REDUKSI RIBONUKLEOTIDA MENJADI DEOKSIRIBO

NUKLEOTIDA

Secara mekanis, reduksi ribose menjadi deoksiribose melibatkan penggantian

hidroksil pada C-2 oleh, suatu ion hidrida, dengan penyimpanan konfigurasinya.

Peter Reichard menunjukkan bahwa reaksi sulit ini terjadi di tingkatan nukleotida,

dan reaksi ini pulalah yang mendorong ke arah penemuan enzim penting

ribonukleotida reduktase olehnya.

Semi QUE V-2004 62

Page 26: BAB III Met as Nukleat

Dalam semua organisme yang telah dipelajari sampai sekarang, enzim tunggal

mengurangi ke-empat substrates ribonukleotida menjadi 2'-deoksiribonukleotida

yang bersesuaian. Suatu mekanisme radikal bebas terlibat dalam reaksi ini.

Walaupun evolusi(?) telah menciptakan tiga mekanisme berbeda untuk

menghasilkan suatu mekanisme radikal bebas fungsional, ketiga kelas

ribonukleotida reductase dengan jelas menggunakan ilmu kimia dasar yang sama

untuk mengurangi substrates. Bentuk enzim yang didistribusikan secara luas

disebut kelas I ribonukleotida reductase, bertindak sesuai dengan substrates

ribonukleotida difosfat, menyebabkan dia disebut dengan rNDP reductase.

Enzim ini menghasilkan radikal-nya pada suatu tyrosine residu spesifik, dengan

bantuan dari suatu jembatan oksigen diferric (dua atom besi). Enzim kelas II,

ditemukan dalam cyanobacteria, beberapa bakteri, dan Euglena, bertindak sesuai

dengan substrat ribonukleotida trifosfat dan menggunakan adenosylcobalamin,

coenzyme a B12, untuk menghasilkan radikal bebas. Enzim jenis III, ditemukan

hanya dalam mikroba anaerobes fakultatif dan obligatif, juga bertindak sesuai

dengan substratnya yaitu ribonukleotida trifosfat. Enzim-enzim ini

menggunakan S-Adenosylmethionine dan sebuah pusat atom besi-belerang untuk

menghasilkan radikal penting secara katalitis pada suatu residu glycine.

Pembicaran kita akan berfokus pada kelas 1, format yang paling tersebar luas,

yang aktivitasnya ditunjukkan pada Gambar 3.13.

2.STRUKTUR RNDP REDUCTASE

Seperti yang ditemukan dalam E. coli dan sel-sel mammalia, kelas I rNDP reductase

adalah suatu tetramer α2β2. Enzim E. coli terdiri dari dua protein - R1, dengan dua

rantai α polypeptide serupa dengan masing-masing Mr 87,000, dan R2, terdiri dari

dua 43,000 dalton rantai β. Struktur dari enzim ini digambarkan dalam Gambar 3.13.

Lokasi katalitis berada dalam protein yang besar (R1). Di dalam lokasi ini

terdapat tiga residu cysteine, yang dihemat diantara reductases rNDP berbeda.

Dua dari cysteine thiols adalah redox-active, disebnut demikian sebab mereka

mengalami reduksi dan oksidasi siklis sepanjang terjadinya reaksi. Cysteine

ketiga dengan jelas berfungsi sebagai bagian dari suatu mekanisme radikal bebas,

seperti yang diuraikan dalam bagian berikut ini.

Semi QUE V-2004 63

Page 27: BAB III Met as Nukleat

R2 dimer berisi suatu tyrosine radikal bebas khusus yang terlibat dalam reaksi dan

suatu atom oksigen yang menghubungkan dua ion ferri. Center dinuclear besi ini

menstabilkan radikal bebas. Protein RI berisi dua kelas lokasi regulator, yang

akan segera kita diskusikan. Akhirnya, protein R1 berisi suatu tambahan pasangan

kelompok redox-active thiol, yang saling berhubungan dengan suatu cofactor

reductif eksternal. Enzim sejenis dari mammalia memiliki keserupaan dalam hal

strukturnya.

Gambar 3.13 Struktur E. coli ribonukleotida difosfat reductase3.MEKANISME REDUKSI RIBONUKLEOTIDA

Walaupun kita belum mengetahui mekanisme reaksi rNDP reductase secara

lengkap, kita dapat merumuskan suatu mekanisme yang masuk akal berdasarkan

pada pengamatan berikut ini. (1) studi Radiolabeling menunjukkan perpecahan

ikatan ribose C-3' – H terjadi pada saat reaksi terjadi. (2) Reaksi ini terus terjadi

dengan tetap menyimpan konfigurasi pada C-2', yang mengesampingkan

pergantian kelompok hidroksit oleh suatu ion hydride dalam suatu reaksi SN2. (3)

Kelompok thiol mengalami oksidasi selama reaksi. (4) Radikal bebas tyrosine

berperan dalam reaksi tersebut. Hal ini pertama kali ditunjukkan oleh fakta bahwa

Semi QUE V-2004 64

Page 28: BAB III Met as Nukleat

hydroxyurea, suatu penghambat reductase rNDP, menghancurkan radikal bebas.

Suatu demonstrasi yang bagus ditunjukkan pada Gambar 3.14.

Gambar 3.14 Bukti bahwa tyrosine 122 dalam protein E coli R2 mengandung radikal bebas

Radikal bebas menunjukkan suatu karakteristik spektrum resonansi paramagnetik

elektron (Resonansi Paramagnetik Elektron). Tyrosine 13, residu yang dianggap

menghasilkan radikal dalam enzim E. coli, diubah menjadi phenylalanine oleh

site-directed mutagenesis gen yang di-klone untuk R2. Protein yang telah dirubah

ternyata tidak aktif dan tidak menunjukkan spectrum Resonansi Paramagnetik

Elektron - karenanya, tidak ada bukti keberadaan dari suatu radikal bebas.

Semi QUE V-2004 65

Page 29: BAB III Met as Nukleat

Gambar 3.15 Reduksi ribonukleotida difosfat oleh reduktasi rNDP

Bagaimanapun juga, karena radikal terletak jauh dari lokasi katalitis, seperti yang

ditunjukkan oleh kristalografi (lihat Gambar 3.13), seseorang harus merumuskan

beberapa macam proses panjang dengan mana elektron yang tidak dipasangkan

dalam radikal tyrosine menarik suatu elektron dari suatu lokasi residu aktif.

Bukti-bukti menunjukkan bahwa (1) residu ini adalah cysteine 439 dalam enzim

E.Coli dan (2) suatu satuan residu asam amino spesifik pada R1 dan R2 berperan

dalam proses pengangkutan elektron yang panjang.

Suatu mekanisme masuk akal bagi rNDP reductase, berdasar pada pengamatan

diatas, ditunjukkan pada Gambar 3.15. Pertama, cysteine 439 yang berada di

lokasi yang aktif dikonversi menjadi radikal thiyl bebas, dengan hilangnya suatu

elektron, dalam suatu rangkaian pengangkutan elektron yang mengakibatkan

reduksi tyrosine 122 (langkah 1). Berikutnya, radikal thiol berperan dalam

perolehan atom hidrogen dari C-3' dari substrate (langkah 2). Hal ini diikuti oleh

hilangnya suatu ion hidroksida dari C-2', menghasilkan suatu ion carbonium

radikal yang resonance-stabilized (langkah 2 dan 3). Enzim memindahkan suatu

pasangan elektron dari cysteine thiols yang redox-active dan sebuah atom

hidrogen dari cysteine 439 (langkah 4), agar nukleotida menghasilkan produknya.

Resultan residu cystine kini dikurangi oleh pertukaran disulfide dengan pasangan

redox-active thiols lainnya dalam subunit R1; hal ini tidak ditunjukkan dalam

gambar. Disulfide yang dihasilkan dikurangi oleh suatu kofaktor eksternal

(dinyatakan dengan Grx - lihat bagian yang berikutnya), mengembalikan bentuk

aktif enzim tersebut.

Mekanisme yang ditunjukkan dalam Gambar 3.15 belumlah sempurna, karena

masih terdapat beberapa pertanyaan penting yang belum terjawab. Pertama, kita

tidak mengetahui peran dari center besi dalam pembentukan radikal bebas. Salah

Semi QUE V-2004 66

Page 30: BAB III Met as Nukleat

satu mekanisme yang mungkin, mengingatkan kepada pengaktifan Cytochrome

P450, ditunjukkan di bagian margin. Juga, seperti yang dibahas dalam bagian

berikutnya, tidaklah jelas bagaimana kekuatan reduksi eksternal ditransfer melalui

satu pasang thiols di lokasi redox pada R1, kepada pasangan lain dalam lokasi

katalitik.

4.SUMBER ELEKTRON UNTUK REDUKSI rNDP

Elektron untuk reduksi ribonukleotida berasal terutama dari NADPH, tetapi

mereka dikirimkan ke rNDP reductase oleh suatu coenzyme khusus karena

mereka sendiri merupakan suatu protein (Gambar 3.16). Anggota pertama yang

dikenal dalam kelas protein redoxactive ini adalah thioredoxin, suatu protein kecil

(Mr ~ 12,000) dengan dua kelompok thiol dalam urutan Cys-Gly-Pro-Cys. Thiol-

thiol mengalami oksidasi yang dapat dibalik menjadi disulfide, dengan demikian

mengurangi belerang disisi aktif dari reductase rNDP. Thioredoxin yang

teroksidasi dikurangi oleh NADPH melalui aktifikas dari suatu enzim

flavoprotein, yaitu reductase thioredoxin.

Sejak penemuannya, thioredoxin telah ditemukan mempunyai banyak aktivitas

secara in vitro, yang menunjukkan fungsi biologis yang mengejutkan. Beberapa

diantaranya dicantumkan dalam Tabel 3.1. Apakah thioredoxin benar-benar

merupakan cofactor intracellular untuk reduksi ribonukleotida dipertanyakan

dengan cara melakukan isolasi mutan E.Coli yang memiliki kekurangan atas

protein ini. Karena mutant ini mampu mereplikasi DNA, para peneliti mencari

protein redox lain didalam sel yang bisa berinteraksi dengan reductase rNDP.

Protein seperti ini ditemukan dan dinamai glutaredoxin, oleh karena

kemampuannya bisa dikurangi oleh glutathione. Sel mutan yang kekurangan baik

thioredoxin dan glutaredoxin dapat terus hidup, tetapi mereka memerlukan

cysteine untuk pertumbuhan. Penemuan ini memastikan suatu peran untuk

thioredoxin dalam pemanfaatan sulfate, dan hal tersebut menyatakan keberadaan

dari pengangkut elektron ketiga. Sesungguhnya, spesies tambahan glutaredoxin

telah ditemukan. Apapun pengangkutnya dalam cofactor utama untuk reductase

rNDP, sumber elektron utamanya adalah NADPH.

Semi QUE V-2004 67

Page 31: BAB III Met as Nukleat

Gambar 3.16 Urutan Transport Elektron reduktif pd terjadinya rNDP reduktase

Tabel 3.1 Aktifitas Biologis pada thioredoxin

5.REGULASI AKTIVITAS RIBONUKLEOTIDA REDUCTASE

Karena deoksiribonukleotida digunakan hanya untuk sintesa DNA, dan karena

satu sistem enzim digunakan untuk reduksi keempat substrates ribonukleotida,

regulasi baik untuk aktivitas (activity) dan kekhususan (specificity) reductase

ribonukleotida adalah penting untuk mempertahankan keseimbangan cadangan

precursor DNA. Regulasi ini dicapai melalui pengikatan effectors nukleotida

trifosfat kepada dua sisi aktif pada subunit R1 (sebanyak dua masing-masing

lokasi setiap molekul dalam enzim E. coli - lihat Gambar 3.13). Sisi aktif

mengikat baik ATP maupun dATP, dengan gaya ikat yang rendah, sedangkan sisi

Semi QUE V-2004 68

Page 32: BAB III Met as Nukleat

spesisfik mengikat ATP, dATP, dGTP, atau dTTP, semua dengan gaya ikat yang

tinggi. Pengikatan ATP di sisi aktif cenderung untuk meningkatkan efisiensi

katalitis rNDP reductase untuk semua substrates, sedangkan dATP bertindak

sebagai suatu penghambat umum dari ke-empat reaksi. Pengikatan nukleotida di

sisi spesifik mengatur aktivitas enzim ke arah substrates yang berbeda, yang

bertujuan untuk menjaga tingkat keseimbangan produksi ke-empat dNTPs.

Sebagai contoh, pengikatan dTTP (dengan ATP terikat di sisi aktif) mengaktifkan

enzim untuk reduksi GDP tetapi mengurangi kemampuannya untuk mereduksi

baik UDP maupun CDP. Tabel 3.2 meringkas prinsip efek pengatur.

Tabel 3.2 Regulasi pada saat aktifitas reduktase ribonukleotida terhadap mamalia

Efek ini terlihat secara in vitro dengan enzim yang dimurnikan. Ada banyak

alasan untuk menyimpulkan bahwa efek regulatori serupa-lah yang juga

beroperasi dalam sel utuh. Contohnya, baik deoksiadenosine maupun thymidine

akan menghalangi sintesa DNA manakala dimasukkan kedalam sel utuh.

Pengukuran pool intracellular dNTPs menunjukkan bahwa pada sel yang diberi

perlakukan dengan menggunakan deoksiadenosine pool dATP akan

berkembang(seperti yang diharapkan dari efek salvage jalurs), sedangkan pools

dTTP. dGTP, dan dCTP menyusut. Karena inilah mengapa sel darah putih tidak

bisa berkembang biak seperti yang dibutuhkan dalam kondisi immunodeficiency

dalam hubungannya dengan kekurangan adenosine deaminase (ADA) akumulasi

dATP dalam sel ini menghalangi sintesa deoksiribonukleotida dan, karenanya,

juga akan menghalangi DNA replication.

Contoh lain datang dari biologi sel. Para peneliti sering mensinkronkan kultur

sel, yaitu memanipulasi sel sedemikian rupa sehingga semua berada pada siklus

sel yang sama. Synchrony dapat dicapai oleh blokade thymidine, di mana

Semi QUE V-2004 69

Page 33: BAB III Met as Nukleat

thymidine ditambahkan kepada sel untuk menghalangi sintesa DNA. Hal ini

mencegah adanya alur sel dari G1 menuju tahap S dari siklus sel, dan kemudian

sel akan berkumpul di posisi ini, seperti lalu lintas yang berhenti pada lampu

merah. Memindahkan sel ke medium yang tidak berisi thymidine adalah seperti

lampu hijau, membalikkan penghambat dan membiarkan sel untuk memulai

replikasi DNA secara sinkron. Pengukuran pool dNTP dalam sel yang diblokade

thymidine menunjukkan bahwa dTTP berkumpul, seperti yang diharapkan dari

sintesa salvage, selagi ada suatu konsumsi spesifik suatu dCTP, seperti yang

diharapkan dari efek dTTP pada aktivitas ribonukleotida reductase. Tentu saja,

penambahan deoksicytidine mengembalikan pool dCTP ke tingkat normal

(dengan sintesa salvage) dan membuka blokade thymidine.

Dukungan lebih lanjut bagi kendali aktivitas reductase rNDP secara in vivo

berasal dari isolasi keturunan sel mammalia mutan yang pertumbuhannya tidak

dihalangi oleh deoksiribonudeosida. rNDP Reductase dari sel mutan ini

menunjukkan modifikasi baik dalam sisi spesifik atau sisi aktifitas enzim, yang

memnunjukkan bahwa enzim ini tidak terlalu peka terhadap halangan oleh

effectors dNTP. Beberapa dari bentuk sel ini menunjukkan ketidaknormalan pool

dNTP dan fenotipe. Yaitu bahwa, mereka menunjukkan tingkat mutasi yang naik

secara spontan pada semua lokus gen yang diuji. Pengamatan lainnya juga telah

dilakukan sel mutan baik yang dimutasi pada gen CTP synthetase maupun pada

gen deoxcytimidylate deaminase. Penemuan ini menunjukkan bahwa manakala

konsentrasi dNTP diubah pada lokasi replikasi DNA, kemungkinan kesalahan

replikasi menjadi meningkat, yang mendorong terjadinya mutasi.

Dasar pemikiran yang berkenaan dengan metabolisme untuk semua efek yang

ditunjukkan dalam Tabel 3.2 tidaklah sejelas seperti yang terlihat. Sebagai contoh,

mengapa dATP yang berada di sisi spesifik mengaktifkan pengurangan CDP dan

UDP? Bagian dari jawabannya adalah bahwa reduksi UDP merupakan suatu jalur

minor. Sebagian besar dTTP berasal dari deoksicytidine nukleotida, melalui

dCMP pada reaksi deaminase.

6.BIOSINTESIS THYMINE DEOKSIRIBONUKLEOTIDA

Bagian sebelumnya membahas tentang reaksi metabolik pertama yang berkaitan

dengan sintesis DNA – pembentukan deoksiribonudeoside difosfats melalui

Semi QUE V-2004 70

Page 34: BAB III Met as Nukleat

aktifitas reductase rNDP. Sekali terbentuk, tiga dari difosfats – dADP, dGDP, dan

dCDP –dikonversi menjadi trifosfats oleh nukleotida difosfat kinase.

Biosintesisdeoksithymidine trifosfat terjadi sebagian dari dUDP yang diproduksi

melalui reductase dan sebagian dari deoksicytidine nukleotida; perbandingannya

bervariasi menurut jenis organisme dan selnya.Perlu diingat bahwa kita

menggunakan istilah thymidine dan deoksithymidine dengan fleksibel. Hal ini

karena thymine dan ribonukleotida bukan merupakan metabolites yang normal,

jadi nukleotida yang berisi thymine dan deoksiribose tidak perlu secara rinci

dikenali sebagai deoksiribonukleotida karena ribonukleotida yang mengandung

timin mesti deoksi timidina.

Jalur yang diringkas ada dalam Gambar 3.12 dan 3.17. Jalur de novo yang

menunjukkan deoksiuridine monofosfat (dUMP) sebagai substrate untuk sintesa

thymine nukleotida: (1) dUDP difosforilasi menjadi dUTP, yang kemudian

dibelah oleh suatu diphosphohydrolase yang sangat aktif, dUTPase. (2) dCDP di-

defosforilasi menjadi dCMP, yang kemudian mengalami deaminasi menjadi

dUMP oleh suatu aminohydrolase yang disebut dCMP deaminase. Reaksi yang

terakhir disebutkan, menunjukkan suatu titik cabang untuk sintesa pirimidin

dNTP; enzimnya memerlukan dCTP sebagai suatu penggerak allosteric dan

dihalangi oleh dTTP. Di E. coli dan beberapa bakteri lain menggunakan suatu

jalur berbeda ke dUMP. Deaminasi terjadi pada tingkatan trifosfat oleh deaminase

dCTP, dan hasil dUTP kemudian dibelah oleh dUTPase menjadi dUMP dan PPi.

Tanpa menghiraukan cara pembentukannya, dUMP akan bertindak sebagai

substrate untuk pembentukan thymidine monofosfat (dTMP), yang akan

dikatalisis oleh thymidylate synthase. Enzim ini memindahkan suatu unit satu-

carbon, di tingkat oksidasi methylene, dan menguranginya menjadi tingkat metil.

Donor satu-carbon adalah 5,10-methylenetetrahydrofolate, yang didalam reaksi

yang tidak biasa ini juga bertindak sebagai suatu redox cofactor, yaitu untuk

menghasilkan dihydrofolate sebagai produk lain (Gambar 3.18). Kemudian,

kofaktor harus dikurangi, dengan reductase dihydrofolate, dan hal ini harus

memperoleh kelompok methylene yang lain, paling umum melalui serine

transhydroxymethylase. Gangguan terhadap salah satu dari langkah-langkah ini

Semi QUE V-2004 71

Page 35: BAB III Met as Nukleat

akan mempengaruhi pembentukan thymine nukleotida. sekali terbentuk, dTMP

akan dikonversi menjadi dTTP oleh dua fosforilasi yang terjadi berurutan.

Gambar 3.17 Jalur sintetik salvage & de novo pada nukleotida thymine

7.METABOLISME DEOKSIURIDINE NUKLEOTIDA

Sebagai tambahan fungsi biosintetik dUTPase dalam pembentukan dUMP untuk

formasi thymine nukleotida, enzim memainkan suatu peran penting dalam

mengeluarkan uracil dari DNA. Pada saat dUTP tidak dengan cepat diturunkan,

dUTP bisa bertindak sebagai suatu substrate yang bagus untuk DNA enzim

polymerase. Sesungguhnya, seperti yang telah dibahas dalam bab sebelumnya,

sel-sel memiliki suatu mekanisme yang rumit untuk memastikan bahwa residu

dUMP manapun yang masuk ke dalam DNA secara efisien dihilangkan. Karena

Semi QUE V-2004 72

Page 36: BAB III Met as Nukleat

secara visual uracil hampir serupa dengan thymine dalam hal sifat pemasangan

basa-nya, mengapa sedemikian penting bagi sel untuk hanya membiarkan

thymine saja untuk secara stabil diinkorporasikan kedalam DNA?

Jawabannya mungkin berada dalam fakta bahwa residu dUMP dapat muncul

dalam DNA yang tidak hanya disebabkan oleh inkorporasi dUTP tetapi juga oleh

deaminasi spontan residu dCMP. Proses yang terakhir disebut, yang terjadi pada

suatu tingkat yang dapat dinilai, akan mengubah pemikiran suatu pesan genetik,

maka hal ini tampak menguntungkan bagi sel untuk tetap mempertahankan

stabilitas genetik dengan memiliki suatu sistem pengawasan yang menghilangkan

residu dUMP tanpa memperdulikan asal residu tersebut. Mengapa thymidine

dipilih terlebih dahulu dan bukannya uracil sebagai basa DNA adalah juga

merupakan pertanyaan yang berkaitan. Studi thermodynamik menunjukkan

bahwa kelompok metil thymidine mendukung interaksi hydrophobik yang

menstabilkan heliks ganda DNA secara signifikan.

Enzim dUTPase memiliki suatu struktur yang khusus (Gambar 3.19). Enzim

dUTPase E. coli adalah merupakan suatu homotrimer, dengan masing-masing

ketiga sisi aktif yang berisikan residu asam amino dari dua polypeptide subunit

yang bersebelahan.

8.JALUR SALVAGE KE ARAH SINTESIS DEOKSIRIBO

NUKLEOTIDA

Seperti yang telah dicatat sebelumnya, salvage purin pada umumnya melibatkan

reaksi-reaksi phosphoribosyltransferase, yang menghasilkan ribonukleotida

monofosfat dari basa purin dan PRPP. Setelah fosforilasi sampai tingkatan

difosfat, senywa-senyawa ini memasuki metabolisme deoksiribonukleotida

melalui aktifitas ribonukleotida reductase. Namun, deoksiribonukleotida kinases,

yang langsung menuju deoksiribonukleotida monofosfat, secara luas dibagi, dan

melibatkan baik Purin maupun Pirimidin. Kandungan ribo – dan

deoksiribonudeoside kinases dalam tiap sel dan tiap organisme sangatlah

beragam. Sel manusia berisi empat deoksiribonukleotida kinases berbeda - (1)

thymidine kinase, yang terletak di cytosol; (2) deoksicytidine kinase, yang juga

merupakan suatu enzim cytosolic, yang mem-phosphorylasi deoksiadenosine dan

Semi QUE V-2004 73

Page 37: BAB III Met as Nukleat

deoksiguanosine seperti halnya deoksicytidine, tetapi hanya pada konsentrasi

yang lebih tinggi saja; (3) deoksiguanosine kinase, yang asalnya dari

mitochondrial; dan (4) suatu isoform mitochondrial thymidine kinase, yang

mempunyai suatu kekhususan substrate lebih luas dibanding enzim cytosolik,

yang juga bertindak atas deoksicytidine dan deoksiuridine.

Seperti yang akan didiskusikan dalam bab ini, beberapa analog nukleotida sedang

digunakan atau diuji dalam mengobati kanker dan beberapa penyakit yang

disebabkan virus. Obat ini harus dikonversi menjadi deoksiribonukleotida agar

bisa menjadi efektif dan hal ini telah membuat terpusatnya perhatian terhadap

deoksiribonukleotida kinases. Sebagai contoh, efek samping dari 3'-azido-2',3'-

dideoksithymidine (AZT), obat pertama yang disetujui untuk mengobati infeksi

virus immunodeficiency pada manusia (HIV), adalah cardiotoxicity -kerusakan

pada otot jantung. Jalur utama pemanfaatan azidothymidine melibatkan isoform

mitochondrial thymidine kinase, juga disebut dengan TK2. Bukti-bukti yang ada

menunjukkan bahwa deoksiribonukleotida azidothymidine bertentangan

dengan fungsi mitochondrial, yaitu mungkin dengan cara menghambat replikasi

atau transkripsi DNA mitochondrial, dan mungkin hal ini adalah dasar dari

mengapa sampai terjadi cardiotoxicity. Oleh karena itu, riset-riset yang sekarang

dilakukan mengarah pada pengembangan analog yang pengaktifan metabolisme-

nya tidak terjadi didalam mitochondria.

Dari ke-empat deoksiribonukleotida kinases, tiga diantaranya disintesiskan dan

diproduksi pada suatu tingkat yang tidak berubah sepanjang siklus sel.

Perkecualiannya adalah thymidine cytosolic kinase (TKI), suatu konsentrasi

paling tinggi manakala sedang replikasi DNA; dalam kaitannya dengan hal ini,

TKI menyerupai enzim sintesa deoksiribonu-cleotide de novo, seperti

ribonukleotida reductase. Untuk alasan-alasan yang belum dimengerti, TKI

menyelamatkan (salvage) thymidine exogenous dengan sangat efisien. Percobaan

dengan precursor-radiolabeled menunjukkan bahwa dTTP yang didapatkan dari

sintesa salvage pada umumnya diinkorporasikan ke dalam DNA dalam

preferensinya terhadap thymidine nukleotida yang dihasilkan oleh sintesa de

novo. Hal ini merupakan dasar dalam teknik interpretasi tingkat replikasi DNA,

Semi QUE V-2004 74

Page 38: BAB III Met as Nukleat

dengan mengukur tingkat inkorporasi thymidine yang di-radiolabeled ke dalam

DNA. Namun, suatu pengukuran yang akurat terhadap tingkat sintesa DNA dari

data inkorporasi thymidine memerlukan pengukuran radioaktifitas spesifik dari

pool dTTP yang diberi label. Meskipun demikian, karena tingkat efisiensi tinggi

yang dengannya thymidine digunakan dalam sebagian besar sel, pengukuran

inkorporasi thymidine secara sederhana sering menghasilkan perkiraan akurat

tentang tingkat replikasi DNA.

F. THYMIDYLATE SYNTHASE: ENZIM TARGET UNTUK KEMOTERAPI

Tujuan kemoterapi – pengobatan penyakit dengan menggunakan reagen kimia –

adalah untuk memanfaatkan suatu perbedaan biokimia antara proses penyakit dan

jaringan sel inang untuk secara selektif melawan proses penyakit. Banyak agen

chemotherapeutic yang pada awalnya ditemukan hanya secara kebetulan, melalui

uji coba analog untuk metabolites normal. Sebagian besar agen ini terbatas

keefektifannya karena efek samping yang tidak diperhitungkan sebelumnya,

karena selektifitas yang tidak sempurna, dan karena perkembangan perlawanan/

aktivitas sistem kekebalan terhadap agen tersebut. Salah satu bagian yang paling

menggairahkan dalam ilmu farmasi biokimia modern adalah arsitektur

(perancangan) obat – yaitu perancangan penghambat spesifik berdasar pada

pengetahuan tentang struktur molecular di lokasi mana penghambat akan

diikatkan, dan berdasarkan mekanisme aktivitas dari molekul target. Untuk obat

yang targetnya adalah enzim, sangatlah diperlukan untuk mengetahui struktur

tiga-dimensi dari enzim dan mekanisme aktivitasnya. Untuk memperoleh

informasi ini diperlukan sinkronikasi antara kristalografi sinar x, ilmu kimia

bioorganik klasik, site-directed mutagenesis, dan molekular grafik dengan

bantuan computer. Upaya penghambatan terhadap enzim Thymidylate Synthase

merupakan suatu contoh sempurna tentang pendekatan dengan metode ini.

Seperti telah diuraikan, tujuan kemoterapi adalah untuk menyerang secara selektif

suatu proses metabolisme yang berhubungan dengan kondisi patologis. Karena

thymidylate synthase berperan didalam sintesa dari suatu deoksiribonukleotida,

penyakit apapun yang terlibat dalam perkembangbiakan sel yang tak

terkendalikan pada prinsipnya dapat diperlakukan dengan penghambat

Semi QUE V-2004 75

Page 39: BAB III Met as Nukleat

thymidylate synthase: Penghalangan produksi dari suatu precursor DNA

seharusnya dapat menghalangi replikasi DNA dengan efek minimal atas proses-

proses lainnya. Sel yang tidak mengalami perkembang biakan cepat seharusnya

secara relatif kebal terhadap agen seperti ini. Dengan demikian, kanker dan

banyak penyakit menular harus bersedia menerima perlakuan dengan

menggunakan pendekatan ini.

Tidak satupun dari yang dikemukakan diatas, dikenali pada pertengahan tahun

1950-an, karena synthase thymidylate belum ditemukan. Namun, telah diketahui

bahwa sel tumor tertentu mengambil dan me-metabolisme uracil jauh lebih cepat

dibanding dengan sel biasa. Tanpa mengetahui ‘nasib’ metabolisme uracil secara

detil, Charles Heidelberger berharap dapat membunuh sel tumor dengan selektif

dengan suatu perlakuan menggunakan ‘zat analog’ yang akan menghalangi

metabolisme uracil dalam sel tumor. Untuk mencapainya, ia mensintesa bahan

kimia 5-fluorouracil (FUra) dan sekaligus deoksiribonukleotida-nya, 5-

fluorodeoksiuridine (Fdurd). Kedua campuran ditemukan untuk menjadi

penghambat yang kuat bagi sintesa DNA. Aktivitas campuran tersebut sebagai

penghambat melibatkan konversi intracellular mereka menjadi 5-

fluorodeoksiuridine monofosfat (FdUMP), yaitu suatu analog dUMP yang

bertindak sebagai suatu penghambat yang tidak dapat dibalik bagi synthase

thymidylate

Semi QUE V-2004 76

123

4

5

6

Page 40: BAB III Met as Nukleat

Gambar 3.20 Kompleks antara Enzyme-terikat FdUMP dan 5,10-methylene-THF.

Baik fluorouracil dan fluorodeoksiuridine digunakan dalam perawatan kanker.

Bagaimanapun juga, Pirimidin yang ter-fluorinasi tidaklah terlalu selektif dalam

efek yang dihasilkannya. Sebagai contoh, fluorouracil dapat diinkorporasikan ke

dalam RNA oleh jalur salvage yang biasa digunakan untuk uracil, oleh karenanya

bertentangan dengan fungsi pembawa pesan RNA didalam sel normal dan sel

kanker. Yang jelas, suatu pemahaman terperinci menyangkut sisi aktif

thymidylate synthase bisa mendorong kearah perancangan penghambat/ inhibitor

enzim yang sangat spesifik.

Analisa tentang pengikatan 5-fluorodeoksiuridine monofosfat ke thymidylate

synthase telah membuka pintu pemahaman tentang mekanisme reaksi enzim dan

struktur dari sisi aktif enzim. FdUMP merupakan penghambat berbasis

mekanisme sejati, pengikatan yang tidak dapat dibalik tersebut terjadi hanya saat

ada 5,10-methylenetetrahydrofolate. Kiranya, pengikatan coenzyme

mempengaruhi perubahan konformasi pada sisi aktif enzim yang mengkopi tahap-

Semi QUE V-2004 77

Page 41: BAB III Met as Nukleat

tahap awal dalam reaksi katalitis sehingga menyebabkan pengikatan FdUMP yang

tidak dapat dibalik. Aktifitas proteolitik dari kompleks terner (tiga komponen)

yang berisi FdUMP, enzim, dan methylenetetrahydrofolate membimbing para

peneliti dalam laboratorium Charles Heidelberger dan Daniel Santi untuk

mengisolasi suatu fragmen peptida dari suatu enzim yang berisi baik inhibitor

maupun coenzyme. Ditunjukkan juga bahwa FdUMP dihubungkan ke karbon

methylene dari coenzyme melalui C-5 cincin pirimidin, dan dihubungkasn ke

enzim melalui suatu atom belerangnya sistein yang secara kovalen terikat ke C-6

pirimidin. Struktur dari kompleks menunjukkan bahwa reaksi enzymatik dimulai

dengan serangan nucleophilik oleh gugus thiol sistein terhadap C-6 dari substrate

dUMP.

Struktur dari kompleks antara Enzyme-terikat FdUMP dan 5,10-methylene-THF

menunjukkan suatu mekanisme yang digambarkan pada Gambar 3.20. Seperti

yang disebutkan sebelumnya, suatu ion cysteine thiolate pada enzim memicu

suatu serangan nucleophilik atas C-6 dUMP (langkah 1). Hal ini menghasilkan

suatu anion enolat yang yang distabilkan oleh resonansi elektron; sekarang C-5

menjadi suatu nukleofil, yang menyerang methylene karbon dari coenzyme

(langkah 2). Hilangnya proton dari C-5 (langkah 3) yang memicu suatu

pergeseran elektron sehingga menyebabkan transfer hidrogen C-6 dari kofaktor

kepada pirimidin (langkah 4), konsisten dengan pengamatan bahwa hidrogen ini

di-inkorporasikan secara kuantitatif ke dalam gugus metil thyrmidylate. Transfer

hidrogen ini mengoksidasi kofaktor menjadi hydrofolat, yang terpisah pada

langkah 5.Pada langkah 6 ikatan covalen enzyme-substrate terlepas, dengan

pembentukan kembali ikatan ganda antara C-5 dan C-6 pada cincin pirimidin.

Hambatan oleh FdUMP diakibatkan oleh elektronegativas fluorine, yang

menghasilkan suatu ikatan C-F pada C-5 yang tidak bisa pecah. Dengan begitu,

reaksi tidak bisa berlanjut ke langkah 3.

Kepastian mekanisme ini datang bersamaan dengan bukti bahwa substrate:

dUMP, membentuk suatu ikatan kovalen dengan coenzyme selama katalisis

normal. Bukti penting lainnya datang dari diketahuinya model tiga dimensi enzim

thymidylate synthase. Pada tahun 1987, Robert Stroud, Daniel Santi, dan para

rekan kerja mereka memperkenalkan suatu model enzim tersebut yang berasal

Semi QUE V-2004 78

Page 42: BAB III Met as Nukleat

dari Lactobacillus casei (Gambar 3.21). Thymidylate Synthase dikonservasi

(conserved=homolog= sama urutan asam aminonya) secara evolusioner (?),

dengan sekitar 20% dari residunya adalah suatu invarian diantara mammalia,

bakteri, virus, jamur, dan protozoa. Struktur kristal menunjukkan persentase yang

tinggi dari residu yang conserved tersebut dalam suatu subunit enzim diprediksi

mewakili sisi aktif. Protein ini merupakan suatu homodimer (terdiri dari dua sub

unit yang sama), dan residu conserved dari kedua garis subunit yang berada pada

suatu bagian dan dianggap berperan bagi katalisis. Cysteine 198, residu yang

dihubungkan dengan FdUMP, berada didalam subunit ini, berdekatan dengan

residu conserved lainnya, Arg 218, yang dapat menurunkan pKa dari gugus thiol

(-S) cysteine dan menghasilkan ion thiolate yang reaktif. Beberapa residu lysine

yang conserved berada berdekatan dan dianggap mewakili sisi pengikatan untuk

ekor polyglutamate pada folate coenzyme (thymidylate synthase mengikat folate

polyglutamates sekitar 100 kali lipat lebih kuat dibanding monoglutamate).

Gambar 3.22 Komplek penyesuaian substrate dan kofaktor yang terikat di sisi aktif.

Tidak lama sesudah model enzim diperkenalkan, dua laboratorium berhasil

mengkristalkan thymidylate synthase dari E. coli sebagai suatu kompleks dengan

dUMP dan suatu analog untuk 5,10-methylenetetrahydrofolate. Analisa tentang

komplek-komplek ini memastikan penyesuaian substrate dan kofaktor yang

terikat di sisi aktif (Gambar 3.22) dan identifikasi terhadap residu sisi aktif dalam

hubungan dengan ligands ini. Analisa tentang interaksi ikatan yang terlibat telah

menghasilkan disain dan sintesa analog kofaktor yang tidak memiliki hubungan

jelas dengan 5,10-methylenetetrahydrofolate, tetapi bersaing dengan 5,10-

Semi QUE V-2004 79

Page 43: BAB III Met as Nukleat

methylenetetrahydrofolate untuk secara efektif mengikatkan diri ke TS (Ki

nilainya serendah 30 nM). Satu penghambat seperti Thymitaq, ditunjukkan di sini.

Pada tahun 1991 kristalisasi dari jenis enzim ini yang berasal dari manusia telah

dilaporkan, dan enzim tersebut kemudian menjadi fokus pengembangan obat

lebih lanjut. Upaya ini, ditambah dengan studi mekanistis terhadap enzim-enzim

yang diproduksi oleh site-directed mutagenesis dan analisis struktural thymidylate

synthase dari jenis lainnya, harus dapat menyiapkan jalan bagi pengembangan

suatu inhibitor yang effektif terhadap enzim tersebut, yang mungkin akan dapat

bertindak sebagai obat anti kanker yang berharga. Pendekatan yang sama juga

sedang dilakukan dibeberapa lusin laboratorium, berfokus pada reseptor obat

yang melibatkan: protein yang terikat pada membran sel atau protein reseptor

intracellular dan juga asam nukleat, disamping enzim yang dibicarakan tadi.

Pengembangan suatu inhibitor terhadap protease spesifik HIV sebagai obat anti-

AIDS merupakan contoh yang mencengangkan dari keberhasilan pendekatan ini.

Selain kanker, target lain juga dapat dihambat kalau diberi perlakuan

menggunakan penghambat inhibitor thymidylate synthase. Contohnya, seperti

parasit protozoa (plasmodium yang menyebabkan malaria), yang mensintesis

suatu bentuk khusus suatu enzim bifungsional dari thymidylate synthase, yang

mempunyai baik aktivitas thymidylate synthase maupun aktifitas dihydrofolate

reductase. Dengan mengetahui bahwa struktur khusus dari sisi aktif enzim ini

berbeda dari thymidylate synthase pada host manusia atau binatang, maka dapat

dikembangkan suatu inhibitor spesifik yang hanya menghambat enzim pada

protozoa, tetapi tidak menghambat enzim sejenis di sel manusia atau hewan

inangnya.

G. PENGUBAHAN OLEH VIRUS PADA METABOLISME NUKLEOTIDA

Bahwa virus-virus dapat mengubah metabolisme sel-sel asalnya pertama kali

dikenal pada tahun 1957 melalui studi mengenai biosynthesis nukleotida pada

bakteri E. coli yang terinfeksi oleh bacteriophages seri T-T2, T4, dan T6. G.R.

Wyatt dan Seymour Cohen pada tahun 1952 memperlihatkan bahwa dalam DNA

virus-virus tersebut tidak terdapat cytosine, tetapi 5-hydroxymethylcytosine,

dimana sebagian besar kelompok hydroxymethyl telah dimodifikasi lebih lanjut

dengan masuk pada ikatan glycosidic dengan sebagian glukosa.

Semi QUE V-2004 80

Page 44: BAB III Met as Nukleat

Penelitian yang berkelanjutan menunjukkan bahwa infeksi virus menyebabkan

sintesa enzim-enzim yang berasala dari virus (dikode oleh gen virus),

menghasilkan modifikasi-modifikasi tersebut (Gambar 3.23). Enzim utama pada

bakteri yang terinfeksi phage (faga) seri T termasuk dCTPase, yang membelah

dCTP menjadi dCPM; suatu hydroxymethyl dCMP, yang mentransfer sekelompok

karbon-satu ke dCMP pada tingkat oksidasi hydroxymethyl; dan suatu kinase

deoksiribonukleotida monofosfat, yang dapat mem-phosphorylasi hasil 5-

hydroxymethyl-dCMP. Fosforilasi 5- hydroxymethyl-dCMP menjadi trifosfat

dikatalisasis oleh kinase difosfat dari sel inang atau sel inti. Reaksi glukosilasi

terjadi setelah asam nukleat yang termodifikasi disatukan (direkombinasikan)

kedalam DNA. Pada bakteri yang terinfeksi phage T4 terjadi dua reaksi

glucosyltransferasi (pentransferan glukosa), salah satunya mentransfer glukosa

dengan konfigurasi α dan satunya dengan konfigurasi β. Sebagai tambahan,

genom viral mengekspresikan beberapa enzim deoksiribonuklease, khususnya

sebagai pembelah DNA yang berisi cytosine. Proses ini membantu virus untuk

menghapuskan ekspresi dari gen-gen sel inti, dan juga memberikan suatu sumber

utama bagi sintesa DNA virus yang baru.

Meskipun penggantian basa dalam DNA agak tidak biasa, sekitar selusin contoh

saat ini telah berhasil, dimana satu dari empat deoksiribonukleotida umum

diganti, secara keseluruhan atau sebagian, dengan zat kimia turunan yang

menahan pasangan basa yang khusus dari nukleotida yang digantikan. Sebagai

contohnya, phage Bacillus subtilis, menggantikan uracil bagi thymine dalam

DNA.faga Bacillus subtilis lainnya memerlukan 5-hydroxymethylluracil untuk

menggantikan thymine. Phage Xanthomonas oryzae menggantikan 5-

hydroxymethylluracil untuk setiap residu DNA cytosine-nya. Dalam setiap kasus

yang diteliti, virus mengatur modifikasi nukleus melalui sintesa dari enzim-enzim

yang dikodekan virus, sehingga menciptakan cara metabolis yang baru dalam sel

yang terinfeksi.

Pada virus-virus tanaman dan hewan tidak terdapat bentuk modifikasi dasar asam

nukleat seperti yang ditemukan dalam bacteriophage. (Kebanyakan organisme

mengandung dasar asam nukleat yang dimethylasi dengan proporsi yang cukup

signifikan, tetapi modifikasi tersebut terjadi setelah polymerisasi). Namun, enzim-

enzim yang dikode virus jarang sekali diproduksi untuk membantu sel yang

terinfeksi untuk memperbanyak sintesa asam nukleat yang sebelumnya. Pada

Semi QUE V-2004 81

Page 45: BAB III Met as Nukleat

beberapa kasus, enzim-enzim suatu virus cukup berbeda dengan enzim sejenis

pada sel inangnya di mana para peneliti dapat mendesain inhibitor enzim tertentu

dan kemudian dengan sukses akan mencapai kemoterapi tertentu untuk melawan

sel yang terinfeksi virus.

Gambar 3.23 Infeksi menyebabkan enzim-enzim yang dikode oleh gen virus mengalami modifikasi.

Contoh terbaru yang terbaik adalah penggunaan acyclovir dan turunannya,

ganciclovir, untuk melawan infeksi virus herpes. Virus herpes adalah virus DNA

yang besar, di mana genome-nya mengkodekan beberapa enzim, termasuk

deoksipirimidin kinase. Aslinya enzim ini ditemukan sebagai suatu thymidine

kinase, enzim tersebut juga mem-phosphorylasi-kan dTMP. Namun yang lebih

penting lagi adalah penentuan dasar secara ekstrim dari aktifitas enzim kinase

tersebut. Analog 5-iododeoksiuridine thymidine, yang digunakan untuk

mengobati simplex herpes pada infeksi mata, telah di-phosphorylasi oleh

Semi QUE V-2004 82

Page 46: BAB III Met as Nukleat

deoxypirimidin kinase dan digabungkan ke thymidylate pada DNA. Akhir-akhir

ini, acyclovir (juga dinamakan acycloguanosine) dan anggota ganciclovir,

ternyata juga terbukti telah di-phosphorylasi oleh kinase-kinase virus

deoksipirimidin, meskipun kinase-kinase tersebut adalah analog dari suatu purin

nukleotida, yaitu deoksiguanosin.

Acyclovir dan ganciclovir keduanya saat ini digunakan untuk pengobatan optikal

dan sistematis bagi infeksi viral herpes. Ketiga analog tersebut pada akhirnya

diubah menjadi 5’-triphospate, yang akan bercampur dengan tiruan atau replikasi

DNA. Sel-sel yang tidak terinfeksi tidak akan ter- phosphorylsi-kan acyclovir dan

gancyclovir secara efektif dan akan mem- phosphorylasi-kan dengan lemah

iododeoksiuridine, sehingga replikasi atau tiruan DNA dan pertumbuhan virus

secara selektif akan terhalangi pada sel-sel yang terinfeksi.

H. PENTINGNYA ANALOG-ANALOG NUKLEOTIDA YANG LAIN BAGI

BIDANG BIOLOGI DAN KEDOKTERAN

Contoh terdahulu yang disampaikan telah memperjelas kegunaan analog-analog

nukleotida dan nukleotida, terutama sebagai obat-obatan. Pada bagian ini kita

akan membahas analog tambahan dari pentingnya bidang medis, sebagaimana

seperti yang digunakan pada penelitian reaksi. Nukleotida kurang baik untuk

dipindahkan ke dalam sel karena muatan fosfat negatifnya sehingga kebanyakan

senyawa akan dimasukkan ke dalam sel sebagai nukleotida atau turunan

nukleotida, dimana nukleon-nukleon tersebut sebelumnya bereaksi sebagai

nukleotida kinase Setelah secara cepat berubah menjadi nucleutida-nicleotida,

senyawa-senyawa tersebut mengganggu metabolisme dengan berbagai cara. Pada

bagian ini kita akan menggunakan istilah analog-analog nukleotida dan analog-

analog nukleotida secara berbalik.

1. Analog-analog Nukleotida sebagai agen-agen Kemoterapi

Enzim-enzim pada sintesa nukleotida secara luas telah dipelajari sebagai tujuan

bagi aktifikas antiviral atau obat-obatan anti mikrobial. Sebagaimana telah

dibahas terdahulu, tujuannnya adalah untuk mengenali perbedaan biokimia antara

Semi QUE V-2004 83

Page 47: BAB III Met as Nukleat

proses-proses yang dapat dibedakan dari sel inang yang tidak terinfeksi dan yang

terinfeksi.

a. Analog-Analog Nukleosida sebagai anti virus

Salah satu dari obat-obatan antiviral lama yang disetujui penggunaannnya

terhadap manusia adalah arabinosyladenine (araA). Pada saat ini digunakan

untuk mengobati radang otak (encephalitis), suatu penyakit neurological yang

disebabkan oleh anggota dari keluarga herpesvirus. Tidak seperti

acycloguanosine, araA di- phosphorylasi-kan ke tingkat triphospate oleh kinase-

kinase selular. Triphospate, araATP, adalah suatu inhibitor DNA polymerase

yang selektif, yaitu hanya aktif pada enzim yang dikodekan dengan virus-virus

herpes. Jadi araA secara selektif akan bercampur dengan replikasi viral DNA,

meskipun semua sel baik yang terinfeksi maupun yang tidak, membentuk

triphospate. Karena araA rentan terhadap penurunan oleh enzim adenosine

deaminase, keefektifannya dapat ditingkatkan jika diatur dengan inhibitor enzim

yang terakhir. Analog arabinose deoksicytidine, yaitu arabinosylcytosine (araC),

digunakan pada kemoterapi kanker. araCTP juga bercampur dengan replikasi

DNA setelah konversi menjadi triphospate.

Analog-analog lain yang mendapatkan perhatian yang sungguh-sungguh adalah

analog-analog yang digunakan untuk memerangi acquired immune deficiency

syndrome (AIDS) yang disebabkan oleh HIV. Salah satu analog tersebut, 3’-

azido-2’, 3’-dideoksithymidine (AZT) dianabolisasikan menjadi 5’triphospate

yang bersangkutan, yang merupakan inhibitor bagi enzim virus yaitu reverse

transcriptase (enzim yang membuat kopi DNA dari RNA virus). Analog-analog

nukleotida lainnya-2’,3’-dideoksicytidine (ddC), 2’, 3’-dideoksiinosine (ddI), 3’-

thiacytidine (3TC), dan 2’, 3’-didehydro-3’-deoksithymidine (d4T)- bertindak

sebagai pembalik bagi triphospate yang berhubungan, yang akan bergabung ke

dalam DNA yang selanjutnya akan menghalangi sintesis pemanjangan rantai lebih

lanjut karena tidak adanya suatu ujung akhir 3’ hydroxyl. Keempat analog

tersebut telah disetujui penggunaannya untuk mengobati infeksi HIV pada

manusia dan baik AZT maupun 3TC merupakan komponen dari tiga-obat

“koktail” yang baru-baru ini dipercaya sebagai pengurang infeksi jangka panjang,

sepanjang dengan inhibitor protease HIV.

Semi QUE V-2004 84

Page 48: BAB III Met as Nukleat

Pada akhir tahun 1994, dua laboraturium melaporkan efek sinergistik dari ddI dan

hydroxyurea terhadap infeksi HIV, dianggap sebagai sel yang hampir mati dari

dNTP untuk transkripsi balik (lihat Gambar 3.45).

b. Salvage Purin Sebagai Target

Suatu anomali biokimia penting ditemukan dalam protozoa-protozoa parasit

seperti Plasmodium, yang menyebabkan malaria dan Leishmania, yang

menyebabkan penyakit yang menginfeksi kulit dan organ-organ dalam, sehingga

melemahkan, meskipun biasanya tidak fatal. Protozoa-protozoa parasit

mengurangi kapasitas dari sintesa de novo purin dan sangat tergantung pada

nukleotida-nukleotida yang dapat disalvage pada tempat-tempat yang disediakan

oleh sel ianangnya. Senyawa seperti allopurinol dan formycin B menghalangi

pertumbuhan organisme, sebagian melalui aktivitas inhibitor enzim-enzim yang

bertahan dan sebagian lagi melalui kemampuan enzim yang bertahan untuk

menganabolisi analog, atau melalui kurangnya kemampuan dalam rumah emzim

yang berkaitan. Sebagai contoh, allopurinol dirubah menjadi analog asam inosinat

dan selanjutnya menjadi suatu analog AMP dan akhirnya bergabung kedalam

RNA, dimana allopurinol tersebut mengganggu pengantar pengkodean RNA

(tRNA) dalam sintesa protein.

Penghalang nukleotida yang bertahan dapat lebih efektif jika analog dilakukan

bersama penghalang perpindahan nukleotida. Pada sel binatang protein tunggal,

pemindah nukleotida, bertanggung jawab terhadap percepatan berbagai macam

nukleotida. Fungsi protein ini dihalangi oleh dipyridamole, yang menghalangi

perbanyakan nukleotida.

c. Folate Antagonis

Pada bab terdahulu kita mengetahui bahwa suatu asam folat analog yaitu

methotrexate sudah ditemukan beberapa waktu lalu untuk meningkatkan remisi

(penyembuhan) pada leukimia akut tertentu. Apakah dasar dari pemilihan ini?

Dengan adanya kofaktor folate yang memerankan peranan yang penting dalam

menyatukan DNA, RNA, protein, dan phospholipid, kita mengharapkan

penghalangan untuk sintesa tetrahydrofolate untuk menjadi racun (toxic) bagi

semua sel. Namun terdapat alasan bagi racun folate antagonis tertentu terhadap

Semi QUE V-2004 85

Page 49: BAB III Met as Nukleat

perkembangbiakan sel-sel. Ingat bahwa reaksi sintesa thymidylate megoksidasi

methylenetetrahydrofolate menjadi hydrofolate; ini adalah satu-satunya reaksi

yang membutuhkan tetrahydrofolate yang tidak menimbulkan tetrahydrofolate.

Dari reaksi yang ditunjukkkan pada Gambar 3.18, dapat diprediksi bahwa

penghambat penurunan hydrofolate menghalangi perputaran hydrofolate kembali

menjadi tetrahydrofolate. Dalam proses tersebut, tingkatan dimana seluruh

intrasel yang mereduksi folate menjadi dioksidasi secara langsung duhubungkan

dengan aktifitas intrasel dari thymidylate sintase, dimana selanjutnya diselaraskan

dengan tingkatan sintesa DNA. Jadi, sel-sel yang berkembangbiak, dengan

tingkatan replikasi DNA yang cepat, akan menghabiskan penyimpanan

tetrahydrofolate-nya dengan lebih cepat daripada sel-sel yang tidak

berkembangbiak.

Meskipun antimetabolis seperti flourouracil atau methotrexate menyerang

jaringan yang berkembangbiak secara selektif, antimetabolis tersebut juga

merupakan racun bagi sel-sel yang normal. Efek yang merusak terlihat pada

jaringan yang berkembangbiak sebagai bagian dari fungsi normalnya; jaringan-

jaringan tertentu tersebut termasuk intestinal mucosa, sel-sel rambut, dan

komponen-komponen sistem kekebalan. Hal yang juga dianggap serius adalah

pengembangan sel-sel yang berbeda yang bersifat melawan obat. Pada kasus

tertentu, tingkatan enzim target meningkat melebihi tahapan yang dapat dikontrol

dengan inhibitor. Robert Schimke beserta rekan meneliti mekanisme peningkatan

enzim, yang menyebabkan penurunan dihydrofolate, yang bisa mencapai beratus-

ratus kali dalam garis sel yang melawan methotrexate. Mereka menemukan

bahwa inkubasi sel yang diperpanjang pada media yang mengandung

methotrexate sering kali menyebabkan penguatan pada gen tertentu yang

dikodekan, sehingga dihydrofolate menurun; jumlah dari tiruan atau copy DNA

dari gen ini meningkat berkali-kali, dengan akumulasi atau penimbunan yang

sesuai dari produk gen, menyebabkan dihydrofolate menurun. Mutasi penahan

lainnya melibatkan mekanisme yang lebih konvensional, seperti perubahan

perpindahan dari obat di dalam sel atau perubahan enzim target, untuk membuat

perlawanan pada antimetabolite.

Semi QUE V-2004 86

Page 50: BAB III Met as Nukleat

Tingkatan penghalang penurunan dihydrofolate lainnya ditunjukkan oleh

trimethoprim. Senyawa ini merupakan penghalang penurunan dihydrofolate

tertentu dari sumber prokaryot. Trimethoprim dan kerabatnya secara luas

digunakan untuk mengobati infeksi yang disebabkan bakteri dan beberapa jenis

malaria. Keberhasilan obat ini diperoleh dari aktivitanya sebagai penghalang yang

sangat lemah dari penurunan hydrofolate vertebrata. Trimethoprim sering kali

digunakan sebagai tambahan bagi obat sulfonamide untuk menghambat synthesis

folate dan untuk menghalangi langkah berurutan berikutnya, dengan cara yang

sama.

2. Analog Nukleotida dan Mutagenesis

Beberapa analog nukleotida merupakan mutagen yang sangat bagus, yang

berguna baik dalam mengisolasi mutan dan dalam mempelajari mekanisme

mutagenesis. Dua dari analog tersebut adalah 2-aminopurin (2AP) dan 5-

bromodeoksiuridine (BrdUrd). 2-aminopurin digabungkan dengan DNA untuk

menggantikan adenine, tetapi jika 2AP bermuatan replikan template (tiruan pola),

analog tersebut akan berpasangan dengan cytosine daripada dengan tymine. Jadi

penggabungan 2AP merubah pasangan A-T dalam DNA menjadi Pasangan G-C

(Gambar 3.24).

Bromodeoksiuridine berfungsi sama tetapi memiliki kegunaan yang lain. Ini

merupakan analog thymidine yang sangat bagus karena radius van deer Waals

atom bromine mendekati radius dari kelompok methyl. Karenanya sangatlah

efesien untuk menggabungkannya dalam DNA. Kesalahan memasangkan BrdUrd

dengan residu deoksiguanosine pada replikasi BrdUrd yang berisi template dapat

menyebabkan mutagenesis dengan merubah pasangan dasar A-T menjadi G-C

(lihat Gambar 3.24). Alternatifnya, BrdUTP dapat bersaing dengan dCTP untuk

digabungkan dengan lawan G dalam template (tidak diperlihatkan).

Karena bromine lebih berat daripada kelompok methyl, bromine akan

memberikan suatu densitas yang meningkat bagi DNA yang digantikan.

Akhirnya, para radiobiologi menggunakan BrdUrd sebagai suatu agen

radiosensitizing. Residu bromo-dUMP dalam DNA dicampur bromine dengan

cepat jika DNA yang digantikan jika disinari dengan sinar UV. Proses ini akan

Semi QUE V-2004 87

Page 51: BAB III Met as Nukleat

memunculkan radikal-radikal bebas yang akan menyebabkan berbagai jenis

kerusakan dalam struktur DNA.

Gambar 3.24 Kesalahan pemasangan BrdUrd dengan residu deoksiguanosina pada replikasi BrdUrd dapat menyebabkan mutagenesis, pasangan dasar A-T berubah menjadi G-C.

Akhir-akhir ini perhatian terfokus pada analog nukleotida mutagenik yang

terbentuk dalam metabolisme yang normal. Pada Bab selanjutnya kita mengetahui

bahwa tekanan oxidative - contohnya yang dimunculkan dengan memperlakukan

sel-sel dengan hydrogen proxide – akan merusak struktur dasar DNA. Oksidasi

sisa-sisa guanine dalam DNA menjadi 8-oxoguanine akan bermutagenis dengan

sangat kuat karena pasangan dasar 8-oxoguanine selama replikasi dengan adenine

sama efesiennya seperti jika dipasangkan dengan cytosine. Ketidaktepatan

pembentukan pasangan ini dapat menyebabkan mutasi dengan merubah pasangan

dasar G-C menjadi T-A.

Akhir-akhir ini sebuah enzim ditemukan yang dapat meng-hydrolisis secara

khusus nukleotida 8-oxo-dGTP menjadi 8-oxo-dGMP plus pyrofosfa. Mutasi

yang tidak mengaktifkan enzim ini yang memiliki mutator phenotype,

Semi QUE V-2004 88

Page 52: BAB III Met as Nukleat

menyatakan bahwa suatu cara mutagenis yang signifikan memerlukan oxidasi

guanine nukleotida menjadi nukleotida-nukleotida 8-oxoguanine, diikuti dengan

penggabungannya kedalam DNA dan mutagenesis oxidative tersebut

diminimalisasikan oleh gangguan pada 8-oxo dGTP sebelum penggabungan dapat

dilakukan.

2. Enzim-Enzim Pemetabolisi Nukleotida Sebagai Penanda Genetik yang

Dapat Diseleksi

Karena hampir semua sel dapat men-sintesa nukleotida secara de novo, maka

enzim-enzim dari senyawa yang dapat disalvage biasanya tidak penting bagi

kelangsungan hidup sel. Lebih lanjut, seperti yang kita ketahui, terdapat banyak

inhibitor dari emzim-enzim tersebut. Maka dari itu, enzim-enzim yang

memetabolisi nukleotida serta gen yang mengkodekannya memberikan penanda

genetik tertentu, yang memiliki berbagai kegunaan. Seperti yang dinyatakan pada

istilah tersebut, kita dapat mengatur kondisi pertumbuhan sedemikian rupa

sehingga hanya sel-sel yang kekurangan enzim tertentu atau yang mengandung

enzim tertentu, yang dapat tumbuh. Sebagai contoh, 6-thioguanine adalah analog

purin yang di-metaboliskan oleh HGPRT menjadi racun lanjutan. Sifat sel pada

media yang berisi thioguanine membolehkan pertumbuhan hanya pada sel yang

kekurangan HGPRT aktif, sedamgkan yang tak kekurangan enzim itu tidak akan

tumbuh.

Hal yang sama dapat dilakukan, misalnya seseorang dapat mengisolasi sel-sel

yang kekurangan thymidine kinase (TK), yaitu dengan jalan memilih sel yang

phenotypenya bersifat tidak melawan bromodeoksiuridine, karena jika ada TK,

maka enzim itu akan aktif untuk menganabolis BrdUrd. Tetapi anabolisme

BrdUrd menyebabkan terjadinya sebuah racun anabolit, yang akan membunuh

sel. Jadi, kita dapat mengukur tingkatan mutasi selanjutnya dengan meneliti

munculnya phenotype-phenotype yang melawan suatu obat.

Dengan tanda atau cara yang sama, kita dapat menentukan mutasi dengan arah

yang sebaliknya dengan menambahkan kondisi aslinya, sehingga kapasitas sintesa

yang disalvage penting bagi kelangsungan hidup sel. Suatu teknik yang umum,

baik dalam analisa genetis sel somatis dan dalam mempersiapkan antibodi

monoclonal, adalah fusi sel. Dua jenis sel dari organisme yang berbeda

Semi QUE V-2004 89

Page 53: BAB III Met as Nukleat

dicampurkan dengan kondisi dimana salah satunya dapat berfusi secara fisik,

menghasilkan dua nuclei yang berbeda dalam satu citoplasma. Kita dapat memilih

hybrid sel tersebut dengan menambahkan kondisi dasar sedemikian rupa sehingga

hanya sel hybrid yang akan tumbuh dalam media HAT (media dasar sel

normal bertambah banyak dengan hypoxanthine, aminopterin, dan thymidine).

Aminopterin menghalangi penurunan dihydrofolate dan selanjutnya menghalangi

sintesa purin de novo dan sintesis thymidylate. Sel-sel dapat bertahan hanya jika

sel tersebut memiliki HGPRT aktif untuk menggunakan hypoxanthine bagi

sintesa purin dan timidilat kinase (TK) untuk mengubah thymidine bagi sintesa

thymidylate.

Gen-gen dengan phenotype yang dapat dipilih menggambarkan pentingnya

penggunaan teknologi rekombinan DNA untuk memasukkan materi genetis yang

baru pada sel-binatang, tanaman, dan mikrobia- sehingga kita dapat memasukkan

molekul-molekul rekombinan DNA yang mengandung sebuah penanda tertentu

bersamaan dengan gen target. Dengan mengatur kondisi pertumbuhan sel-sel

tertentu, selanjutnya hanya akan menumbuhkan sel yang telah mendapatkan gen-

gen target. Besarnya minat terhadap pendekatan ini akan dijelaskan dalam laporan

yang terbaru tentang pengobatan pada tumor otak berikut. Suatu rekombinan

DNA yang mengandung gen pengkode enzim deoksipirimidin kinase yang telah

berada pada virus herpes simplex telah diinjeksikan pada tumor. Pada binatang

percobaan, sel yang berkembangbiak (tumor) diambil dan digantikan dengan

DNA ini. Setelah beberapa hari, hewan tersebut diberi obat ganciclovir, yang

dengan selektif akan membunuh sel tumor karena adanya phosphorilasi obat

dalam sel-sel tersebut.

I. RANGKUMAN

Nukleotida- Nukleotida ada di dalam sel-sel karena kerusakan asam nukleat, atau

dari penggunaan kembali (atau penyelamatan) nukleotida, yang dibentuk kembali

oleh biosintesa de novo. Purin nukleotida dibentuk pada tahapan nukleotida,

dengan 10 tahap yang mengubah PRPP menjadi asam inosinat. Selain itu, ada

cara yang berbeda untuk menjadikan adenine menjadi nukleotida guanine.

Katabolisme purin menghasilkan asam urat, suatu senyawa yang tidak dapat larut

Semi QUE V-2004 90

Page 54: BAB III Met as Nukleat

yang menyebabkan berbagai penyakit. Basa pirimidines disintesa secara de no vo,

yang akhirnya diubah menjadi nukleotida. Jalur sintesa pirimidin tidak bercabang

dan akan menuju ke UTP dan CTP. Pada kebanyakan organisme, ribonukleotida

difosfat disubstitusikan untuk mereduksi gula ribose secara in situ, menghasilkan

deoksi ribonukleosida difosfat, yang pada gilirannya akan diubah menjadi empat

macam dNTP DNA. Reduksi ribonukleotida merupakan tempat pengendalian,

karena menggambarkan reaksi metabolis pertama untuk memasukai sintesa DNA.

Biosintesa nukleotida timin melibatkan perpindahan gugus methylene dari 5,10-

methylene tetrahydrofolate (THF) ke suatu nukleotida deoxyuridine, yang diikuti

dengan reduksi gugus methylene. Reaksi-reaksi biosintesa deoksiribonukleotida

merupakan target utama bagi inhibitor enzim yang telah digunakan sebagai obat-

obatan anti kanker, antimikroba, antiviral, dan anti parasit. Analog-analog

nukleotida yang lainnya juga telah digunakan sebagai reagen penelitian,

misalnya, dalam penelitian mutagenesis atau sebagai label-label (penanda)

densitas DNA.

J. SOAL-SOAL LATIHAN

1. Asam nukleat dibangun dari 4 macam unsur, unsur apa saja itu dan dari

senyawa apa saja masing-masing unsur-unsur itu berasal?

2. Pada sel organisme, baik nukleotida purin maupun pirimidin dapat disintesis

melalui dua macam jalur yang berbeda, yaitu jalur ‘de novo’ dan jalur

‘salvage’. Apa maksud kedua istilah itu dan kapan atau bilamana masing-

masing jalur itu ditempuh?

3. Degradasi nukleotida purin pada mamala sering menimbulkan masalah, tetapi

tidak pada burung, ikan maupun moluska? Jelaskan mengapa?

4. Penyakit gout atau rematik disebabkan oleh ‘hyperurecemia’, apa maksudnya?

Ada tiga macam cacat enzimatik yang dapat menyebabkan penyakit itu, cacat

apa saja itu dan bagaimana masing-masing dapat menyebabkan

hiperurecemia?

Semi QUE V-2004 91

Page 55: BAB III Met as Nukleat

5. Untuk mengatasi hiperurecemia telah didesain suatu obat yang disebut

allopurinol. Dengan melihat pada struktur allopurinol dan jalur degradasi

nukleotida purin, jelaskan dengan ringkas mekanisme kerja obat tersebut.

6. Cacat enzimatik pada metabolisme nukleotida purin, juga dapat

menyebabkan dua macam penyakit yang fatal yaitu imunodefisiensi dan

Lesch – Nylian Syndrom.

a. Enzim apa yang bermasalah pada masing – masing penyakit tersebut dan

bagaiman hal itu dapat menyebabkan penyakit diatas.

b. Bagaimana kedua penyakit tersebut dapat dideteksi sejak dini?

7. Pada tahun 1995 Chlaporan ditemukannya dua gadis yang terdeteksi terkena

imunodefisiensi di atas (no 6), kemudian mengalami terapi gen dengan teknik

rekombinan DNA dengan bantuan virus. Setelah menjalani terapi selama 3

tahun, kedua gadis tersebut dinyatakan sembuh.

a. Bagaimana tahapan terapi gen tersebut?

b. Mengapa terapi tersebut memerlukan waktu yang demikian lama untuk

penyembuhannya?

8. Ada dua perbadaan prinsip antara biosintesis nukleotida purin dengan

nukleotida pirimidin, jelaskan dengan singkat kedua perbedaaan tersebut.

9. Jelaskan aktivitas enzim – enzim berikut, termasuk subtrat dan produk

reaksinya.

a. Endonuklease d. Nukleosida kinase

b. Fosfodiesterase e. ATCase

c. Fosforilase f. rNDP reduktase

10. Di dalam sel, umumnya ribonukleotida lebih banyak 5 sampai 10x

dibandingkan dengan deoksiribonukleotida. Jelaskan dengan dua alasan

pokok, mengapa demikian adanya?

11. Untuk membentuk keempat macam deoksiribonukleotida dari ribonukleotida

ada dua macam perubahan prinsip yan harus terjadi. Perubahan apa saja itu

Semi QUE V-2004 92

Page 56: BAB III Met as Nukleat

dan enzim apa yang terlibat dan bagaiman persamaan reaksi masing – masing

perubahan itu?

12. rNDP reduktase yang berasal dari E.Coli telah berhasil diisolasi dan

dimurnikan dan bahkan dikristalkan sehingga dapat dianalisis dengan difraksi

sinar x. Hasilnya diketahui bahwa enzim ini mempunyai sisi aktif dan sisi

spesifik.

a. Apa fungsi dari keduan macam sisi enzim itu?

b. Perubahan apa saja yang terjadi pada enzim saat berperan sebagai katalis.

c. Kemana larinya atom O ribose ketika berubah menjadi dioksiribose, dan

dari mana elektronnya berasal?

d. Mekanisme apa yang terjadi pada enzim sehingga dapat kembali ke

bentuk semula.

13. Untuk menjelaskan keberadaan dan keragaman makhluk hidup seperti yang

ada pada saat ini ada dua teori yaitu teori evolusi dan teori kreasi. Atas dasar

pengetahuan biokimia, terutama metabolisme asam nukleat, teori mana yang

lebih sesuai denga logika, jelaskan!

Semi QUE V-2004 93