BAB III Biokimia dan Biologi...

Integrasi Biokimia dalam Modul Kedokteran (Endah Wulandari & Laifa Annisa Hendarmin) pg. 60

BAB III Biokimia dan Biologi Molekuler


A. IKATAN KIMIA

Ikatan Kimia

Struktur asam amino dan peptida memiliki ikatan-ikatan kimia yang mestabilkan struktur protein dan membran. Ikatan Kimia dalam Protein meliputi ikatan kovalen, ikatan hidrogen, interaksi elektrostatik, ikatan Van der Waals dan ikatan hidrofobik.

Ikatan Kovalen merupakan “sharing” elektron antara 2 atom untuk melengkapi kulit elektron. Dalam ikatan karbon-karbon elektron memiliki bersama 2 atom. Ikatan bersifat non-polar yang terdiri atas : a. Pada protein terdapat ikatan antara gugus Cα asam amino yang satu dengan gugus NH2

atom Cα yang saling membentuk ikatan peptida, ikatan peptida membentuk struktur primer yang kuat.

b. Ikatan Bisulfida (-S-S-) yang terbentuk pada waktu protein melipat membentuk konformasi alamiahnya serta berfungsi menstabilkan bentuk 3-dimensi.

Gambar 3A.1 Struktur Ikatan Peptida

Ikatan hidrogen merupakan ikatan yang terdapat dalam molekul air. Atom dimana

hidrogen lebih terikat erat disebabkan donor hidrogen atom serta yang satunya aseptor hidrogen. Donor hidrogen meliputi atom O atau N yang terikat secara kovalen pada atom H. Akseptor hidrogen atom O dan H. Ikatan hidrogen ini tidak hanya berperan dalam molekul air, juga berperan dalam molekul protein, DNA, alkohol. Ikatan hidrogen ini menyebabkan terbentuknya heliks-α dan lipatan. Ikatan hidrogen anatara gugus amida dan gugus luar bermoleku heliks-α. Keluatannya tergantung jarak donor H dan akseptor H, paling kuat jaraknya sekitar 2,7 Ao dan 3,1 Ao. Relatif lemah, karena jumlahnya lebih berperan pada stabilitas konformasi protein, sehingga bukan yang utama. Pada saat terjadinya denaturasi ikatan hidrogen dapat putus.


Gambar 3A.2 Ikatan hidrogen

Ikatan elektrostatik yaitu ikatan ionik, merupakan jembatan garam atau pasangan ion. Antara gugus bermuatan (dari rantai samping asam-amino dalam protein). Dapat saling tarik-menarik/tolak-menolak membentuk muatan bertolak menolak atau sama. Penting untuk stabilitas protein. Berperan dalam pengikatan ligan/substrat. Ikatan paling kuat pada K.cad Volum (D=1), makin polar medium, D makin meningkat, ikatan paling lemah dalam air (D = 80).

Ikatan Van der Waals, memiliki kekuatan tarik-menarik non-spesifik antara 2 atom yang berjarak 3Ao – 4Ao. Dapat disebabkan berubahnya distribusi muatan e_ desekeliling atom pada tiap saat. Distribusi muatan e_ yang tidak sama akan menyebabkan distribusi muatan e_ yang tidak sama pula pada atom dari dekatnya, sehingga timbul kekuatan tarik menarik/tolak menolak. Ikatan van der waals lemah dan nonspesifik, kurang penting dibandingkan ik.elektrostatik/ikatan hidrogen.

Ikatan hidrofobik merupakan ikatan non-kovalen yang menyebabkan polipeptida melipat membentuk konformasi yang alamiah. Ikatan hidrofobik ini berperan pula pada pengikatan substrat-enzim, pembentukan membran. Bukan karena tarik-manarik antara gugus non-polar, tapi lebih disebabkan oleh sifat pelarut air. Molekul air sangat tersusun rapi dan banyak ikatan hidrogen, masuknya gugus non-polar akan merusak struktur air, gugus non-polar tidak dapat mendonorkan/menerima hidrogen, sehingga molekul air pada permukaan “rongga” berisi gugus non polar, tidak membentuk ikatan peptida. Bila usaha untuk mengatasi kehilangan ikatan hidrogen air permukaan “rongga” menyesuaikan diri membentuk jaringan ik Hidrogen yang melapisi “rongga” diperlukan senyawa non-polar dikeluarkan dari molekul air


Gambar 3A.3 Ikatan hidrofobik

Asam basa dan dapar

Peranan asam amino dan protein dalam sistem dapa yaitu asam amino bersifat asam karena memiliki gugus karboksil bermuatan negatif dan bersifat basa karena memiliki gugus nitrogen yang bermuatan positif.Asam amino non-polar akan bermuatan asam, dalam molekulnya mempunyai kelebihan COO- (muatan negatif) dan basa : dalam molekulnya kelebihan NH3+ . pH dimana muatan netto molekul dalam larutan adalah nol disebut sebagai pH isoelektrik (pI). Pada pH ini molekul disebut zwitterion tidak akan berimigrasi dalam lapangan listrik karena jumlah muatan negatif pada masing-masing molekul setara dengan jumlah muatan positif.

Gambar 3A.4 Asam amino yang bersifat asam dan basa


Gambar 3A.4 pH Isoelektrik

Gambar 3A.4 Perubahan asam amino menjadi asam dan basa

Gambar 3A. Asam amino bentuk terionisasi dan ion dipolar

Struktur sekunder dan tersier protein (protein folding)

Struktur primer protein yaitu urutan asam amino yang terikat secara kovalen dengan

ikatan rantai polipeptida. Struktur sekunder disebabkan penataan partial dari rantai polipeptida dalam 1 dimensi, protein fibrous membentuk konfirmasi spiral, dalam suatu penggal atau segmen protein globulercontohnya kolagen. Struktur tersier terbentuk akibat melipatnya rantai polipeptida dalam 3 dimensi, membentuk struktur kompak, padat dari protein globuler. Struktur kwartener, masing-masing rantai polipeptida mengadakan hubungan satu sama lain, pada protein yang mempunyai > 1 rantai polipeptida.


Gambar 3A.4 Struktur sekunder dan tersier protein : protein folding

Hubungan keragaman protein dengan jumlah jenis asam amino pembentuk protein

antara lain : 1. Kolagen terdiri atas 3 rantai polipeptida (tripel helik), menahan tegangan, 1/3 residu gly 2. Keratin terdiri atas phe, Ile, Val, met, Ala, sistein (ik.SH/sulfhidril) dan cys (s-s) 3. Elastin terdiri atas 1/3 Gly dan 1/3 Ala dan tidak mengandung OH-lys 4. Fibrolin terdiri atas 6 residu berulang ( Gly-Ser- Gly-Ala-Gly-Ala)

Hubungan antara protein dan gen yaitu bila gen mengalami delesi/mutasi, tidak dapat

menghasilkan protein fungsional. Untuk menghasilkan protein spesifik dalam jumlah besar dengan dihasilkan banyak salinan gen, dapat dilakukan amplifikasi gen.

Gambar 3A.5 Amplifikasi gen


Hubungan kodon dan asam amino

mRNA yang menentukan urutan asam amino protein dibaca dalam kodon terdiri atas 3 nukleotida yaitu U,C,A,G. Ada 61 kodon yang menentukan asam amino, ada 2 asam amino yang memiliki 1 kodon (AUG = metionin, UGG = triptofan) dan ada pula asam amino yang lain dibaca lebih dari satu kodon. Kodon pada mRNA dimulai dengan kodon 5’-AUG (metionin) dan diakhiri oleh kodon stop 3’-(UAG, UGA dan UAA).

Sifat umum asam amino pembentuk protein yaitu struktur asam amino standar antara lain mempunyai Cα, C mempunyai 4 gugus terdiri atas H3N, COO-, H, R (variasi). Bila ikatan asam amino lepas akan menghasilkan air, tulang punggung membentuk ikatan peptida. R-gugus samping dan struktur primer menetukan bentuk akhir suatu 3-dimensi.

Konsep struktur protein dalam berbagai tingkat sebagai hasil interaksi antara berbaga asam amino penyusun protein di dalam molekul protein. Protein dengan fungsi berbeda, selalu memiliki urutan asam amino berbeda. Misal E.coli terdiri atas + 3.000 macam protein dan manusia memiliki + 50.000 -100.000 protein. Tiap macam protein akan mempunyai struktur unik, fungsi yang unik serta urutan yang unik.

Hubungan antara struktur dan fungsi protein yaitu modifikasi asam amino dalam protein menyebabkan modifikasi pascatranslasi antara lain :

a. Dihidroksi prolin (terdapat padakolagen yang baru disintesis, dibentuk dari hidroksilasi prolin, hidoksilasi bersifat menstabilkan kolagen, bila terganggu (defisiensi Vitamin C) menyebabkan terganggu pembentukan kolagen

b. ɣ-karboksiglutamat, terdapat dalam protrombin, protein pembekuan darah, pada Defisiensi vitamin K , terganggu karboksilasi glutamat akan menimbulkan perdarahan

c. Hidroksi lisin terdapat dalam kolagen d. d. N-metil lisin dan metil Histamin terdapat dalam protein otot e. Desmosin dan isodesmosin terdapat dalam elastin, berasal dari 4 mol Lys dengan R

membentuk piridin, memungkinkan mengikat 4 rantai polipeptida, elastin dapat direnggangkan dalam 2 arah Asam amino bukan penyusun protein memiliki fungsi khusus. Ada > 150 asam amino

terdapat dalam bentuk bebas/ berikatan dengan molekul lain, dan tidak ditemukan dalam protein. Sebagian besar derivat asam amino L-α, ada juga derivat asam amino β,ɣ,δ

a. β-alanin merupakan “building Block” vit. Asam pantotenat merupakan bagian dari koenzim A

b. ɣ-amino butirat (GABA) merupakan hasil dekarboksilasi glutamat serta merupakan “neotransmitter” dalam impuls saraf

c. Histamin hasil dekarboksilasi histidin sebagai mediator reaksi alergi Konsep “denaturasi”

Protein dalam bentuk alamiah “native protein” berada dalam bentuk yang stabil

Setiap perubahan struktur protein alamiah denaturasi dapat terjadi pada struktur sekunder, tersier, kuartener desebabkan oleh :

1. Seng Kaotropik (Chaotropic agent) 2. Detergen


3. Suhu 4. Asam alkali 5. Reduksi ikatan S-S

Konsep “denaturasi” yaitu seng Kaotropik (Chaotropic agent), dimana urea guanidin

HCl pada konsentrasi meningkat (4-8 m) menyebabkan denaturasi (mekanisme belum jelas). Diduga urea dan guanidin membentuk ikatan hidrogen tandingan dengan residu asam amino, sehingga ikatan hidrogen dalam molekul protein yang menstabilkan protein rusak, juga mengubah pelarut air, sehingga interaktif hidrofobik melemah. Denaturasi bersifat reversible sebagian atau campuran bila kadar senyawa di turunkan dengan dialisis atau penghancuran.

Konsep “denaturasi” melalui detergen dan suhu, detergen yaitu SDS (sodium dodecyl sulphate) dengan struktur molekul H3C-(CH2)10-CH2OSO3

_ + Na+ mempunyai ujung sangat polar , ujung hidrofobik. SDS terikat erat pada polipeptida menyebabkan protein mempunyai muatan (-). Denaturasi oleh suhu, bila suhu meningkat mendenaturasi sebagian besar banyak protein larut. Biasanya terjadi presipitasi protein karena kerusakan struktur sekunder dan pembentukan agregat.

Denaturasi oleh asam/alkali, protein bersifat polielektrolit amfoter, sehingga perubahan pH yang mempengaruhi ikatan garam yang menguatkan struktur tersier. Denaturasi reduksi ikatan S-S, β-merkaptoetanol (R-SH) mereduksi ikatan S-S dalam protein menjadi 2 gugus (-SH).

Gambar 3A.5 Denaturasi gugus –S-S-


Gambar 3A.6 Denaturasi oleh merkaptoetanol


B. PROTEIN

Protein berasal dari yunani yaitu proteos (oleh Barselius) artinya yang utama/terpenting. Struktur kimia berupa suatu heteropolimer yang tersusun dari berbagai senyawa segolongan yaitu asam amino, terikat melalui ikatan peptida secara kovalen dan terbentuka dari hasil informasi DNA dalam sel.

Definisi protein secara kimia, biologi dan biokimia merupakan hasil ekspresi informasi genetik. Protein memiliki komposisi C, H, N, O,S dan sebagian mengandung P, Fe, Zn, Cu. Bila protein dihidrolisi akan menghasilkan asam amino. Syarat dikatakan asam amino adalah memiliki 1 gugus karboksil (-COOH), 1 gugus amino α (-NH2), 1 gugus R-berbeda untuk tiap asam amino serta antar asam amino terdapat ikatan kovalen yang disebut ikatan peptida.

Gambar 3B.1 Struktur umum asam amino

Asam amino merupakan bahan dasar untuk membentuk protein memiliki sifat fisikokimia protein antara lain BM ratusan dalton – 1.000.000 dalton, wujud berupa larutan, koloid, emulsi dan suspensi. Protein dapat dikristalkan atau tidak dikristalkan. Kelarutan protein dipengaruhi pH/ pH isoelektrik (tiap protein berbeda-beda).

Konsep batu bata penyusun (building block) dan ikatan tulang punggung (backbone baound) dalam penyusunan protein, memiliki syarat asam amino pembuat protein antara lain :

1. Konfigurasi L merupakan syarat biologis 2. Punya kodon dalam asam amino (asam amino yang tidak punya kodon homosistein,

ornitin, sitrulin) 3. Gugus asalnya harus berkarboksilat, COOH (taurin mempunyai gugus S tidak dapat

membuat protein) 4. Gugus COOH dan NH2 ada di Cα (NH2 di β) tidak dapat membuat protein)

Polimerisasi 20 Asam amino dapat membentuk peptida/protein melalui ikatan antara gugus karboksil-α dengan gugus amino-α melalui ikatan peptida (ikatan amida). Unit asam amino dalam polipeptida dimana terdapat gugus NH2 bebas, residu asam amino pada ujung rantai polipeptida dimana terdapat gugus NH2 bebas, residu asam amino terminal (residu N-terminal). Residu asam amino pada ujung dimana terdapat gugus COOH bebas, residu karboksil terminal (residu C-terminal).


Peptida pendek dinamai dengan kandungan asam aminonya, dimulai dari sebelah kiri, di residu N-terminal ke arah karboksil disebelah kanan. Rantai polipeptida terdiri dari bagian berulang yang sama rantai utama (tulang punggung) dan bagian yang berbeda pada rantai samping. Urutan asam amino pada rantai polipeptida dapat menentukan jenis protein, karena menentukan struktur dan menentukan fungsi fisiologis. Urutan asam amino spesifik/khas untuk semua jenis protein tertentu, dapat ditentukan oleh sandi genetik yang terdapat dalam DNA.

Komposisi sama, urutan asam amino berbeda maka protein terbentuk berbeda, kombinasi urutan 20 asam amino bersifat faktorial serta jenis protein yang mungkin dibentuk tidak terbatas. Subsitusi 1 asam amino menentukan fungsi biologis, bila salah maka akan berubah. Contoh struktur Hb dimana glutamin diganti alanin sama-sama struktur polar tetapi fungsi biologis berubah.

Universalisme asam amino penyusun protein sebagai salah satu fenomena universalisme dalam mahluk hidup. Ada 20 asam amino penyusun protein, dengan kodon sama dari semua sumber DNA. Misal UAA adalah asam amino X, baik untuk manusia, virus, bakteri sama.

Tabel 3B.1 Jenis-jenis 20 Asam Amino


Tabel 3B.2 Kodon asam amino

Klasifikasi asam amino, berdasarkan polaritas terdiri atas : 1. Asam amino non-polar/R-hidrofobik 2. Asam amino polar, R-tidak bermuatan 3. Asam amino R muatan (-) pada intrasel pH 6-7 4. Asam amino R muatan (+) pada intrasel pH 6-7

Asam amino non-polar/R-hidrofobik dimana asam amino dengan R-rantai hidrokarbon alifatik, asam amino dengan R Cincin aromatik dan asam amino mengandung S.

Gambar 3B.2 Asam amino non-polar


Asam amino polar, R-tidak bermuatan yaitu bersifat larut dalam air, R dapat mengadakan ikatan hidrogen dengan air, mengandung OH, mengandung gugus amida dan mengandung gugus SH. Asam amino polar terdiri atas Asam amino R muatan (-/asam) pada intrasel pH 6-7. Asam amino R muatan (+/basa) pada intrasel pH 6-7.

Gambar 3B.3 Asam amino polar

Peran protein dalam fungsi fisiologis hidup yaitu antara lain sebagai katalisis enzimatik dalam bentuk protein enzim; sebagai transporter dan molekul penyimpan yaitu dalam bentuk transferin, hemoglobin dan mioglobin; protein koordinasi gerak dalam bentuk aktin-miosin; sebagai protein penunjang mekanis dalam bentuk kolagen pembentuk tulang dan kulit; protein proteksi Imun dalam bentuk antibodi dapat mengenal benda asing dalam tubuh; protein untuk membangkitkan dan menghantar impuls saraf berupa rodopsin peka terhadap cahaya; dan pengaturan pertumbuhan dan deverensiasi berupa pengatur pembentukan hormon.

Aktivitas protein secara umum dalam bentuk interaksi protein-ligand untuk melaksanakan fungsinya sebagai protein yang mengikat bahan/zat lain (ligand). Misalnya antibodi-antigen dan enzim-substrat, ion, koenzim. Kompleks ikatan tersebut menunjukkan ada ikatan asam amino (hidrofobik dan hidrofilik) yang memiliki kemampuan berdasarkan sifat-sifat ikatan asam amino berdasarkan gugus R pada situs aktif. Hal ini merupakan prinsip untuk menentukan teknologi protein.

Hubungan protein spesifik dengan tingkat perkembangan dan deferensial sel, protein dengan urutan asam amino berasal dari asal usul yang sama. Protein homolog yaitu protein yang secara evolusi mempunyai hubungan, biasanya mempunyai fungsi sama pada berbagai species. Misal ubikuisitin yaitu protein yang terdiri atas 76 asam amino berperan dalam pengaturan degradasi protein, memiliki urutan asam amino yang identik, mulai lalat buah


sampai manusia. Pada protein homolog terdapat banyak posisi asam amino ditempati asam amino yang sama pada berbagai species serta memiliki residu tetap (residu invarian).

Gambar 3B.4 Kemampuan protein saling beriktan

Hubungan protein spesifik mulai dengan tingkat perkembangan dan deferensial sel. Pada beberapa posisi terdapat residu variasi (residu variabel). Misal pada sitokrom c merupakan protein mitokondria, yang mengandung Fe dapat mentransfer e- pada reaksi oksidasi biologi dalam eukariota.

Dasar penggunaan pengukuran protein intrasel sebagai dasar untuk mendukung atau menyingkirkan suatu diagnosis penyakit. Perubahan urutan asam amino dapat menggangguan fungsi sehingga menyebabkan penyakit. Ada > 400 penyakit genetik pada manusia disebabkan pembentukan protein yang cacat, terjadi dikarenakan perubahan 1 asam amino dalam urutan asam amino yang lazim dari suatu protein. Contoh anemia sel sabit (Sickell cell anemia), struktur Hb abnormal dewasa (HbS), pada rantai globulin β-residu ke-6 adalah glu berubah menjadi val sifat Hb berubah maka timbul penyakit.

Dasar pemahaman terjadinya “gene rearrangement” dan eksperi proteinnya yaitu pengaturan jenis dan jumlah protein dalam sel, berlangsung dalam transkripsi, pascatranskripsi, translasi dan pascatranslasi. Perubahan dalam jumlah atau struktur gen dapat mempengaruhi jumlah dan jenis protein menyebabkan gen lenyap, meningkatnya jumlah protein, gen tersusun ulang (gene rearrangement) dan modifikasi gen.

Gambar 3B.5 Jenis-jenis mutasi


C. ASAM NUKLEAT

Struktur Molekul

Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan sangat penting dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. Asam nukleat sering dinamakan juga polinukleotida karena tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Tiap nukleotida mempunyai struktur yang terdiri atas gugus fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen atau basa nukleotida (basa N).

Ada dua macam asam nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat atau Deoxyribonucleic Acid (DNA) dan asam ribonukleat atau Ribonucleic Acid (RNA). Dilihat dari strukturnya, perbedaan di antara kedua macam asam nukleat ini terutama terletak pada komponen gula pentosanya. Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa, sedangkan pada DNA gula pentosanya mengalami kehilangan satu atom O pada posisi C nomor 2’ sehingga dinamakan gula 2’-deoksiribosa.

Gambar 3C.1 Struktur Ribosa dan deoksiribosa

Perbedaan struktur lainnya antara DNA dan RNA adalah pada basa N-nya. Basa N, baik pada DNA maupun pada RNA, mempunyai struktur berupa cincin aromatik heterosiklik (mengandung C dan N) dan dapat dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai satu cincin (monosiklik). Pada DNA, dan juga RNA, purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G). Akan tetapi, untuk pirimidin ada perbedaan antara DNA dan RNA. Kalau pada DNA basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T), pada RNA tidak ada timin dan sebagai gantinya terdapat urasil (U). Timin berbeda dengan urasil hanya karena adanya gugus metil pada posisi nomor 5 sehingga timin dapat juga dikatakan sebagai 5-metilurasil. Komponen-komponen asam nukleat


Gambar 3C.2 Basa nitrogen

Di antara ketiga komponen monomer asam nukleat tersebut di atas, hanya basa N-lah yang memungkinkan terjadinya variasi. Pada kenyataannya memang urutan (sekuens) basa N pada suatu molekul asam nukleat merupakan penentu bagi spesifisitasnya. Dengan perkataan lain, identifikasi asam nukleat dilakukan berdasarkan atas urutan basa N-nya sehingga secara skema kita bisa menggambarkan suatu molekul asam nukleat hanya dengan menuliskan urutan basanya saja. Nukleosida dan nukleotida

Penomoran posisi atom C pada cincin gula dilakukan menggunakan tanda aksen (1’, 2’, dan seterusnya), sekedar untuk membedakannya dengan penomoran posisi pada cincin basa. Posisi 1’ pada gula akan berikatan dengan posisi 9 (N-9) pada basa purin atau posisi 1 (N-1) pada basa pirimidin melalui ikatan glikosidik atau glikosilik. Kompleks gula-basa ini dinamakan nukleosida.

Di atas telah disinggung bahwa asam nukleat tersusun dari monomer-monomer berupa nukleotida, yang masing-masing terdiri atas sebuah gugus fosfat, sebuah gula pentosa, dan sebuah basa N. Dengan demikian, setiap nukleotida pada asam nukleat dapat dilihat sebagai nukleosida monofosfat. Namun, pengertian nukleotida secara umum sebenarnya adalah nukleosida dengan sebuah atau lebih gugus fosfat. Sebagai contoh, molekul ATP (adenosin trifosfat) adalah nukleotida yang merupakan nukleosida dengan tiga gugus fosfat. Jika gula pentosanya adalah ribosa seperti halnya pada RNA, maka nukleosidanya dapat berupa adenosin, guanosin, sitidin, dan uridin. Begitu pula, nukleotidanya akan ada empat macam, yaitu adenosin monofosfat, guanosin monofosfat, sitidin monofosfat, dan uridin monofosfat. Sementara itu, jika gula pentosanya adalah deoksiribosa seperti halnya pada DNA, maka (2’-deoksiribo) nukleosidanya terdiri atas deoksiadenosin, deoksiguanosin, deoksisitidin, dan deoksitimidin.


Ikatan fosfodiester

Selain ikatan glikosidik yang menghubungkan gula pentosa dengan basa N, pada asam

nukleat terdapat pula ikatan kovalen melalui gugus fosfat yang menghubungkan antara gugus hidroksil (OH) pada posisi 5’ gula pentosa dan gugus hidroksil pada posisi 3’ gula pentosa nukleotida berikutnya. Ikatan ini dinamakan ikatan fosfodiester karena secara kimia gugus fosfat berada dalam bentuk diester.

Gambar 3C.3 Ikatan fosfodiester (P)

Oleh karena ikatan fosfodiester menghubungkan gula pada suatu nukleotida dengan gula pada nukleotida berikutnya, maka ikatan ini sekaligus menghubungkan kedua nukleotida yang berurutan tersebut. Dengan demikian, akan terbentuk suatu rantai polinukleotida yang masing-masing nukleotidanya satu sama lain dihubungkan oleh ikatan fosfodiester. Kecuali yang berbentuk sirkuler, seperti halnya pada kromosom dan plasmid bakteri, rantai polinukleotida memiliki dua ujung. Salah satu ujungnya berupa gugus fosfat yang terikat pada posisi 5’ gula pentosa. Oleh karena itu, ujung ini dinamakan ujung P atau ujung 5’. Ujung yang lainnya berupa gugus hidroksil yang terikat pada posisi 3’ gula pentosa sehingga ujung ini dinamakan ujung OH atau ujung 3’. Adanya ujung-ujung tersebut menjadikan rantai polinukleotida linier mempunyai arah tertentu.

Pada pH netral adanya gugus fosfat akan menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif. Inilah alasan pemberian nama ’asam’ kepada molekul polinukleotida meskipun di dalamnya juga terdapat banyak basa N. Kenyataannya, asam nukleat memang merupakan anion asam kuat atau merupakan polimer yang sangat bermuatan negatif.


Sekuens asam nukleat

Telah dikatakan di atas bahwa urutan basa N akan menentukan spesifisitas suatu molekul asam nukleat sehingga biasanya kita menggambarkan suatu molekul asam nukleat cukup dengan menuliskan urutan basa (sekuens)-nya saja. Selanjutnya, dalam penulisan sekuens asam nukleat ada kebiasaan untuk menempatkan ujung 5’ di sebelah kiri atau ujung 3’ di sebelah kanan. Sebagai contoh, suatu sekuens DNA dapat dituliskan 5’-ATGACCTGAAAC-3’ atau suatu sekuens RNA dituliskan 5’-GGUCUGAAUG-3’.

Jadi, spesifisitas suatu asam nukleat selain ditentukan oleh sekuens basanya, juga harus dilihat dari arah pembacaannya. Dua asam nukleat yang memiliki sekuens sama tidak berarti keduanya sama jika pembacaan sekuens tersebut dilakukan dari arah yang berlawanan (yang satu 5’→ 3’, sedangkan yang lain 3’→ 5’).

Gambar 3C.4 Struktur tangga berpilin (double helix) DNA

Dua orang ilmuwan, J.D.Watson dan F.H.C.Crick, mengajukan model struktur molekul DNA yang hingga kini sangat diyakini kebenarannya dan dijadikan dasar dalam berbagai teknik yang berkaitan dengan manipulasi DNA. Model tersebut dikenal sebagai tangga berplilin (double helix). Secara alami DNA pada umumnya mempunyai struktur molekul tangga berpilin ini.

Model tangga berpilin menggambarkan struktur molekul DNA sebagai dua rantai polinukleotida yang saling memilin membentuk spiral dengan arah pilinan ke kanan. Fosfat dan gula pada masing-masing rantai menghadap ke arah luar sumbu pilinan, sedangkan basa N menghadap ke arah dalam sumbu pilinan dengan susunan yang sangat khas sebagai pasangan - pasangan basa antara kedua rantai. Dalam hal ini, basa A pada satu rantai akan berpasangan dengan basa T pada rantai lainnya, sedangkan basa G berpasangan dengan basa C. Pasangan-pasangan basa ini dihubungkan oleh ikatan hidrogen yang lemah (nonkovalen). Basa A dan T dihubungkan oleh ikatan hidrogen rangkap dua, sedangkan basa G dan C dihubungkan oleh ikatan hidrogen rangkap tiga. Adanya ikatan hidrogen tersebut menjadikan kedua rantai


polinukleotida terikat satu sama lain dan saling komplementer. Artinya, begitu sekuens basa pada salah satu rantai diketahui, maka sekuens pada rantai yang lainnya dapat ditentukan.

Oleh karena basa bisiklik selalu berpasangan dengan basa monosiklik, maka jarak antara kedua rantai polinukleotida di sepanjang molekul DNA akan selalu tetap. Dengan perkataan lain, kedua rantai tersebut sejajar. Akan tetapi, jika rantai yang satu dibaca dari arah 5’ ke 3’, maka rantai pasangannya dibaca dari arah 3’ ke 5’. Jadi, kedua rantai tersebut sejajar tetapi berlawanan arah (antiparalel).

Gambar 3C.5 Model struktur tangga berpilin DNA

Jarak antara dua pasangan basa yang berurutan adalah 0,34 nm. Sementara itu, di dalam setiap putaran spiral terdapat 10 pasangan basa sehingga jarak antara dua basa yang


tegak lurus di dalam masing-masing rantai menjadi 3,4 nm. Namun, kondisi semacam ini hanya dijumpai apabila DNA berada dalam medium larutan fisiologis dengan kadar garam rendah seperti halnya yang terdapat di dalam protoplasma sel hidup. DNA semacam ini dikatakan berada dalam bentuk B atau bentuk yang sesuai dengan model asli Watson-Crick. Bentuk yang lain, misalnya bentuk A, akan dijumpai jika DNA berada dalam medium dengan kadar garam tinggi. Pada bentuk A terdapat 11 pasangan basa dalam setiap putaran spiral. Selain itu, ada pula bentuk Z, yaitu bentuk molekul DNA yang mempunyai arah pilinan spiral ke kiri. Bermacam-macam bentuk DNA ini sifatnya fleksibel, artinya dapat berubah dari yang satu ke yang lain bergantung kepada kondisi lingkungannya.

Gambar 3C.6 Struktur double helix

Modifikasi struktur molekul RNA

Tidak seperti DNA, molekul RNA pada umumnya berupa untai tunggal sehingga tidak memiliki struktur tangga berpilin. Namun, modifikasi struktur juga terjadi akibat terbentuknya ikatan hidrogen di dalam untai tunggal itu sendiri (intramolekuler).


Dengan adanya modifikasi struktur molekul RNA, kita mengenal tiga macam RNA, yaitu RNA duta atau messenger RNA (mRNA), RNA pemindah atau transfer RNA (tRNA), dan RNA ribosomal (rRNA). Struktur mRNA dikatakan sebagai struktur primer, sedangkan struktur tRNA dan rRNA dikatakan sebagai struktur sekunder. Perbedaan di antara ketiga struktur molekul RNA tersebut berkaitan dengan perbedaan fungsinya masing-masing. Sifat-sifat Fisika-Kimia Asam Nukleat

Di bawah ini akan dibicarakan sekilas beberapa sifat fisika-kimia asam nukleat. Sifat-sifat tersebut adalah stabilitas asam nukleat, pengaruh asam, pengaruh alkali, denaturasi kimia, viskositas, dan kerapatan apung. Stabilitas asam nukleat

Ketika kita melihat struktur tangga berpilin molekul DNA atau pun struktur sekunder RNA, sepintas akan nampak bahwa struktur tersebut menjadi stabil akibat adanya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang berpasangan. Padahal, sebenarnya tidaklah demikian. Ikatan hidrogen di antara pasangan-pasangan basa hanya akan sama kuatnya dengan ikatan hidrogen antara basa dan molekul air apabila DNA berada dalam bentuk rantai tunggal. Jadi, ikatan hidrogen jelas tidak berpengaruh terhadap stabilitas struktur asam nukleat, tetapi sekedar menentukan spesifitas perpasangan basa. Penentu stabilitas struktur asam nukleat terletak pada interaksi penempatan (stacking interactions) antara pasangan-pasangan basa. Permukaan basa yang bersifat hidrofobik menyebabkan molekul-molekul air dikeluarkan dari sela-sela perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut menjadi kuat. Pengaruh asam

Di dalam asam pekat dan suhu tinggi, misalnya HClO4 dengan suhu lebih dari 100ºC, asam nukleat akan mengalami hidrolisis sempurna menjadi komponen-komponennya. Namun, di dalam asam mineral yang lebih encer, hanya ikatan glikosidik antara gula dan basa purin saja yang putus sehingga asam nukleat dikatakan bersifat apurinik. Pengaruh alkali

Pengaruh alkali terhadap asam nukleat mengakibatkan terjadinya perubahan status

tautomerik basa. Sebagai contoh, peningkatan pH akan menyebabkan perubahan struktur guanin dari bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut kehilangan sebuah proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan terputusnya sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA mengalami denaturasi. Hal yang sama terjadi pula pada RNA. Bahkan pada pH netral sekalipun, RNA jauh lebih rentan terhadap hidrolisis bila dibadingkan dengan DNA karena adanya gugus OH pada atom C nomor 2 di dalam gula ribosanya.


Denaturasi kimia

Sejumlah bahan kimia diketahui dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat pada pH netral. Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2) dan formamid (COHNH2). Pada konsentrasi yang relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas struktur sekunder asam nukleat menjadi berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi. Viskositas

DNA kromosom dikatakan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi karena diameternya hanya sekitar 2 nm, tetapi panjangnya dapat mencapai beberapa sentimeter. Dengan demikian, DNA tersebut berbentuk tipis memanjang. Selain itu, DNA merupakan molekul yang relatif kaku sehingga larutan DNA akan mempunyai viskositas yang tinggi. Karena sifatnya itulah molekul DNA menjadi sangat rentan terhadap fragmentasi fisik. Hal ini menimbulkan masalah tersendiri ketika kita hendak melakukan isolasi DNA yang utuh. Kerapatan apung

Analisis dan pemurnian DNA dapat dilakukan sesuai dengan kerapatan apung (bouyant density)-nya. Di dalam larutan yang mengandung garam pekat dengan berat molekul tinggi, misalnya sesium klorid (CsCl) 8M, DNA mempunyai kerapatan yang sama dengan larutan tersebut, yakni sekitar 1,7 g/cm3. Jika larutan ini disentrifugasi dengan kecepatan yang sangat tinggi, maka garam CsCl yang pekat akan bermigrasi ke dasar tabung dengan membentuk gradien kerapatan. Begitu juga, sampel DNA akan bermigrasi menuju posisi gradien yang sesuai dengan kerapatannya. Teknik ini dikenal sebagai sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan (equilibrium density gradient centrifugation) atau sentrifugasi isopiknik.

Oleh karena dengan teknik sentrifugasi tersebut pelet RNA akan berada di dasar tabung dan protein akan mengapung, maka DNA dapat dimurnikan baik dari RNA maupun dari protein. Selain itu, teknik tersebut juga berguna untuk keperluan analisis DNA karena kerapatan apung DNA (ρ) merupakan fungsi linier bagi kandungan GC-nya. Dalam hal ini, ρ = 1,66 + 0,098% (G+C).

Sifat-sifat Spektroskopik-Termal Asam Nukleat

Sifat spektroskopik-termal asam nukleat meliputi kemampuan absorpsi sinar UV, hipokromisitas, penghitungan konsentrasi asam nukleat, penentuan kemurnian DNA, serta denaturasi termal dan renaturasi asam nukleat. Masing-masing akan dibicarakan sekilas berikut ini. Absorpsi UV

Asam nukleat dapat mengabsorpsi sinar UV karena adanya basa nitrogen yang bersifat aromatik; fosfat dan gula tidak memberikan kontribusi dalam absorpsi UV. Panjang gelombang


untuk absorpsi maksimum baik oleh DNA maupun RNA adalah 260 nm atau dikatakan λmaks = 260 nm. Nilai ini jelas sangat berbeda dengan nilai untuk protein yang mempunyai λmaks = 280 nm. Sifat-sifat absorpsi asam nukleat dapat digunakan untuk deteksi, kuantifikasi, dan perkiraan kemurniannya. Hipokromisitas Meskipun λmaks untuk DNA dan RNA konstan, ternyata ada perbedaan nilai yang bergantung kepada lingkungan di sekitar basa berada. Dalam hal ini, absorbansi pada λ 260 nm (A260) memperlihatkan variasi di antara basa-basa pada kondisi yang berbeda. Nilai tertinggi terlihat pada nukleotida yang diisolasi, nilai sedang diperoleh pada molekul DNA rantai tunggal (ssDNA) atau RNA, dan nilai terendah dijumpai pada DNA rantai ganda (dsDNA). Efek ini disebabkan oleh pengikatan basa di dalam lingkungan hidrofobik. Istilah klasik untuk menyatakan perbedaan nilai absorbansi tersebut adalah hipokromisitas. Molekul dsDNA dikatakan relatif hipokromik (kurang berwarna) bila dibandingkan dengan ssDNA. Sebaliknya, ssDNA dikatakan hiperkromik terhadap dsDNA. Penghitungan konsentrasi asam nukleat

Konsentrasi DNA dihitung atas dasar nilai A260-nya. Molekul dsDNA dengan konsentrasi 1mg/ml mempunyai A260 sebesar 20, sedangkan konsentrasi yang sama untuk molekul ssDNA atau RNA mempunyai A260 lebih kurang sebesar 25. Nilai A260 untuk ssDNA dan RNA hanya merupakan perkiraan karena kandungan basa purin dan pirimidin pada kedua molekul tersebut tidak selalu sama, dan nilai A260 purin tidak sama dengan nilai A260 pirimidin. Pada dsDNA, yang selalu mempunyai kandungan purin dan pirimidin sama, nilai A260 -nya sudah pasti. Kemurnian asam nukleat

Tingkat kemurnian asam nukleat dapat diestimasi melalui penentuan nisbah A260

terhadap A280. Molekul dsDNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sebesar 1,8. Sementara itu, RNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sekitar 2,0. Protein, dengan λmaks = 280 nm, tentu saja mempunyai nisbah A260 /A280 kurang dari 1,0. Oleh karena itu, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 lebih dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh protein. Denaturasi termal dan renaturasi

Di atas telah disinggung bahwa beberapa senyawa kimia tertentu dapat menyebabkan terjadinya denaturasi asam nukleat. Ternyata, panas juga dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat. Proses denaturasi ini dapat diikuti melalui pengamatan nilai absorbansi yang meningkat karena molekul rantai ganda (pada dsDNA dan sebagian daerah pada RNA) akan berubah menjadi molekul rantai tunggal. Denaturasi termal pada DNA dan RNA ternyata sangat berbeda. Pada RNA denaturasi berlangsung perlahan dan bersifat acak karena bagian rantai ganda yang pendek akan terdenaturasi lebih dahulu daripada bagian rantai ganda yang panjang. Tidaklah demikian


halnya pada DNA. Denaturasi terjadi sangat cepat dan bersifat koperatif karena denaturasi pada kedua ujung molekul dan pada daerah kaya AT akan mendestabilisasi daerah-daerah di sekitarnya. Suhu ketika molekul asam nukleat mulai mengalami denaturasi dinamakan titik leleh atau melting temperature (Tm). Nilai Tm merupakan fungsi kandungan GC sampel DNA, dan berkisar dari 80 ºC hingga 100ºC untuk molekul-molekul DNA yang panjang. DNA yang mengalami denaturasi termal dapat dipulihkan (direnaturasi) dengan cara didinginkan. Laju pendinginan berpengaruh terhadap hasil renaturasi yang diperoleh. Pendinginan yang berlangsung cepat hanya memungkinkan renaturasi pada beberapa bagian/daerah tertentu. Sebaliknya, pendinginan yang dilakukan perlahan-lahan dapat mengembalikan seluruh molekul DNA ke bentuk rantai ganda seperti semula. Renaturasi yang terjadi antara daerah komplementer dari dua rantai asam nukleat yang berbeda dinamakan hibridisasi. Superkoiling DNA

Banyak molekul dsDNA berada dalam bentuk sirkuler tertutup atau closed-circular (CC), misalnya DNA plasmid dan kromosom bakteri serta DNA berbagai virus. Artinya, kedua rantai membentuk lingkaran dan satu sama lain dihubungkan sesuai dengan banyaknya putaran heliks (Lk) di dalam molekul DNA tersebut.

Sejumlah sifat muncul dari kondisi sirkuler DNA. Cara yang baik untuk membayangkannya adalah menganggap struktur tangga berpilin DNA seperti gelang karet dengan suatu garis yang ditarik di sepanjang gelang tersebut. Jika kita membayangkan suatu pilinan pada gelang, maka deformasi yang terbentuk akan terkunci ke dalam sistem pilinan tersebut. Deformasi inilah yang disebut sebagai superkoiling. Interkalator

Geometri suatu molekul yang mengalami superkoiling dapat berubah akibat beberapa faktor yang mempengaruhi pilinan internalnya. Sebagai contoh, peningkatan suhu dapat menurunkan jumlah pilinan, atau sebaliknya, peningkatan kekuatan ionik dapat menambah jumlah pilinan. Salah satu faktor yang penting adalah keberadaan interkalator seperti etidium bromid (EtBr). Molekul ini merupakan senyawa aromatik polisiklik bermuatan positif yang menyisip di antara pasangan-pasangan basa. Dengan adanya EtBr molekul DNA dapat divisualisasikan menggunakan paparan sinar UV.


D. REPLIKASI DNA

Salah satu fungsi DNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme adalah harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi tersebut dari induk kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. Fungsi ini merupakan fungsi genotipik, yang dilaksanakan melalui replikasi.

Mekanisme Replikasi Semikonservatif

Ada tiga cara teoretis replikasi DNA yang pernah diusulkan, yaitu konservatif, semikonservatif, dan dispersif. Pada replikasi konservatif seluruh tangga berpilin DNA awal tetap dipertahankan dan akan mengarahkan pembentukan tangga berpilin baru. Pada replikasi semikonservatif tangga berpilin mengalami pembukaan terlebih dahulu sehingga kedua untai polinukleotida akan saling terpisah. Namun, masing-masing untai ini tetap dipertahankan dan akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untai polinukleotida baru. Sementara itu, pada replikasi dispersif kedua untai polinukleotida mengalami fragmentasi di sejumlah tempat. Kemudian, fragmen-fragmen polinukleotida yang terbentuk akan menjadi cetakan bagi fragmen nukleotida baru sehingga fragmen lama dan baru akan dijumpai berselang-seling di dalam tangga berpilin yang baru. Diantara ketiga cara replikasi DNA yang diusulkan tersebut, hanya cara semikonservatif yang dapat dibuktikan kebenarannya melalui percobaan yang dikenal dengan nama sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan atau equilibrium density-gradient centrifugation. Percobaan ini dilaporkan hasilnya pada tahun 1958 oleh M.S. Meselson dan F.W. Stahl.


Setiap molekul DNA yang melakukan replikasi sebagai suatu satuan tunggal dinamakan replikon. Dimulainya (inisiasi) replikasi DNA terjadi di suatu tempat tertentu di dalam molekul DNA yang dinamakan titik awal replikasi atau origin of replication (ori). Proses inisiasi ini ditandai oleh saling memisahnya kedua untai DNA, yang masing-masing akan berperan sebagai cetakan bagi pembentukan untai DNA baru sehingga akan diperoleh suatu gambaran yang disebut sebagai garpu replikasi. Biasanya, inisiasi replikasi DNA, baik pada prokariot maupun eukariot, terjadi dua arah (bidireksional). Dalam hal ini dua garpu replikasi akan bergerak melebar dari ori menuju dua arah yang berlawanan hingga tercapai suatu ujung (terminus). Pada eukariot, selain terjadi replikasi dua arah, ori dapat ditemukan di beberapa tempat.

Replikasi pada kedua untai DNA

Proses replikasi DNA yang kita bicarakan di atas sebenarnya barulah proses yang terjadi pada salah satu untai DNA. Untai DNA tersebut sering dinamakan untai pengarah (leading strand). Sintesis DNA baru pada untai pengarah ini berlangsung secara kontinyu dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai pengarah dari ujung 3’ ke ujung 5’.

Pada untai DNA pasangannya ternyata juga terjadi sintesis DNA baru dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai DNA cetakannya ini dari ujung 3’ ke ujung 5’. Namun, sintesis DNA pada untai yang satu ini tidak berjalan kontinyu sehingga menghasilkan fragmen terputus-putus, yang masing-masing mempunyai arah 5’→ 3’. Terjadinya sintesis DNA yang tidak kontinyu sebenarnya disebabkan oleh sifat enzim DNA polimerase yang hanya dapat menyintesis DNA dari arah 5’ ke 3’ serta ketidakmampuannya untuk melakukan inisiasi sintesis DNA.

Untai DNA yang menjadi cetakan bagi sintesis DNA tidak kontinyu itu disebut untai tertinggal (lagging strand). Sementara itu, fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan dari sintesis yang tidak kontinyu dinamakan fragmen Okazaki, sesuai dengan nama penemunya. Fragmen-fragmen Okazaki akan disatukan menjadi sebuah untai DNA yang utuh dengan bantuan enzim DNA ligase.


Replikasi DNA prokariot

Replikasi DNA kromosom prokariot, khususnya bakteri, sangat berkaitan dengan siklus pertumbuhannya. Daerah ori pada E. coli, misalnya, berisi empat buah tempat pengikatan protein inisiator DnaA, yang masing-masing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat tinggi, DNA kromosom prokariot dapat mengalami reinisiasi replikasi pada dua ori yang baru terbentuk, sebelum putaran replikasi yang pertama berakhir. Akibatnya, sel-sel hasil pembelahan akan menerima kromosom yang sebagian telah bereplikasi.

Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30 hingga 40 buah molekul, yang masing-masing akan terikat pada molekul ATP. Daerah ori akan mengelilingi kompleks DnaA-ATP tersebut. Proses ini memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua untai DNA berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan AT sehingga memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang merupakan enzim helikase, yaitu enzim yang akan menggunakan energi ATP hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang kedua untai DNA dan memisahkannya.

Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya diselubungi oleh protein pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (Ssb) untuk melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah renaturasi. Enzim DNA primase kemudian akan menempel pada DNA dan menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau menginisiasi sintesis pada untai pengarah.

Agar replikasi dapat terus berjalan menjauhi ori, diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena pembukaan heliks akan diikuti oleh pembentukan putaran baru berupa superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi secara alami ternyata tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim lain, yaitu topoisomerase tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim DNA girase ini merupakan target serangan antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat mencegah berlanjutnya replikasi DNA bakteri.

Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu kompleks yang disebut primosom akan menyintesis sejumlah RNA primer dengan interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom terdiri atas helikase DnaB dan DNA primase.

Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan mengalami elongasi dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III. Kompleks multisubunit ini merupakan dimer, separuh akan bekerja pada untai pengarah dan separuh lainnya bekerja pada untai tertinggal. Dengan demikian, sintesis pada kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang sama.


Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas subunit a, yang mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e, yang mempunyai fungsi penyuntingan berupa eksonuklease 3’5’. Selain itu, terdapat subunit b yang menempelkan polimerase pada DNA.

Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase III, mereka akan segera dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh hilangnya primer tersebut diisi oleh DNA polimerase I, yang mempunyai aktivitas polimerase 5’ 3’, eksonuklease 5’ 3’, dan-eksonuklease penyuntingan 3’ 5’. Eksonuklease 5’3’ membuang primer, sedangkan polimerase akan mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya, fragmen-fragmen Okazaki akan dipersatukan oleh enzim DNA ligase. Secara in vivo, dimer holoenzim DNA polimerase III dan primosom diyakini membentuk kompleks berukuran besar yang disebut dengan replisom. Dengan adanya replisom sintesis DNA akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap detik.

Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180°C dari ori. Di sekitar daerah ini terdapat sejumlah terminator yang akan menghentikan gerakan garpu replikasi. Terminator tersebut antara lain berupa produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB. Ketika replikasi selesai, kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu. Pemisahan dilakukan oleh enzim topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudian disegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.

Replikasi DNA eukariot

Pada eukariot replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi pada masing-masing ori.

Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariot bergerak hanya dengan kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari nukleosom pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan mamalia. Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara serempak pada waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah eukromatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah heterokromatin. DNA sentromir dan telomir bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi. Seperti halnya pada prokariot, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d pada


untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi yang mengenali BUdR.

Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariot (telomir) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’.

Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada organisme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase.


E. TRANSKRIPSI DNA

Salah satu fungsi dasar yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi genetik adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur pertumbuhan dan diferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu. Fungsi ini dilaksanakan melalui ekspresi gen, yang tahap pertamanya adalah proses transkripsi, yaitu perubahan urutan basa molekul DNA menjadi urutan basa molekul RNA. Dengan perkataan lain, transkripsi merupakan proses sintesis RNA menggunakan salah satu untai molekul DNA sebagai cetakan (template) nya.

Transkripsi mempunyai ciri-ciri kimiawi yang serupa dengan sintesis/replikasi DNA, yaitu

1. Adanya sumber basa nitrogen berupa nukleosida trifosfat. Bedanya dengan sumber basa untuk sintesis DNA hanyalah pada molekul gula pentosanya yang tidak berupa deoksiribosa tetapi ribosa dan tidak adanya basa timin tetapi digantikan oleh urasil. Jadi, keempat nukleosida trifosfat yang diperlukan adalah adenosin trifosfat (ATP), guanosin trifosfat (GTP), sitidin trifosfat (CTP), dan uridin trifosfat (UTP).

2. Adanya untai molekul DNA sebagai cetakan. Dalam hal ini hanya salah satu di antara kedua untai DNA yang akan berfungsi sebagai cetakan bagi sintesis molekul RNA. Untai DNA ini mempunyai urutan basa yang komplementer dengan urutan basa RNA hasil transkripsinya, dan disebut sebagai pita antisens. Sementara itu, untai DNA pasangannya, yang mempunyai urutan basa sama dengan urutan basa RNA, disebut sebagai pita sens. Meskipun demikian, sebenarnya transkripsi pada umumnya tidak terjadi pada urutan basa di sepanjang salah satu untai DNA. Jadi, bisa saja urutan basa yang ditranskripsi terdapat berselang-seling di antara kedua untai DNA.

3. Sintesis berlangsung dengan arah 5’→ 3’ seperti halnya arah sintesis DNA. 4. Gugus 3’- OH pada suatu nukleotida bereaksi dengan gugus 5’- trifosfat pada

nukleotida berikutnya menghasilkan ikatan fosofodiester dengan membebaskan dua atom pirofosfat anorganik (PPi). Reaksi ini jelas sama dengan reaksi polimerisasi DNA. Hanya saja enzim yang bekerja bukannya DNA polimerase, melainkan RNA polimerase. Perbedaan yang sangat nyata di antara kedua enzim ini terletak pada kemampuan enzim RNA polimerase untuk melakukan inisiasi sintesis RNA tanpa adanya molekul primer.

Secara garis besar transkripsi berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengenalan promoter, inisiasi, elongasi, dan teminasi. Masing-masing tahap akan dijelaskan secara singkat sebagai berikut.

Pengenalan promoter

Agar molekul DNA dapat digunakan sebagai cetakan dalam sintesis RNA, kedua untainya harus dipisahkan satu sama lain di tempat-tempat terjadinya penambahan basa pada RNA. Selanjutnya, begitu penambahan basa selesai dilakukan, kedua untai DNA segera menyatu kembali. Pemisahan kedua untai DNA pertama kali terjadi di suatu tempat tertentu, yang


merupakan tempat pengikatan enzim RNA polimerase di sisi 5’ (upstream) dari urutan basa penyandi (gen) yang akan ditranskripsi. Tempat ini dinamakan promoter.

Inisiasi

Setelah mengalami pengikatan oleh promoter, RNA polimerase akan terikat pada suatu tempat di dekat promoter, yang dinamakan tempat awal polimerisasi atau tapak inisiasi (initiation site). Tempat ini sering dinyatakan sebagai posisi +1 untuk gen yang akan ditranskripsi. Nukleosida trifosfat pertama akan diletakkan di tapak inisiasi dan sintesis RNA pun segera dimulai.

Elongasi

Pengikatan enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya pada untai DNA cetakan membentuk kompleks transkripsi. Selama sintesis RNA berlangsung kompleks transkripsi akan bergeser di sepanjang molekul DNA cetakan sehingga nukleotida demi nukleotida akan ditambahkan kepada untai RNA yang sedang diperpanjang pada ujung 3’ nya. Jadi, elongasi atau polimerisasi RNA berlangsung dari arah 5’ ke 3’, sementara RNA polimerasenya sendiri bergerak dari arah 3’ ke 5’ di sepanjang untai DNA cetakan.

Terminasi

Berakhirnya polimerisasi RNA ditandai oleh disosiasi kompleks transkripsi atau terlepasnya enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya dari untai DNA cetakan. Begitu pula halnya dengan molekul RNA hasil sintesis. Hal ini terjadi ketika RNA polimerase mencapai urutan basa tertentu yang disebut dengan terminator.

Terminasi transkripsi dapat terjadi oleh dua macam sebab, yaitu terminasi yang hanya bergantung kepada urutan basa cetakan (disebut terminasi diri) dan terminasi yang memerlukan kehadiran suatu protein khusus (protein rho). Di antara keduanya terminasi diri lebih umum dijumpai. Terminasi diri terjadi pada urutan basa palindrom yang diikuti oleh beberapa adenin (A). Urutan palindrom adalah urutan yang sama jika dibaca dari dua arah yang berlawanan. Oleh karena urutan palindom ini biasanya diselingi oleh beberapa basa tertentu, maka molekul RNA yang dihasilkan akan mempunyai ujung terminasi berbentuk batang dan kala (loop) .

Inisiasi transkripsi tidak harus menunggu selesainya transkripsi sebelumnya. Hal ini karena begitu RNA polimerase telah melakukan pemanjangan 50 hingga 60 nukleotida, promoter dapat mengikat RNA polimerase yang lain. Pada gen-gen yang ditranskripsi dengan cepat reinisiasi transkripsi dapat terjadi berulang-ulang sehingga gen tersebut akan terselubungi oleh sejumlah molekul RNA dengan tingkat penyelesaian yang berbeda-beda.

Transkripsi pada Prokariot


Telah dikatakan di atas bahwa transkripsi merupakan proses sintesis RNA yang dikatalisis oleh enzim RNA polimerase. Berikut ini akan diuraikan sekilas enzim RNA polimerase pada prokariot, khususnya pada bakteri E.coli, promoter s70, serta proses transkripsi pada organisme tersebut.

RNA polimerase E. coli

Enzim RNA polimerase pada E. coli sekurang-kurangnya terdiri atas lima subunit, yaitu alfa (

sebagai holoenzim -masing subunit Holoenzim RNA polimerase diperlukan

merupakan enzim inti (core enzyme) yang akan melanjutkan proses transkripsi.

Laju sintesis RNA oleh RNA polimerase E. coli dapat mencapai sekitar 40 nukleotida per detik pada suhu 37°C. Untuk aktivitasnya enzim ini memerlukan kofaktor Mg2+. Setiap berikatan dengan molekul DNA enzim RNA polimerase E. coli dapat mencakup daerah sepanjang lebih kurang 60pb.

Meskipun kebanyakan RNA polimerase seperti halnya yang terdapat pada E. coli mempunyai struktur multisubunit, hal itu bukanlah persyaratan yang mutlak. RNA polimerase pada bakteriofag T3 dan T7, misalnya, merupakan rantai polipeptida tunggal yang ukurannya jauh lebih kecil daripada RNA polimerase bakteri. Enzim tersebut dapat menyintesis RNA dengan cepat, yaitu sebanyak 200 nukleotida per detik pada suhu 37°C.

yang identik terdapat pada RNA polimerase inti. Kedua-duanya disandi oleh gen rpoA. Ketika bakteriofag T4 menginfeksi E.coli akan dimodifikasi melalui ribosilasi ADP suatu arginin. Hal ini berkaitan dengan berkurangnya afinitas pengikatan promoter

diduga kuat memegang peranan dalam pengenalan promoter.

sebagai pusat katalitik RNA polimerase, yang dibuktikan melalui hasil penelitian mengenai penghambatan transkripsi menggunakan antibiotik. Antibiotik rifampisin merupakan inhibitor potensial bagi RNA polimerase yang menghalangi inisiasi tetapi tidak mempengaruhi elongasi. Kelompok antibiotik ini tidak menghambat polimerase eukariot sehingga sering digunakan untuk mengatasi infeksi bakteri Gram positif dan tuberkulosis. Rifampisin telah dibuktikan berikatan dengan subunit -mutasi yang menyebabkan resistensi terhadap rifampisin telah dipetakan pada gen rpoB Selanjutnya, kelompok antibiotik yang lain, yakni streptolidigin, ternyata menghambat elongasi transkripsi, dan mutasi-mutasi yang menyebabkan resistesi terhadap antibiotik ini juga dipetakan pada gen


rpoB. mempunyai dua domain yang bertanggung jawab terhadap inisiasi dan elongasi transkripsi.

Subuni

rpoC ini mengikat dua ion Zn2+ yang diduga berpartisipasi dalam fungsi katalitik polimerase. Suatu

bat transkripsi secara in vitro dan juga berkompetisi dengan DNA dalam pengikatan RNA polimerase. Hal ini

cetakan.

E. coli 70 (disebut demikian karena

mengubah enzim tersebut menjadi holoenzim. Faktor s memegang peranan yang penting dalam pengenalan promoter tetapi tidak diperlukan untuk elongasi transkripsi. Kontribusi faktor s dalam pengenalan promoter adalah melalui penurunan afinitas enzim inti terhadap tempat-tempat nonspesifik pada molekul DNA hingga 104, disertai dengan peningkatan afinitas terhadap promoter.

Banyak organisme prokariot, termasuk E. coli, mempunyai beberapa faktor terlibat dalam pengenalan kelompok-RNA polimerase inti ketika sintesis RNA mencapai panjang 8 hingga 9 nukleotida. Enzim inti tersebut kemudian akan bergerak di sepanjang molekul DNA sambil menyintesis untai RNA.

jumlah RNA polimerase inti sehingga hanya sepertiga di antara kompleks RNA polimerase yang akan dijumpai dalam bentuk holoenzim pada suatu waktu tertentu.

Promoter 70 pada E. coli

Seperti telah dikatakan di atas, promoter merupakan tempat tertentu pada molekul DNA yang mempunyai urutan basa spesifik untuk pengikatan RNA polimerase dan inisiasi transkripsi.

Meskipun demikian, faktor s yang paling umum dijumpai pada E. coli 70.

Promoter pertama kali dikarakterisasi melalui percobaan mutasi yang meningkatkan atau menurunkan laju transkripsi gen-gen seperti halnya gen-gen struktural pada operon lac. Mutagenesis promoter-promoter pada E. coli menunjukkan bahwa urutan basa yang menentukan fungsi promoter tersebut hanyalah suatu urutan yang sangat pendek.


Promoter 70 terdiri atas urutan basa sepanjang 40 hingga 60 pb. Daerah antara –55 dan +20 telah diketahui merupakan daerah pengikatan RNA polimerase, sedangkan daerah antara –20 dan +20 diketahui sangat terlindung dari aktivitas nuklease oleh DNase I. Hal ini menunjukkan bahwa daerah tersebut sangat berkaitan dengan polimerase yang menghalangi akses nuklease menuju DNA. Mutagenesis promoter memperlihatkan bahwa urutan hingga lebih kurang –40 mempunyai peranan yang penting bagi fungsi promoter. Selain itu, dua urutan sepanjang 6 pb pada posisi sekitar –10 dan –35 terbukti sangat penting bagi fungsi promoter pada E. coli.

Urutan –10

Urutan yang paling lestari (konservatif) pada promoter 70, atau sering dikatakan sebagai urutan konsensus, adalah urutan sepanjang 6 pb yang dijumpai pada promoter-promoter berbagai macam gen pada E. coli. Urutan ini terpusat di sekitar posisi –10 jika dilihat dari tapak inisiasi transkripsi, dan dinamakan kotak Pribnow karena ditemukan oleh Pribnow pada tahun 1975. Urutan konsensus pada kotak Pribnow adalah TATAAT. Kedua basa pertama (TA) dan T yang terakhir merupakan basa-basa yang paling konservatif. Urutan heksamer ini dipisahkan sejauh 5 hingga 8 pb dari tapak inisiasi, dan urutan penyela yang memisahkan urutan -10 dengan tapak inisiasi tersebut tidaklah konservatif. Urutan –10 nampaknya merupakan urutan tempat terjadinya inisiasi pembukaan heliks oleh RNA polimerase.

Urutan -35

Selain urutan -10, terdapat pula urutan heksamer lain yang konservatif, yaitu urutan di sekitar posisi -35, yang terdiri atas TTGACA. Urutan ini akan lebih konservatif lagi pada promoter-promoter yang efisien. Tiga basa pertama (TTG) merupakan posisi yang paling konservatif. Pada kebanyakan promoter urutan -35 dipisahkan sejauh 16 hingga 18 pb dari kotak Pribnow, dan urutan penyelanya bukanlah urutan yang penting.

Tapak inisiasi transkripsi

Pada 90% di antara semua gen, tapak inisiasi transkripsi (posisi +1) berupa basa purin, dan dalam hal ini G lebih umum dijumpai daripada A. Di samping itu, basa C dan basa T sering kali mengapit tapak inisiasi sehingga terdapat urutan CGT atau CAT.

Efisiensi promoter

Urutan-urutan konsensus tersebut di atas khas dijumpai pada promoter-promoter yang kuat. Akan tetapi, di antara promoter yang berbeda sebenarnya terdapat variasi urutan yang cukup nyata, yang dapat mengakibatkan perbedaan efisiensi transkripsi hingga 1.000 kali. Secara garis besar, fungsi daerah-daerah pada promoter dapat dijelaskan sebagai berikut. Urutan -35 merupakan urutan pengenalan yang akan meningkatkan pengenalan dan interaksi dengan faktor s RNA polimerase, urutan -10 penting untuk inisiasi pembukaan heliks, dan urutan di sekitar tapak inisiasi mempengaruhi inisiasi transkripsi.


Sementara itu, urutan 30 basa pertama yang akan ditranskripsi juga mempengaruhi transkripsi. Urutan ini mengatur laju pelepasan promoter dari RNA polimerase, yang memungkinkan reinisiasi transkripsi dapat dilakukan oleh kompleks polimerase lainnya. Pada akhirnya hal ini akan berpengaruh terhadap laju transkripsi dan kekuatan promoter.

Pentingnya pemisahan untai DNA pada reaksi inisiasi diperlihatkan oleh pengaruh superkoiling negatif DNA cetakan yang pada umumnya akan memacu laju transkripsi. Hal ini diduga karena struktur superkoil tersebut hanya memerlukan sedikit energi untuk membuka heliks.

Beberapa urutan promoter tidak cukup mirip dengan urutan konsensus yang akan ditranskripsi dengan kuat pada kondisi normal. Sebagai contoh, promoter lac (Plac), yang memerlukan faktor aktivasi tambahan berupa protein reseptor cAMP atau cAMP protein receptor (CPR) untuk mengikat suatu tempat pada DNA yang letaknya berdekatan dengan urutan promoter tersebut agar pengikatan RNA polimerase dan inisiasi transkripsi dapat ditingkatkan. Sejumlah promoter lainnya, misalnya untuk gen-gen yang berhubungan dengan kejut panas, mempunyai urutan konsensus tertentu yang hanya dapat dikenali oleh RNA polimerase dengan faktor .

Tahapan transkripsi pada prokariot

Seperti proses transkripsi pada umumnya, transkripsi pada prokariot berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengikatan promoter, inisiasi, elongasi, dan teminasi. Di bawah ini akan dijelaskan pula sekilas tentang pembukaan heliks, yang terjadi antara tahap pengikatan promoter dan insiasi transkripsi.

Pengikatan promoter

Keadaan ini dikenal sebagai pengikatan longgar, dan sifatnya cukup stabil. Namun, begitu

pengurangan afinitas nonspesifik terhadap DNA hingga 20.000 kali. Sejalan dengan hal itu, pada tempat pengikatan promoter yang

tepat hingga 100 kali. Dengan demikian, akan terjadi peningkatan spesifisitas holoenzim yang tajam dalam mengenali promoter.

Pada genom E. coli holoenzim dapat mencari dan mengikat promoter dengan sangat cepat. Bahkan, karena begitu cepatnya, maka proses ini tidak mungkin terjadi melalui pengikatan dan pelepasan holoenzim dari DNA secara berulang-ulang. Kemungkinan yang masuk akal hanyalah melalui pergeseran holoenzim di sepanjang molekul DNA hingga mencapai urutan promoter. Pada promoter, holoenzim mengenali urutan -35 dan -10. Kompleks awal antara holoenzim dan promoter dikenal sebagai kompleks tertutup (closed complex).

Pembukaan heliks


Agar pita antisens dapat diakses untuk perpasangan basa antara DNA dan RNA yang disintesis, untai ganda (heliks) DNA harus dibuka terlebih dahulu oleh enzim RNA polimerase. Pada kebanyakan gen pembukaan heliks oleh RNA polimerase akan dimudahkan oleh struktur superkoiling negatif DNA sehingga transkripsi dapat ditingkatkan. Namun, tidak semua promoter dapat diaktivasi oleh superkoiling negatif sehingga terisyaratkan bahwa perbedaan topologi DNA dapat mempengaruhi transkripsi. Hal ini mungkin karena adanya perbedaan hubungan sterik pada urutan -35 dan -10 di dalam heliks. Sebagai contoh, promoter untuk subunit enzim DNA girase justru dihambat oleh superkoiling negatif. Seperti kita ketahui, DNA girase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk superkoiling negatif pada genom E. coli sehingga superkoiling negatif ini dapat bertindak sebagai umpan balik yang menghambat ekspresi DNA girase.

Pembukaan awal heliks DNA akan menyebabkan pembentukan kompleks terbuka (open complex) dengan RNA polimerase. Proses ini dikenal sebagai pengikatan ketat.

Inisiasi

Berbeda dengan sintesis DNA, sintesis RNA dapat berlangsung tanpa adanya molekul primer. Oleh karena hampir semua tapak inisiasi transkripsi berupa basa G atau A, maka nukleosida trifosfat pertama yang digunakan untuk sintesis RNA adalah GTP atau ATP.

Mula-mula RNA polimerase akan menggabungkan dua nukleotida pertama dan membentuk ikatan fosfodiester di antara kedua nukleotida tersebut. Selanjutnya, sembilan basa pertama ditambahkan tanpa disertai pergeseran RNA polimerase di sepanjang molekul DNA. Pada akhir penambahan masing-masing basa ini akan terdapat peluang yang nyata terjadinya aborsi untai RNA yang baru terbentuk itu. Proses inisiasi abortif mempengaruhi laju transkripsi secara keseluruhan karena proses tersebut memegang peranan utama dalam menentukan waktu yang dibutuhkan oleh RNA polimerase untuk meninggalkan promoter dan memungkinkan RNA polimerase lainnya menginisiasi putaran transkripsi berikutnya. Waktu minimum untuk pengosongan promoter ini adalah 1 hingga 2 detik, suatu waktu yang relatif lama bila dibandingkan dengan waktu untuk tahap-tahap transkripsi lainnya.

Elongasi

Jika inisiasi berhasil, RNA polimerase melepaskan faktor s, dan bersama-sama dengan DNA dan RNA nasen (RNA yang baru disintesis), akan membentuk kompleks terner atau kompleks yang terdiri atas tiga komponen. Dengan adanya kompleks terner ini RNA polimerase dapat berjalan di sepanjang molekul DNA. Artinya, promoter akan ditinggalkannya untuk kemudian ditempati oleh holoenzim RNA polimerase berikutnya sehingga terjadi reinisiasi transkripsi.

Bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks, atau disebut dengan gelembung transkripsi (transcription bubble), akan terlihat bergeser di sepanjang molekul DNA sejalan dengan gerakan RNA polimerase. Panjang bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks tersebut relatif konstan, yakni sekitar 17 pb, sedangkan ujung 5’ molekul RNA yang disintesis akan


membentuk heliks hibrid dengan pita antisens DNA sepanjang lebih kurang 12 pb. Ukuran ini ternyata tidak mencapai satu putaran heliks.

RNA polimerase E. coli bergerak dengan kecepatan rata-rata 40 nukleotida per detik. Akan tetapi, angka ini dapat bervariasi sesuai dengan urutan lokal DNA (urutan DNA yang telah dicapai oleh RNA polimerase). Tetap dipertahankannya bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks menunjukkan bahwa RNA polimerase membuka heliks DNA di depan gelembung transkripsi dan menutup heliks DNA di belakangnya. Dengan demikian, heliks hibrid RNA-DNA harus berputar setiap kali terjadi penambahan nukleotida pada RNA nasen.

Terminasi

RNA polimerase tetap terikat pada DNA dan melangsungkan transkripsi hingga mencapai urutan terminator (sinyal stop), yang pada umumnya berupa struktur seperti tusuk konde (hairpin). Struktur yang terdiri atas batang dan kala (loop) ini terjadi karena RNA hasil transkripsi mengalami komplementasi diri. Biasanya, bagian batang sangat kaya dengan GC sehingga sangat stabil (GC mempunyai ikatan rangkap tiga). Di sebelah downstream (3’) dari struktur tusuk kode sering kali terdapat urutan yang terdiri atas empat U atau lebih.

Nampaknya RNA polimerase akan segera berhenti begitu struktur tusuk konde RNA disintesis. Bagian ujung RNA yang mengandung banyak U tersebut mempunyai ikatan yang lemah dengan basa-basa A pada DNA cetakan sehingga molekul RNA hasil sintesis akan dengan mudah terlepas dari kompleks transkripsi. Selanjutnya, pita DNA cetakan yang sudah tidak berikatan atau membentuk hibrid dengan RNA segera menempel kembali pada pita DNA komplemennya. RNA polimerase inti pun akhirnya terlepas dari DNA.

Terminasi menggunakan protein rho

Telah disinggung di muka bahwa selain karena adanya struktur tusuk konde, terminasi transkripsi dapat juga terjadi dengan bantuan suatu protein khusus yang dinamakan protein rho (ρ). Rho merupakan protein heksamer yang akan menghidrolisis ATP dengan adanya RNA untai tunggal. Protein ini nampak terikat pada urutan sepanjang 72 basa pada RNA, yang diduga lebih disebabkan oleh pengenalan suatu struktur spesifik daripada karena adanya urutan konsensus. Rho bergerak di sepanjang RNA nasen menuju kompleks transkripsi. Pada kompleks transkripsi ini rho memungkinkan RNA polimerase untuk berhenti pada sinyal terminator tertentu. Sinyal-sinyal terminator ini, seperti halnya sinyal terminator yang tidak bergantung kepada rho, lebih dikenali oleh RNA daripada oleh DNA cetakannya. Adakalanya terminator tersebut juga berupa struktur tusuk konde tetapi tidak dikuti oleh urutan poli U.

Transkripsi pada Eukariot


Mekanisme transkripsi pada eukariot pada dasarnya menyerupai mekanisme pada prokariot. Namun, begitu banyaknya polipeptida yang berkaitan dengan mesin transkripsi pada eukariot menjadikan mekanisme tersebut jauh lebih kompleks daripada mekanisme pada prokariot.

Ada tiga macam kompleks RNA polimerase, yang masing-masing diperlukan untuk transkripsi tipe-tipe gen eukariot yang berbeda. Perbedaan ketiga macam RNA polimerase tersebut dapat diketahui melalui pemurnian menggunakan teknik kromatografi dan elusi pada konsentrasi garam yang berbeda. Masing-masing RNA polimerase mempunyai sensitivitas yang berbeda terhadap toksin jamur α-amanitin, dan hal ini dapat digunakan untuk membedakan aktivitasnya satu sama lain.

RNA polimerase I (RNA Pol I) mentranskripsi sebagian besar gen rRNA. Enzim ini terdapat di dalam nukleoli dan tidak sensitif terhadap α-amanitin.

RNA polimerase II (RNA Pol II) mentranskripsi semua gen penyandi protein dan beberapa gen RNA nuklear kecil (snRNA). Enzim ini terdapat di dalam nukleoplasma dan sangat sensitif terhadap α-amanitin.

RNA polimerase III (RNA Pol III) mentranskripsi gen-gen tRNA, 5S rRNA, U6 snRNA dan beberapa RNA kecil lainnya. Enzim ini terdapat di dalam nukleoplasma dan agak sensitif terhadap α-amanitin.

Di samping enzim-enzim nuklear tersebut, sel eukariot juga mempunyai RNA polimerase lainnya di dalam mitokondria dan kloroplas.

Subunit-subunit RNA polimerase pada eukariot

Ketiga RNA polimerase pada eukariot merupakan enzim berukuran besar yang terdiri atas 12 subunit atau lebih. Gen-gen yang menyandi dua subunit terbesar mempunyai homologi satu sama lain. Sementara itu, ketiga RNA polimerase eukariot membawa subunit-subunit yang mempunyai homologi dengan subunit-subunit RNA polimerase inti pada E. coli (α2ββ’). Subunit terbesar RNA polimerase eukariot menyerupai subunit β’, sedangkan subunit terbesar kedua menyerupai subunit β, yang merupakan pusat katalitik RNA polimerase E.coli. Homologi struktur ini ternyata berkaitan dengan homologi fungsional karena subunit terbesar kedua pada RNA polimerase eukariot juga mengandung tapak aktif.

Dua subunit yang sama antara RNA Pol I dan RNA Pol III, serta satu subunit lainnya yang khas pada RNA Pol II, memperlihatkan homologi dengan subunit α RNA polimerase E. coli. Sekurang-kurangnya ada lima subunit lainnya yang lebih kecil, yang memperlihatkan kesamaan di antara ketiga RNA polimerase eukariot. Masing-masing RNA polimerase ini juga membawa empat hingga tujuh subunit tambahan yang hanya dijumpai pada salah satu di antara ketiganya.

Aktivitas RNA polimerase eukariot

Seperti halnya RNA polimerase bakteri, masing-masing RNA polimerase eukariot mengatalisis transkripsi dengan arah 5’ ke 3’ dan menyintesis RNA yang komplementer dengan urutan DNA


cetakan. Reaksi tersebut memerlukan prekursor berupa ATP, GTP, CTP, UTP, dan tidak memerlukan primer untuk inisiasi transkripsi. Namun tidak seperti pada bakteri, RNA polimerase eukariot yang dimurnikan memerlukan adanya protein inisiasi tambahan sebelum enzim ini dapat berikatan dengan promoter dan melakukan inisiasi transkripsi.

Gen-gen yang ditranskripsi oleh RNA Pol I

RNA Pol I bertanggung jawab dalam sintesis rRNA secara terus-menerus selama interfase. Sel manusia mengandung lima rumpun (cluster) gen penyandi rRNA yang terdiri atas sekitar 40 salinan dan terletak pada kromosom-kromosom yang berbeda. Masing-masing gen rRNA menghasilkan transkrip 45S rRNA yang panjangnya lebih kurang 13.000 nukleotida (nt). Transkrip ini akan terbagi menjadi sebuah 28S (5.000 nt), 18S (2.000 nt), dan 5,8S (160 nt) rRNA. Transkripsi salinan gen-gen rRNA secara berkesinambungan diperlukan untuk mencukupi produksi rRNA yang selanjutnya akan dikemas ke dalam ribosom.

Masing-masing rumpun gen rRNA dikenal sebagai daerah pengatur nukleolar (nucleolar organizer region) karena nukleolus mengandung kala (loop) DNA berukuran besar yang sesuai dengan rumpun-rumpun gen tersebut. Setelah sebuah sel dihasilkan dari mitosis, sintesis rRNA akan dimulai kembali dan nukleoli yang kecil akan muncul pada lokasi kromosomal yang ditempati oleh gen-gen rRNA. Selama sintesis rRNA berlangsung aktif, transkrip pra-rRNA dikemas di sepanjang gen-gen rRNA dan jika divisualisasikan menggunakan mikroskop elektron akan nampak sebagai ’struktur pohon natal’. Di dalam struktur ini transkrip-transkrip RNA dikemas dengan rapat di sepanjang molekul DNA dan masing-masing muncul tegak lurus dari DNA. Transkrip yang pendek dapat dilihat pada bagian awal gen tersebut. Transkrip akan makin bertambah panjang pada bagian-bagian berikutnya untuk kemudian menghilang ketika mencapai ujung unit transkripsi.

Promoter-promoter gen pra-rRNA pada mamalia mempunyai suatu daerah kontrol transkripsi bipartit, yang terdiri atas elemen inti atau core element dan elemen kontrol hulu atau upstream control element (UCE), yang secara skema dapat dilihat pada Gambar 5.5. Elemen inti meliputi tapak awal transkripsi dan terbentang dari posisi -31 hingga +6, yang merupakan urutan esensial untuk transkripsi. Sementara itu, UCE mempunyai panjang sekitar 50 hingga 80 pb yang dimulai dari posisi -100. UCE bertanggung jawab untuk peningkatan transkripsi sekitar 10 hingga 100 kali bila dibandingkan dengan laju transkripsi oleh elemen inti saja.

UCE akan berikatan dengan suatu protein spesifik pengikat DNA, yang disebut dengan faktor pengikatan hulu atau upstream binding factor (UBF). Selain dengan UCE, UBF juga berikatan dengan suatu urutan di sebelah hulu elemen inti. Kedua urutan yang berikatan dengan UBF tersebut tidak mempunyai kesamaan yang nyata. Sebuah molekul UBF diduga mengikat UCE, sedangkan sebuah molekul UBF lainnya mengikat urutan yang kedua. Selanjutnya, kedua molekul UBF akan saling berikatan melalui interaksi protein-protein sehingga terbentuk struktur kala (loop) pada segmen DNA di antara kedua tempat pengikatan tersebut.


Selain UBF, terdapat faktor lain yang esensial untuk transkripsi RNA Pol I. Faktor ini adalah faktor selektivitas atau selectivity factor (SL1), yang akan berikatan dengan kompleks UBF-DNA dan kemudian menstabilkannya. SL1 berinteraksi dengan bagian hilir elemen inti yang bebas. Pengikatan kompleks UBF-DNA oleh SL1 memungkinkan RNA Pol I untuk memasuki kompleks tersebut dan melakukan inisiasi transkripsi.

Saat ini SL1 telah diketahui mengandung beberapa subunit, antara lain berupa suatu protein yang dinamakan protein pengikat TATA atau TATA-binding protein (TBP). TBP diperlukan untuk inisiasi ketiga RNA polimerase eukariot, dan nampaknya merupakan faktor penting dalam transkripsi eukariot. Ketiga subunit SL1 lainnya dikenal sebagai faktor-faktor yang berasosiasi dengan TBP atau TBP-associated factors (TAFs), dan di antara subunit tersebut yang diperlukan untuk transkripsi RNA Pol I dinamakan TAF1s.

Pada Acanthamoeba, suatu eukariot sederhana, terdapat elemen kontrol tunggal di daerah promoter gen rRNA yang terletak sekitar 12 hingga 72 pb ke arah hulu dari titik awal transkripsi. Tempat ini akan diikat oleh faktor TIF-1, yang homolog dengan SL1. Dengan pengikatan ini RNA Pol I akan dapat melakukan inisiasi transkripsi. Pada waktu RNA Pol I bergerak di sepanjang molekul DNA, faktor TIF-1 tetap terikat pada tempat semula sehingga memungkinkan terjadinya inisiasi transkripsi oleh RNA Pol I yang lain, dan beberapa putaran transkripsi dapat berlangsung. Oleh karena itu, mekanisme ini dapat dilihat sebagai sistem kontrol transkripsi yang sangat sederhana. Di sisi lain, untuk vertebrata nampaknya terdapat suatu UBF tambahan yang bertanggung jawab atas pengikatan promoter oleh SL1 secara spesifik.

Gen-gen yang ditranskripsi oleh RNA Pol III

RNA Pol III terdapat di dalam nukleoplasma dan sekurang-kurangnya terdiri atas 16 subunit yang berbeda. Enzim ini menyintesis prekursor tRNA, 5S rRNA, serta berbagai snRNA dan RNA sitosolik.

Transkrip pertama yang dihasilkan dari gen-gen tRNA merupakan molekul prekursor yang akan diproses menjadi RNA matang. Daerah kontrol transkripsi gen-gen tRNA terletak di sebelah hilir tapak inisiasi transkripsi. Ada dua urutan yang sangat konservatif di dalam gen tRNA, yaitu kotak A (5’- TGGCNNAGTGG – 3’) dan kotak B (5’- GGTTCGANNCC – 3’). Kedua urutan ini juga menyandi urutan penting di dalam tRNA sendiri, yang disebut dengan kala D (D-loop) dan kala TΨC. Hal ini berarti bahwa urutan yang sangat konservatif di dalam tRNA juga merupakan urutan promoter yang sangat konservatif.

Dua faktor pengikatan DNA yang kompleks telah diketahui memegang peranan penting dalam inisiasi transkripsi tRNA oleh RNA Pol I. TFIIIC mengikat baik kotak A maupun kotak B di dalam promoter tRNA. Sementara itu, TFIIIB mengikat daerah sejauh 50 pb ke arah hulu dari kotak A. TFIIIB terdiri atas tiga subunit, yang salah satu di antaranya adalah TBP, suatu faktor inisiasi umum yang diperlukan oleh ketiga RNA polimerase. Subunit yang kedua dan ketiga masing-


masing dinamakan BRF dan B’’. Faktor TFIIIB tidak memiliki spesifisitas urutan sehingga tempat pengikatannya bergantung kepada posisi pengikatan TFIIIC pada DNA. TFIIIB memungkinkan RNA Pol III untuk melakukan inisiasi transkripsi. Begitu TFIIIB terikat, TFIIIC dapat dikeluarkan tanpa mempengaruhi transkripsi. Oleh karena itu, TFIIIC dapat dilihat sebagai faktor perakitan untuk penempatan faktor inisiasi TFIIIB.

RNA Pol III mentranskripsi gen 5S rRNA, yang merupakan satu-satunya subunit rRNA yang ditranskripsi secara terpisah. Seperti halnya gen-gen rRNA lainnya yang ditranskripsi oleh RNA Pol I, gen-gen 5S rRNA tersusun secara tandem (berurutan) di dalam suatu rumpun gen. Pada manusia terdapat suatu rumpun yang berisi sekitar 2.000 gen. Promoter gen 5S rRNA mengandung daerah kontrol internal yang dinamakan kotak C. Letaknya sekitar 81 hingga 99 pb ke arah hilir dari tapak inisiasi transkripsi. Selain itu, terdapat juga kotak A yang berada pada posisi sekitar +50 hingga +65.

Kotak C pada promoter 5S rRNA berperan sebagai tempat pengikatan protein spesifik, yaitu TFIIIA (Gambar 5.8). TFIIIA bekerja sebagai faktor perakitan yang memungkinkan TFIIIC berinteraksi dengan promoter 5S rRNA. Sementara itu, kotak A akan menstabilkan pengikatan TFIIIC sehingga faktor ini berikatan dengan DNA pada posisi yang relatif sama dengan posisi pengikatan pada promoter tRNA. Begitu TFIIIC terikat pada DNA, TFIIIB dapat berinteraksi dengan kompleks pengikatan tersebut dan memungkinkan RNA Pol III untuk melakukan inisiasi transkripsi.

Banyak gen yang ditranskripsi oleh RNA Pol III bergantung kepada urutan hulu untuk regulasi transkripsinya. Beberapa promoter seperti U6 snRNA dan gen-gen RNA kecil dari virus Epstein-Barr hanya menggunakan urutan regulator yang letaknya di sebelah hulu dari tapak inisiasi transkripsinya. Daerah penyandi U6 snRNA mempunyai sebuah kotak A yang khas. Akan tetapi, urutan ini tidak diperlukan untuk transkripsi. Daerah hulu pada U6 snRNA mengandung urutan khas promoter RNA Pol II, yang meliputi kotak TATA pada posisi -30 hingga -23. Promoter ini juga memiliki beberapa urutan di daerah hulu sebagai tempat pengikatan faktor transkripsi lainnya seperti pada kebanyakan gen U RNA yang ditranskripsi oleh RNA Pol II. Hal ini mendukung pendapat bahwa faktor-faktor transkripsi umum dapat mengatur gen-gen yang ditranskripsi baik oleh RNA Pol II maupun oleh RNA Pol III.

Terminasi transkripsi oleh RNA Pol III nampaknya hanya memerlukan pengenalan polimerase berupa urutan nukleotida sederhana. Urutan ini terdiri atas sekelompok residu dA yang efisiensi terminasinya dipengaruhi oleh urutan di sekitarnya. Urutan 5’- GCAAAAGC – 3’ merupakan sinyal terminasi yang efisien untuk gen 5S rRNA pada Xenopus borealis.

Gen-gen yang ditranskripsi oleh RNA Pol II

RNA Pol II terdapat di dalam nukleoplasma dan bertanggung jawab untuk transkripsi semua gen penyandi protein dan beberapa gen snRNA. Pra-mRNA (transkrip primer) yang baru disintesis


harus mengalami prosesing melalui pembentukan pelindung (cap) pada ujung 5’ RNA dan penambahan poli A pada ujung 3’ di samping pembuangan intron dan penyatuan (splicing) ekson.

Banyak promoter eukariot mengandung suatu urutan konservatif yang dinamakan kotak TATA. Letaknya sekitar 25 hingga 35 pb dari tapak inisiasi transkripsi, berisi urutan konsensus sepanjang 7 pb, yaitu 5’- TATA(A/T)A(A/T) – 3’. Meskipun demikian, saat ini diketahui bahwa protein yang mengikat kotak TATA, yakni TBP, ternyata berikatan dengan urutan sepanjang 8 pb. Tambahan sepasang basa ini letaknya di sebelah hilir dari kotak TATA dan identitasnya tidaklah penting. Kotak TATA bekerja dengan cara yang sama dengan urutan -10 pada promoter E. coli dalam menempatkan RNA Pol II agar diperoleh inisiasi transkripsi yang benar. Meskipun urutan di antara kotak TATA dan tapak inisiasi transkripsi bukan merupakan urutan yang penting, jarak antara kedua tempat tersebut ternyata penting. Hampir 50% tapak inisiasi transkripsi berupa residu A.

Beberapa gen eukariot tidak mempunyai kotak TATA tetapi memiliki suatu elemen insiator, yang terletak di sekitar tapak inisiasi transkripsi. Namun, beberapa promoter tidak memiliki baik kotak TATA maupun elemen inisiator. Gen-gen semacam ini biasanya ditranskripsi dengan lambat, dan inisiasi transkripsi dapat terjadi di tempat-tempat yang berbeda sepanjang 200 pb. Gen-gen ini sering kali mengandung daerah yang kaya GC sepanjang 20 hingga 50 pb pada posisi 100 hingga 200 pb arah hulu dari tapak inisiasi transkripsi.

Aktivitas promoter basal yang rendah akan sangat ditingkatkan oleh adanya elemen-elemen lain di sebelah hulu promoter. Elemen-elemen ini dijumpai pada kebanyakan gen dengan tingkat ekspresi yang sangat bervariasi di antara jaringan yang berbeda. Dua contoh yang umum adalah kotak SP1, yang terletak di sebelah hulu dari banyak gen baik yang mempunyai maupun yang tidak mempunyai kotak TATA, dan kotak CCAAT. Promoter dapat memiliki salah satu, keduanya, atau bahkan banyak salinan urutan/kotak tersebut. Urutan yang pada umumnya terletak 100 hingga 200 pb arah hulu dari promoter ini dinamakan elemen regulator hulu atau upstream regulatory elements (UREs). UREs memegang peranan penting dalam menjamin berlangsungnya transkripsi yang efisien.

Transkripsi kebanyakan promoter eukariot dapat dipacu oleh elemen kontrol yang letaknya beribu-ribu pasang basa dari tapak inisiasi transkripsi. Hal ini pertama kali ditemukan pada genom virus SV40. Suatu urutan sepanjang kira-kira 100 pb pada DNA virus ini dapat dengan nyata meningkatkan transkripsi dari promoter basal. Urutan pemacu (enhancer) ini mempunyai panjang 100 hingga 200 pb dan mengandung banyak elemen yang menghasilkan aktivitas totalnya. Pemacu dapat dijumpai pada sembarang sel atau hanya pada tipe sel tertentu.

Dengan makin banyaknya pemacu dan promoter yang ditemukan, terlihat bahwa motif kedua elemen tersebut ternyata tumpang tindih, baik secara fisik maupun fungsional. Dengan demikian, terdapat spektrum elemen regulator yang sinambung, mulai dari elemen-elemen pemacu yang sangat panjang rentangnya hingga elemen-elemen promoter yang pendek rentangnya.


Serangkaian faktor transkripsi basal yang kompleks telah diketahui berikatan dengan promoter RNA Pol II dan bersama-sama melakukan inisiasi transkripsi.

Pada promoter yang mengandung kotak TATA, TFIID merupakan faktor pertama yang akan mengikat promoter tersebut. Faktor ini terdiri atas banyak molekul protein, tetapi hanya salah satu di antaranya, yakni protein pengikat TATA atau TATA-binding protein (TBP), yang akan berikatan dengan kotak TATA. Seperti pada RNA Pol I, pada TFIID juga terdapat faktor-faktor yang berasosiasi dengan TBP atau TBP-associated factors (TAFIIS). Pada sel-sel mamalia TBP nampaknya akan berikatan dengan kotak TATA dan kemudian bergabung dengan sekurang-kurangnya delapan TAFIIS untuk membentuk TFIID.

TBP dijumpai pada ketiga kompleks transkripsi eukariot (dalam SL1, TFIIIB, dan TFIID), dan dapat dipastikan memegang peranan penting dalam inisiasi transkripsi. TBP merupakan protein monomerik. Semua TBP eukariot mempunyai domain yang terdiri atas 180 residu asam amino pada ujung C yang sangat konservatif, dan dapat berfungsi sebagai molekul protein seutuhnya pada transkripsi in vivo. Oleh karena itu, fungsi domain pada ujung N yang kurang konservatif belum sepenuhnya diketahui. TBP mempunyai struktur fisik seperti pelana, yang akan mengikat lekukan kecil molekul DNA pada kotak TATA dan menghasilkan sudut 45° di antara kedua pasang basa pertama dan kedua pasang basa terakhir dari 8pb elemen TATA. Mutasi TBP pada domain pengikatannya dengan kotak TATA tetap mempertahankan fungsinya sebagai faktor transkripsi untuk RNA Pol I dan RNA Pol III, tetapi menghalangi inisiasi transkripsi oleh RNA Pol II. Hal ini menunjukkan bahwa RNA Pol I dan RNA Pol III menggunakan TBP untuk inisiasi transkripsi, tetapi peranan TBP itu sendiri yang sesungguhnya pada kompleks transkripsi tersebut masih belum jelas.

Faktor transkripsi berikutnya, TFIIA, akan mengikat TFIID dan meningkatkan stabilitas pengikatan TFIID pada kotak TATA. TFIIA sekurang-kurangnya tersusun dari tiga subunit. Pada studi transkripsi in vitro, yang dilakukan dengan memurnikan TFIID, TFIIA ternyata menjadi tidak dibutuhkan lagi. Namun, pada sel-sel yang utuh TFIIA nampaknya akan menghilangkan pengaruh faktor-faktor penghambat yang berasosiasi dengan TFIID. Jadi, pengikatan TFIIA pada TFIID rupanya akan mencegah masuknya faktor-faktor penghambat tersebut sehingga proses transkripsi dapat berlanjut.

Begitu TFIID terikat dengan stabil pada DNA, faktor transkripsi lainnya, yakni TFIIB, akan berikatan dengan TFIID. Faktor ini akan berperan sebagai perantara yang memungkinkan masuknya RNA Pol II ke dalam kompleks inisiasi transkripsi bersama dengan masuknya faktor berikutnya, TFIIF.

Setelah RNA Pol II terikat pada kompleks inisiasi transkripsi, tiga faktor lainnya, masing-masing TFIIE, TFIIH, dan TFIIJ, segera berasosiasi dengan kompleks tersebut. Ketiga faktor ini diperlukan untuk transkripsi in vitro dan penggabungannya dengan kompleks tersebut terjadi melalui urutan tertentu. Di antara ketiga faktor tersebut, TFIIH merupakan molekul protein terbesar yang sekurang-kurangnya terdiri atas lima subunit. TFIIH mempunyai aktivitas kinase dan helikase. Aktivasi oleh TFIIH akan menyebabkan fosforilasi domain ujung C atau carboxyl-


terminal domain (CTD) pada RNA Pol II sehingga terbentuk kompleks RNA Pol II yang siap untuk diproses dan meninggalkan daerah promoter. Dengan demikian, TFIIH nampaknya mempunyai fungsi yang sangat penting dalam kontrol elongasi transkripsi. Komponen-komponen TFIIH juga penting dalam mekanisme perbaikan DNA dan dalam fosforilasi kompleks kinase yang mengatur daur sel.

Pada kebanyakan promoter RNA Pol II yang tidak memiliki kotak TATA terdapat suatu elemen inisiator yang letaknya tumpang tindih dengan tapak inisiasi transkripsi. Rupanya pada promoter semacam ini TBP dimasukkan ke promoter oleh suatu protein pengikat DNA yang terikat pada elemen inisiator. TBP kemudian memasukkan faktor-faktor transkripsi lainnya beserta RNA Pol II dengan cara seperti pada promoter yang mempunyai kotak TATA.

Struktur faktor transkripsi pada eukariot

Faktor-faktor transkripsi pada eukariot mempunyai dua aktivitas yang berbeda, yaitu pengikatan spesifik pada DNA dan aktivasi transkripsi. Masing-masing aktivitas ini dilaksanakan oleh domain-domain protein yang terpisah, yaitu domain pengikatan DNA dan domain aktivasi. Selain itu, banyak faktor transkripsi berupa homodimer atau heterodimer, yang bersama-sama disatukan melalui domain dimerisasi. Beberapa faktor transkripsi mempunyai domain pengikatan ligan yang memungkinkan aktivitas faktor regulasi transkripsi melalui pengikatan suatu molekul tambahan yang berukuran kecil. Reseptor hormon steroid merupakan salah satu contoh protein yang mempunyai keempat macam domain tersebut.

Dari percobaan-percobaan yang dikenal sebagai percobaan pertukaran domain atau domain swap experiments, diketahui bahwa domain pengikatan DNA dan domain aktivasi faktor transkripsi Gal4 dan Gcn4 pada khamir terletak pada bagian protein yang berbeda. Domain aktivasi akan bergabung dengan represor LexA pada bakteri, menghasilkan protein hibrid yang mengaktivasi transkripsi dari promoter dengan urutan operator lexA. Hal ini menunjukkan bahwa fungsi aktivasi transkripsi pada protein khamir terpisah dari aktivitas pengikatan DNAnya.

Ada tiga macam domain pengikatan DNA, yaitu domain helix turn helix, domain zinc finger, dan domain basic. Domain helix turn helix mempunyai sebuah heliks pengenalan yang akan berinteraksi dengan DNA (Gambar 5.10.a). Domain zinc finger mempunyai dua buah kala. Pada domain zinc finger C2H2 masing-masing kala berupa enam asam amino yang berujung pada dua residu sistein dan dua residu histidin. Keempat residu asam amino ini berkoordinat pada suatu ion zinkum (Gambar 5.10.b). Domain basic biasanya berasosiasi dengan salah satu dari dua domain dimerisasi, yaitu leucine zipper atau helix-loop-helix (HLH), sehingga masing-masing dikenal sebagai protein basic leucine zipper (bZIP) dan basic HLH. Dimerisasi protein-protein ini akan membawa kedua domain basic, yang kemudian dapat berinteraksi dengan DNA.

Domain dimerisasi, seperti telah disinggung di atas, dapat berupa protein leucine zipper atau HLH. Leucine zipper mengandung sebuah residu leusin hidrofobik pada setiap posisi ketujuh yang akan berikatan dengan ujung C domain basic. Leusin-leusin pada domain leucine zipper


tersusun dalam struktur α-heliks. Domain HLH mempunyai struktur yang menyerupai domain leucine zipper, kecuali dalam hal adanya suatu kala rantai polipeptida yang memisahkan kedua α-heliks protein monomeriknya. Seperti halnya leucine zipper, motif HLH sering kali dijumpai berdekatan dengan domain basic yang memerlukan dimerisasi dalam pengikatan DNA.

Domain aktivasi transkripsi dapat berupa domain aktivasi asam, domain kaya glutamin, atau domain kaya prolin. Domain aktivasi asam mengandung banyak sekali residu asam amino yang bersifat asam sehingga sering disebut juga dengan ’gumpalan asam’ atau ’gumpalan negatif’. Masih belum diketahui dengan pasti gambaran struktur lainya yang diperlukan oleh domain ini agar dapat berfungsi sebagai domain aktivasi transkripsi yang efisien. Domain kaya glutamin pertama kali ditemukan pada faktor transkripsi SP1. Pada domain ini banyak sekali ditemukan residu glutamin. Begitu juga, pada domain kaya prolin banyak sekali ditemukan residu prolin.

Regulasi transkripsi dapat terjadi melalui interaksi tidak langsung dengan fungsi suatu faktor transkripsi, antara lain dengan blokade tempat pengikatan faktor transkripsi pada DNA (seperti pada kebanyakan represor prokariot), pembentukan kompleks pengikatan non-DNA (misalnya protein inhibitor Id yang tidak mempunyai domain pengikatan DNA akan menggangu interaksi protein HLH dengan DNA), dan blokade domain aktivasi faktor transkripsi meskipun pengikatannya pada DNA tetap berlangsung (misalnya Gal80 akan menutupi domain aktivasi faktor transkrispi Gal4 pada khamir). Di samping itu, penghambatan transkripsi dapat juga terjadi secara langsung karena adanya domain tertentu pada represor. Sebagai contoh, suatu domain reseptor hormon tiroid pada mamalia akan menekan transkripsi apabila tidak ada hormon tiroid dan akan mengaktifkannya apabila terikat pada hormon tersebut. Begitu pula, produk gen tumor Wilms berupa protein WT1 yang akan menekan tumor, mempunyai domain represor spesifik yang banyak mengandung prolin.

Prosesing RNA

Bila dibandingkan dengan transkripsi, translasi merupakan proses yang lebih rumit karena melibatkan fungsi berbagai makromolekul. Oleh karena kebanyakan di antara makromolekul ini terdapat dalam jumlah besar di dalam sel, maka sistem translasi menjadi bagian utama mesin metabolisme pada tiap sel. Makromolekul yang harus berperan dalam proses translasi tersebut meliputi


1. Lebih dari 50 polipeptida serta 3 hingga 5 molekul RNA di dalam tiap ribosom 2. Sekurang-kurangnya 20 macam enzim aminoasil-tRNA sintetase yang akan mengaktifkan

asam amino 3. Empat puluh hingga 60 molekul tRNA yang berbeda 4. Sedikitnya 9 protein terlarut yang terlibat dalam inisiasi, elongasi, dan terminasi

polipeptida.

Ribosom

Translasi, atau pada hakekatnya sintesis protein, berlangsung di dalam ribosom, suatu struktur organel yang banyak terdapat di dalam sitoplasma. Ribosom terdiri atas dua subunit, besar dan kecil, yang akan menyatu selama inisiasi translasi dan terpisah ketika translasi telah selesai. Ukuran ribosom sering dinyatakan atas dasar laju pengendapannya selama sentrifugasi sebagai satuan yang disebut satuan Svedberg (S). Pada kebanyakan prokariot ribosom mempunyai ukuran 70S, sedangkan pada eukariot biasanya sekitar 80S.

Tiap ribosom mempunyai dua tempat pengikatan tRNA, yang masing-masing dinamakan tapak aminoasil (tapak A) dan tapak peptidil (tapak P). Molekul aminoasil-tRNA yang baru memasuki ribosom akan terikat di tapak A, sedangkan molekul tRNA yang membawa rantai polipeptida yang sedang diperpanjang terikat di tapak P.

Gambaran penting sintesis protein adalah bahwa proses ini berlangsung dengan arah tertentu sebagai berikut.

1. Molekul mRNA ditranslasi dengan arah 5’→ 3’, tetapi tidak dari ujung 5’ hingga ujung 3’. 2. Polipeptida disintesis dari ujung amino ke ujung karboksil dengan menambahkan asam-

asam amino satu demi satu ke ujung karboksil. Sebagai contoh, sintesis protein yang mempunyai urutan NH2-Met-Pro- . . . -Gly-Ser-COOH pasti dimulai dengan metionin dan diakhiri dengan serin.

Proses Translasi

Mekanisme translasi atau sintesis protein secara skema garis besar dapat dilihat pada Gambar 6.1. Sebuah molekul mRNA akan terikat pada permukaan ribosom yang kedua subunitnya telah bergabung. Pengikatan ini terjadi karena pada mRNA prokariot terdapat urutan basa tertentu yang disebut sebagai tempat pengikatan ribosom (ribosom binding site) atau urutan Shine-Dalgarno. Sementara itu, pada eukariot pengikatan ribosom dilakukan oleh ujung 5’ mRNA. Selanjutnya, berbagai aminoasil-tRNA akan berdatangan satu demi satu ke kompleks ribosom-mRNA ini dengan urutan sesuai dengan antikodon dan asam amino yang dibawanya. Urutan ini ditentukan oleh urutan triplet kodon pada mRNA. Ikatan peptida terbentuk di antara asam-asam amino yang terangkai menjadi rantai polipeptida di tapak P ribosom. Penggabungan asam-asam amino terjadi karena gugus amino pada asam amino yang baru masuk berikatan dengan gugus karboksil pada asam amino yang terdapat pada rantai polipeptida yang sedang


diperpanjang. Penjelasan tentang mekanisme sintesis protein yang lebih rinci disertai contoh, khususnya pada prokariot, akan diberikan di bawah ini

Inisiasi sintesis protein dilakukan oleh aminoasil-tRNA khusus, yaitu tRNA yang membawa metionin (dilambangkan sebagai metionil-tRNAi

Met). Hal ini berarti bahwa sintesis semua polipeptida selalu dimulai dengan metionin. Khusus pada prokariot akan terjadi formilasi gugus amino pada metionil-tRNAi

Met (dilambangkan sebagai metionil-tRNAfMet) yang mencegah

terbentuknya ikatan peptida antara gugus amin tersebut dengan gugus karboksil asam amino pada ujung polipetida yang sedang diperpanjang sehingga asam amino awal pada polipeptida prokariot selalu berupa f-metionin. Pada eukariot metionil-tRNAi

Met tidak mengalami formilasi gugus amin, tetapi molekul ini akan bereaksi dengan protein-protein tertentu yang berfungsi sebagai faktor inisiasi (IF-1, IF-2, dan IF-3). Selain itu, baik pada prokariot maupun eukariot, terdapat pula metionil-tRNA yang metioninnya bukan merupakan asam amino awal (dilambangkan sebagai metionil-tRNAMet).

Kompleks inisiasi pada prokariot terbentuk antara mRNA, metionil-tRNAfMet, dan subunit kecil

ribosom (30S) dengan bantuan protein IF-1, IF-2, dan IF-3, serta sebuah molekul GTP. Pembentukan kompleks inisiasi ini diduga difasilitasi oleh perpasangan basa antara suatu urutan di dekat ujung 3’ rRNA berukuran 16S dan sebagian urutan pengarah (leader sequence) pada mRNA. Selanjutnya, kompleks inisiasi bergabung dengan subunit besar ribosom (50S), dan metionil-tRNAf

Met terikat pada tapak P. Berpasangannya triplet kodon inisiasi pada mRNA dengan antikodon pada metionil-tRNAf

Met di tapak P menentukan urutan triplet kodon dan aminoasil-tRNAf

Met berikutnya yang akan masuk ke tapak A. Pengikatan aminoasil-tRNAfMet

berikutnya, misalnya alanil- tRNAala, ke tapak A memerlukan protein-protein elongasi EF-Ts dan


EF-Tu. Pembentukan ikatan peptida antara gugus karboksil pada metionil-tRNAfMet di tapak P

dan gugus amino pada alanil-tRNAala di tapak A dikatalisis oleh enzim peptidil transferase, suatu enzim yang terikat pada subunit ribosom 50S. Reaksi ini menghasilkan dipeptida yang terdiri atas f-metionin dan alanin yang terikat pada tRNAala di tapak A.

Langkah berikutnya adalah translokasi, yang melibatkan (1) perpindahan f-met-ala- tRNAala dari tapak A ke tapak P dan (2) pergeseran posisi mRNA pada ribosom sepanjang tiga basa sehingga triplet kodon yang semula berada di tapak A masuk ke tapak P. Dalam contoh ini triplet kodon yang bergeser dari tapak A ke P tersebut adalah triplet kodon untuk alanin. Triplet kodon berikutnya, misalnya penyandi serin, akan masuk ke tapak A dan proses seperti di atas hingga translokasi akan terulang kembali. Translokasi memerlukan aktivitas faktor elongasi berupa enzim yang biasa dilambangkan dengan EF-G.

Pemanjangan atau elongasi rantai polipeptida akan terus berlangsung hingga suatu tripet kodon yang menyandi terminasi memasuki tapak A. Sebelum suatu rantai polipeptida selesai disintesis terlebih dahulu terjadi deformilisasi pada f-metionin menjadi metionin. Terminasi ditandai oleh terlepasnya mRNA, tRNA di tapak P, dan rantai polipeptida dari ribosom. Selain itu, kedua subunit ribosom pun memisah. Pada terminasi diperlukan aktivitas dua protein yang berperan sebagai faktor pelepas atau releasing factors, yaitu RF-1 dan RF-2.

Sesungguhnya setiap mRNA tidak hanya ditranslasi oleh sebuah ribosom. Pada umumnya sebuah mRNA akan ditranslasi secara serempak oleh beberapa ribosom yang satu sama lain berjarak sekitar 90 basa di sepanjang molekul mRNA. Kompleks translasi yang terdiri atas sebuah mRNA dan beberapa ribosom ini dinamakan poliribosom atau polisom. Besarnya polisom sangat bervariasi dan berkorelasi dengan ukuran polipeptida yang akan disintesis. Sebagai contoh, rantai hemoglobin yang tersusun dari sekitar 150 asam amino disintesis oleh polisom yang terdiri atas lima buah ribosom (pentaribosom).

Pada prokariot translasi seringkali dimulai sebelum transkripsi berakhir. Hal ini dimungkinkan terjadi karena tidak adanya dinding nukleus yang memisahkan antara transkripsi dan translasi. Dengan berlangsungnya kedua proses tersebut secara bersamaan, ekspresi gen menjadi sangat cepat dan mekanisme nyala-padam (turn on-turn off) ekspresi gen, seperti yang akan dijelaskan nanti, juga menjadi sangat efisien.

Namun, tidak demikian halnya pada eukariot. Transkripsi terjadi di dalam nukleus, sedangkan translasi terjadi di sitoplasma (ribosom). Pertanyaan yang muncul adalah bagaimana mRNA hasil transkripsi dipindahkan dari nukleus ke sitoplasma, faktor-faktor apa yang menentukan saat dan tempat translasi? Sayangnya, hingga kini kita belum dapat menjawab pertanyaan-pertanyaan tersebut dengan memuaskan. Kita baru mengetahui bahwa transkripsi dan translasi pada eukariot jauh lebih rumit daripada proses yang ada pada prokariot. Salah satu di antaranya seperti telah kita bicarakan di atas, yaitu bahwa mRNA hasil transkripsi (transkrip primer) pada eukariot memerlukan prosesing terlebih dahulu sebelum dapat ditranslasi.

Kode Genetik


Penetapan triplet kodon pada mRNA sebagai pembawa informasi genetik atau kode genetik yang akan menyandi pembentukan suatu asam amino tertentu berawal dari pemikiran bahwa macam basa nitrogen jauh lebih sedikit daripada macam asam amino. Basa nitrogen pada mRNA hanya ada empat macam, sedangkan asam amino ada 20 macam. Oleh karena itu, jelas tidak mungkin tiap asam amino disandi oleh satu basa. Begitu juga, kombinasi dua basa hanya akan menghasilkan 42 atau 16 macam duplet, masih lebih sedikit daripada macam amino yang ada. Kombinasi tiga basa akan menghasilkan 43 atau 64 triplet, melebihi jumlah macam asam amino. Dalam hal ini, satu macam asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu macam triplet kodon.

Bukti bahwa kode genetik berupa triplet kodon diperoleh dari hasil penelitian F.H.C. Crick dan kawan-kawannya yang mempelajari mutasi pada lokus rIIB bakteriofag T4. Mutasi tersebut diinduksi oleh proflavin, suatu molekul yang dapat menyisip di sela-sela pasangan basa nitrogen sehingga kesalahan replikasi DNA dapat terjadi sewaktu-waktu, menghasilkan DNA yang kelebihan atau kekurangan satu pasangan basa. Hal ini akan menyebabkan perubahan rangka baca (reading frame), yaitu urutan pembacaan basa-basa nitrogen untuk diterjemahkan menjadi urutan asam amino tertentu. Mutasi yang disebabkan oleh perubahan rangka baca akibat kelebihan atau kekurangan pasangan basa disebut sebagai mutasi rangka baca (frameshift mutation) (lihat Bab VIII).

Jika mutan (hasil mutasi) rangka baca yang diinduksi oleh proflavin ditumbuhkan pada medium yang mengandung proflavin, akan diperoleh beberapa fag tipe liar sehingga mutasi seolah-olah dapat dipulihkan atau terjadi mutasi balik (reverse mutation). Pada awalnya mutasi balik diduga karena kelebihan pasangan basa dibuang dari rangka baca yang salah sehingga rangka baca tersebut telah diperbaiki menjadi seperti semula. Namun, karena mutasi bersifat acak, maka mekanisme semacam itu kecil sekali kemungkinannya untuk terjadi dan dugaan tersebut nampaknya tidak benar. Crick dan kawan-kawannya menjelaskan bahwa mutasi balik disebabkan oleh hilangnya (delesi) satu pasangan basa lain yang letaknya tidak terlalu jauh dari pasangan basa yang menyisip (adisi). Rangka baca yang baru ini akan menghasilkan urutan asam amino yang masih sama fungsinya dengan urutan sebelum terjadi mutasi. Dengan perkataan lain, mutasi balik terjadi karena efek mutasi awal akibat penambahan basa ditekan oleh mutasi kedua akibat pengurangan basa sehingga mutasi yang kedua ini disebut juga sebagai mutasi penekan (suppressor mutation).

Tabel Kode genetic


Protein rIIB pada T4 mempunyai bagian-bagian yang di dalamnya dapat terjadi perubahan urutan asam amino. Perubahan ini dapat berpengaruh atau tidak berpengaruh terhadap fungsi proteinnya. Jika dua strain mutan T4 yang satu sama lain mengalami mutasi berbeda di dalam bagian protein rIIB disilangkan melalui infeksi campuran pada suatu inang, maka T4 tipe liar akan diperoleh sebagai hasil rekombinasi genetik antara kedua tempat mutasi yang berbeda itu. Akan tetapi, ketika kedua strain mutan rIIB yang disilangkan merupakan strain-strain yang diseleksi secara acak (tidak harus mengalami mutasi yang berbeda), ternyata tidak selalu diperoleh tipe liar. Hasil ini menunjukkan bahwa strain-strain mutan dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu strain + dan strain -. Dalam hal ini, strain + tidak harus selalu mutan adisi, dan strain – tidak harus selalu mutan delesi. Namun, sekali kita menggunakan tanda + untuk mutan adisi berarti strain + adalah mutan adisi. Begitu pula sebaliknya, sekali kita gunakan tanda + untuk mutan delesi berarti strain + adalah mutan delesi.

Persilangan antara strain + dan strain – hanya menghasilkan rekombinasi berupa fenotipe tipe liar, sedangkan persilangan antara sesama + atau sesama – tidak pernah menghasilkan tipe liar. Hal ini karena persilangan sesama + atau sesama – akan menyebabkan adisi atau delesi ganda sehingga selalu menghasilkan fenotipe mutan. Sementara itu, persilangan antara starin + dan – akan menyebabkan terjadinya mutasi penekan (adisi ditekan oleh delesi atau delesi ditekan oleh adisi) atau hanya menghasilkan mutasi pada urutan asam amino yang tidak berpengaruh terhadap fungsi protein sehingga diperoleh fenotipe tipe liar.

Oleh karena persilangan sesama + atau sesama – tidak pernah menghasilkan tipe liar, kode genetik jelas tidak mungkin terdiri atas dua basa. Seandainya, kode genetik berupa duplet,


maka akan terjadi pemulihan rangka baca hasil persilangan tersebut. Kenyataannya tidak demikian. Pemulihan rangka baca akibat mutasi penekan justru terjadi apabila persilangan dilakukan antara strain + dan strain -.

Apabila kode genetik berupa triplet, maka persilangan teoretis sesama + atau sesama – akan menghasilkan fenotipe mutan, sesuai dengan hasil kenyataannya. Namun, rekombinasi antara tiga + atau tiga – akan menghasilkan tipe liar. Hal ini memperlihatkan bahwa kode genetik terdiri atas tiga basa.

a) Jika kode genetik berupa duplet, hasil persilangan teoretis tidak sesuai dengan kenyataan yang diperoleh.

b) Jika kode genetik berupa triplet, hasil persilangan teoretis sesuai dengan kenyataan yang diperoleh.

Sifat-sifat kode genetik

Kode genetik mempunyai sifat-sifat yang akan dijelaskan sebagai berikut.

1. Kode genetik bersifat universal. Artinya, kode genetik berlaku sama hampir di setiap spesies organisme.

2. Kode genetik bersifat degenerate atau redundant, yaitu bahwa satu macam asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Sebagai contoh, treonin dapat disandi oleh ACU, ACC, ACA, dan ACG. Sifat ini erat kaitannya dengan sifat wobble basa ketiga, yang artinya bahwa basa ketiga dapat berubah-ubah tanpa selalu disertai perubahan macam asam amino yang disandinya. Diketahuinya sifat wobble bermula dari penemuan basa inosin (I) sebagai basa pertama pada antikodon tRNAala ragi, yang ternyata dapat berpasangan dengan basa A, U, atau pun C. Dengan demikian, satu antikodon pada tRNA dapat mengenali lebih dari satu macam kodon pada mRNA.

3. Oleh karena tiap kodon terdiri atas tiga buah basa, maka tiap urutan basa mRNA, atau berarti juga DNA, mempunyai tiga rangka baca yang berbeda (open reading frame). Di samping itu, di dalam suatu segmen tertentu pada DNA dapat terjadi transkripsi dan translasi urutan basa dengan panjang yang berbeda. Dengan perkataan lain, suatu segmen DNA dapat terdiri atas lebih dari sebuah gen yang saling tumpang tindih (overlapping). Sebagai contoh, bakteriofag фX174 mempunyai sebuah untai tunggal DNA yang panjangnya lebih kurang hanya 5000 basa. Seandainya dari urutan basa ini hanya digunakan sebuah rangka baca, maka akan terdapat sekitar 1700 asam amino yang dapat disintesis. Kemudian, jika sebuah molekul protein rata-rata tersusun dari 400 asam amino, maka dari sekitar 1700 asam amino tersebut hanya akan terbentuk 4 hingga 5 buah molekul protein. Padahal kenyataannya, bakteriofag фX174 mempunyai 11 protein yang secara keseluruhan terdiri atas 2300 asam amino. Dengan demikian, jelaslah bahwa dari urutan basa DNA yang ada tidak hanya digunakan sebuah rangka baca, dan urutan basa yang diekspresikan (gen) dapat tumpang tindih satu sama lain

BAB III Biokimia dan Biologi...

Documents

Transcript of BAB III Biokimia dan Biologi...