i

OPTIMASI ISOLASI DNA DAN PCR-RAPDPADA TANAMAN GARUT (Maranta arundinacea L.)

LOKAL DIY

SKRIPSI

Untuk memenuhi sebagian persyaratanmencapai derajat Sarjana Sains S-1 pada Program Studi Biologi

disusun oleh

Nor Setyowati08640015

PROGRAM STUDI BIOLOGIFAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN KALIJAGA YOGYAKARTA

2013

ffirfflr3

UniversirqsrsromNegerisunonKorijogo FM-UrNSK-BM-O5-O7/RO

PENGESAHAN SKRIPSI/TUGAS AKHIR

Skripsi/Tugas Akhir dengan judul

urN. 02lD. Sr/ PP.0L. t I 32s2 I 20 t3

"Optimasi Isolasi DNA dan RApD_pCR pada Tanaman Garut(Maranta arundinacea L.) Lokal DIy"

Yang dipersiapkan dan disusun olehNama

NIM

Telah dimunaqasyahkan padaNilai Munaqasyah

Nor Setyowati

08640015

15 Agustus 2013

A-Dan dinyatakan telah diterima oleh Fakultas sains dan Teknologi UIN sunan Kalijaga

TIM MUNAQASYAH I

Ketua Sidang

Anti Damayanti H., S.Si., M.Mol.BioNrP.19810522 200604 2 oO5

penguji.Jl

------/a.l\ /ft,q^-----.--J_--\Ika NugraheniA.M., S.Si., M.SiNIP. NrP. 19800207 2o}g72 2 oo2

Yogyakarta, 15 Oktober 2013

Drs. H.Z

Mi

Jumailatus S.Si., M.Biotech200501 2 007

at*\,u^,!i:,ro;\fr ";1"4'sil

ffi,6r,L*/^fs,li

l<* \-".

UIN Sunan Kalijagaakultas r\ains dan Teknologi

19580919

SUBAT PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI

Yang bertanda tangair di bawah ini:

: Nor Setyowati

: 08640015

: Biologi/X

: Sains dan Teknologi

Nama

NIM

Prodiffimt

Fakultas

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan

untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruat Tinggi, dan sepaojang

pengetahuiul saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau

diterbitkan orang lain, kecuali yang secara terfulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan

dalam daftar pustaka.

Yogyakarta, 3 1 Juli 2013

Ygng Menyatakan,

+Etr,HW,rtrrwsr.srwMr \qpf

8?996A8F286862025

6b^ffi@Nor SetvowatiMM.08640015

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Secara khusus karya ini penulis persembahkan kepada:

Almamaterku, Program Studi Biologi Fakultas Sains Dan Teknologi Universitas

Islam Negeri Sunan Kalijaga Yogyakarta;

Kotaku Ngayogyakarta Hadiningrat tempat eksplorasi dan penelitian ini

dilaksanakan;

Tanah Airku Indonesia Raya tercinta.

v

MOTTO

Kehidupan ini meminta dua hal saja setelah keimanan kita, yaitu penerimaan yang

utuh terhadap apa yang sudah terjadi dan menjadikan yang sudah terjadi sebagai

perintah untuk memperbaiki diri.

Menerima yang sudah terjadi menjadikan kita pribadi yang pantas untuk naik

kelas ke kehidupan yang lebih baik.

(Sis Maryono Teguh)

vi

KATA PENGANTAR

Ketahanan pangan sudah menjadi perhatian pemerintah semenjak awal

tahun 50-an. Akan tetapi, alih-alih menuju kestabilan, Indonesia justru tengah

menghadapi krisis pangan. Ironisnya Indonesia adalah negara dengan

keanekaragaman hayati tertinggi kedua di dunia. Hal tersebut memacu pemerintah

pusat maupun daerah termasuk Yogyakarta untuk serius menggarap kegiatan

diversifikasi pangan dengan kembali mengangkat tanaman lokal terutama umbi-

umbian yang semenjak awal sudah dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai bahan

makanan utama penghasil karbohidrat.

Salah satu jenis umbi-umbian yang prospek ekonomi dan pengembangnnya

cukup baik di Yogyakarta adalah Maranta arundinacea L. atau yang luas dikenal

sebagai garut. Masalah yang dijumpai dalam proses budidaya garut adalah

jarangnya program penelitian tanaman garut di bidang agronomi dan belum

tersedianya kultivar unggul yang siap dibudidayakan secara komersial.

Perbanyakan tanaman garut umumnya berlangsung secara aseksual sehingga

keturunan yang dihasilkan, secara genetik akan serupa dengan induknya.

Perkembangbiakan secara seksual merupakan salah satu penyebab munculnya

keragaman genetik, yaitu melalui terjadinya pindah silang antar kromosom dalam

proses pembentukan sel gamet. Perbedaan karakter dilapangan seperti produksi

dan kadar pati diduga merupakan indikasi adanya keragaman genetik, yang sangat

bermanfaat untuk program pemuliaan tanaman.

Identifikasi keragaman genetik tanaman garut dapat dilakukan pada tingkat

morfologi, protein, dan DNA. Analisis klasik yang telah lama dilakukan adalah

identifikasi berdasarkan marka morfologi, namun hasilnya kurang akurat karena

sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan subyektifitas peneliti. Analisis

genetika molekuler tumbuhan tergantung pada kualitas sampel DNA serta kondisi

optimum reaksi. Oleh karena itu sebagai langkah awal dilakukan Optimasi Isolasi

DNA dan PCR-RAPD pada Tanaman Garut (Maranta arundinacea L.) Lokal

DIY yang bertujuan untuk mendapatkan protokol ekstraksi DNA dan menentukan

kondisi PCR-RAPD yang sesuai untuk daun garut. Diharapkan kedepannya

vii

database penelitian yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis keragaman

genetik dan hubungan kekerabatan tanaman garut di Yogyakarta.

Akhirnya bersama dengan terselesaikannya penelitian dan karya tulis ilmiah

ini, yang tentunya berkat keridhoan dari Tuhan Yang Maha Esa serta kerjasama

dan dukungan dari berbagai pihak terkait, maka dengan segala kerendahan hati

dan tanpa mengurangi rasa hormat kepada segala pihak yang tidak dapat

disebutkan satu per satu, penulis mengucapkan terimakasih sedalam-dalamnya

kepada:

1. Prof. Drs. H. Akh. Minhaji, M.A, Ph.D selaku Dekan Fakultas Sains

Dan Teknologi.

2. Ibu Anti Damayanti Hamdani., MMolBio, selaku Ketua Program Studi

Biologi dan Dosen Pembimbing yang telah memberikan kesempatan

kepada penulis untuk melaksanakan penelitian ini hingga akhir. Ucapan

terimakasih yang sedalam-dalamnya juga penulis haturkan atas

kebijaksanaannya dalam menyediakan dan memberikan banyak sekali

fasilitas dan persetujuan yang mendukung segera terlaksana dan

terselesaikannya penelitian dan penulisan naskah skripsi ini.

3. Ibu Jumailatus Solihah, M. Biotech., selaku kepala Laboratorium

Genetika yang telah menyediakan serta memberikan fasilitas dan

persetujuan atas terlaksana dan terselesaikannya penelitian ini. Ucapan

terimakasih juga dihaturkan kepada dosen penguji I atas kesediaan dan

kebijaksanaannya dalam memberikan saran dan perbaikan baik dalam

naskah skripsi maupun dalam pemahaman penulis.

4. Ibu Ika Nugraheni A.M. M.Si selaku dosen penguji II atas kesediaan dan

kebijaksanaannya dalam memberikan saran dan perbaikan baik dalam

naskah skripsi maupun dalam pemahaman penulis.

5. Ibu Siti Aisah, M. Si., selaku Dosen Penasihat Akademik.

6. Dony Eko Sputro S. Pd. I, Festy Auliaur Rahmah, S.Si, beserta segenap

Staf Laboratorium Terpadu Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga

Yogyakarta yang telah memberikan kebijaksanaannya dalam

penggunaan fasilitas-fasilitas laboratorium.

viii

7. Ketulusan seluruh pemilik kebun garut di wilayah Gunung Kidul, Kulon

Progo, Sleman, dan Bantul Yogyakarta tempat penulis mengambil

sampel. Semoga peran serta beliau dalam mendukung penelitian ini

dapat memberikan kontribusi bagi kemajuan dan perkembangan kota

dan bangsa ini kedepannya.

8. Merry Kusmiyati, Habibie Musthafa, Elma Safraini, Edi Firdaus, beserta

seluruh keluarga besar mahasiswa Biologi UIN Sunan Kalijaga

Yogyakarta terkhusus angkatan 2008 yang telah mengindahkan

kehidupan penulis dengan persahabatan.

9. Ayahanda Sugiyatno, Ibunda Saerah, dan Ananda Mia Setia Bekti, yang

telah mengorbankan banyak hal untuk mencintai penulis dalam seluas-

luasnya arti.

Semoga kita semua senantiasa berada dalam keberkahan dan kasih sayang

Tuhan Yang Maha Esa. Akhirnya, penulis sungguh berharap tulisan ini dapat

bermanfaat dalam arti yang seluas-luasnya. Oleh karena itu penulis akan sangat

menghargai saran dan perbaikan yang membangun terhadap naskah skripsi ini

sebagai bahan pertimbangan untuk penyempurnaan di masa mendatang.

Yogyakarta, Agustus 2013

Penulis

ix

ABSTRAK

Umbi garut (Maranta arundinacea L.) merupakan salah satu jenis tanaman di DIY yang proses budidaya komersialnya terkendala pada belum tersedianya kultivar unggul. Untuk mendapatkan indukan unggul tanaman garut yang akurat, disamping informasi morfologi juga diperlukan informasi mengenai keragaman genetik tanaman. Analisis genetika molekuler tumbuhan tergantung pada kualitas sampel DNA serta kondisi optimum reaksi. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menentukan metode ekstraksi DNA yang tepat untuk diaplikasikan pada daun garut serta menentukan kondisi optimum untuk reaksi PCR-RAPD. Modifikasi metode ekstraksi DNA standar menggunakan buffer ekstraksi CTAB yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1990) mampu menghasilkan DNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik dan konsisten dibandingkan dengan metode ekstraksi DNA Deng et al. (1995). Sebanyak dua puluh dua kuncup daun garut perwakilan masing-masing kabupaten di DIY dan dua kuncup daun lengkuas yang diekstraksi menggunakan metode CTAB Doyle & Doyle (1990) menghasilkan DNA dengan konsentrasi = 244.14-1446.46 µg/mldan rentang nilai A260/A280 = 1.60-2.00, A260 = 0.09-0.57, dengan rincian 15 sampel memiliki kisaran rasio A260/A280 = 1.82-1.99, 7 sampel memiliki kisaran rasio A260/A280 = 1.71-1.78, sementara 2 sampel sisanya memiliki rasio A260/A280 = 1.60 dan 2.0. Amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR-RAPD masih memerlukan optimasi, terutama pada kondisi dan komponen reaksi yang ideal dan efisien untuk diterapkan pada garut. Kondisi PCR yang diterapkan belum mampu mengamplifikasi keseluruhan sampel yang diujikan. Selain itu, polimorfisme yang dihasilkan masih rendah serta masih ditemui satu sampel DNA yang tidak teramplifikasi.

Kata kunci : garut (Maranta arundinacea L.), isolasi DNA, PCR-RAPD

x

ABSTRACT

Arrowroot (Maranta arundinacea L) is one of tuber crops in Daerah Istimewa Yogyakarta that its commercial cultivation restricted by unavailability of high yield varieties. The information about genetic variation besides morphology information is needed to get accurate superior characteristic of parental plant.Molecular genetic analysis of plants relies on high yield and high purity of DNA as well as optimized condition of molecular reactions. This study aimed to develop suitable protocol for DNA extraction from M. arundinacea leaf and to optimize condition of RAPD-PCR. Modification of standard plant DNA extraction by Doyle & Doyle (1990) consistently yielded good purity and quantity of DNA than that of Deng et al., (1995) method. Application of Doyle & Doyle (1990) extraction method in twenty-two garut leaf bud, representations of each regency in DIY, and two ginger plant leaf buds yielded DNA concentration from 244.14 to 1446.46 µg/ml with A260/A280 ranged between 1.60 to 2.00, and A260

ranged between 0.09 to 0.57. In details, 15 samples had A260/A280 value from 1.82 to 1.99, 7 sample had the value of A260/A280 from 1.71 to 1.78, and the remaining two had A260/A280 value of 1.60 and 2.0. Optimization of PCR conditions for RAPD analysis of Garut was still needed because the applied PCR condition had not amplified all tested samples and the amplicons showed low polimorfism.

Keywords: DNA extraction, garut (Maranta arundinacea L.), RAPD-PCR

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL

HALAMAN PENGESAHAN

HALAMAN PERNYATAAN

HALAMAN PERSEMBAHAN

HALAMAN MOTTO

HALAMAN KATA PENGANTAR.................................................................. vi

ABSTRAK ......................................................................................................... ix

ABSTRACT....................................................................................................... x

DAFTAR ISI...................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL.............................................................................................. xiii

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... xv

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang ....................................................................................... 1B. Rumusan Masalah .................................................................................. 5C. Tujuan Penelitian ................................................................................... 6D. Manfaat Penelitian ................................................................................. 6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Garut (Maranta arundinacea L.) Sebagai Tanaman Pangan Alternatif 7B. Metabolit Sekunder Tanaman Obat ....................................................... 11C. Ekstraksi DNA ...................................................................................... 13D. Polymerase Chain Reaction (PCR) – Random Amplified Polymorphic

DNA (RAPD) ....................................................................................... 19

BAB III METODE PENELITIAN

A. Alat dan Bahan....................................................................................... 24B. Prosedur Kerja........................................................................................ 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian ...................................................................................... 36B. Pembahasan............................................................................................ 47

xii

BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan ............................................................................................ 54B. Saran....................................................................................................... 55

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 56

LAMPIRAN....................................................................................................... 62

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Kandungan Gizi Tepung Garut dan Tepung Terigu per 100 gram...... 10

Tabel 2. Lokasi Pengambilan Sampel Garut...................................................... 25

Tabel 3. Metode Isolasi DNA Genom dari Daun Garut..................................... 28

Tabel 4. Primer RAPD ....................................................................................... 32

Tabel 5. Bahan Amplifikasi DNA (PCR Mix)................................................... 32

Tabel 6. Program PCR pada Mesin PCR ........................................................... 33

Tabel 7. Bahan Amplifikasi DNA (PCR Kit Roche) ......................................... 33

Tabel 8. Program PCR Pada Mesin Thermocycler ............................................ 34

Tabel 9. Optimasi PCR-RAPD .......................................................................... 34

Tabel 10. Hasil Spektofotometer DNA Metode 1.............................................. 37

Tabel 11. Hasil Spektofotometer DNA Metode 2-10 ........................................ 39

Tabel 12. Hasil Spektofotometer DNA Metode 10............................................ 41

Tabel 13. Sampel DNA Terseleksi..................................................................... 43

Tabel 14. Hasil Optimasi PCR-RAPD............................................................... 44

Tabel 15. Sampel DNA Terseleksi..................................................................... 46

Tabel 16. Hasil PCR........................................................................................... 46

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Garut................................................................................................. 9

Gambar 2. Struktur dasar nukleotida ................................................................. 14

Gambar 3. Struktur dasar basa nitrogen asam nukleat....................................... 14

Gambar 4. Ikatan phosphodiester antarnukleotida............................................. 14

Gambar 5. Daun garut ........................................................................................ 28

Gambar 6. Ukuran DNA ladder (Microzone Ltd.) ............................................ 35

Gambar 7. Hasil Elektroforesis DNA tanaman garut yang diisolasi dari 8 Kecamatan (4 Kabupaten) di Yogyakarta menggunakan metode 1................... 38

Gambar 8. Hasil Elektroforesis DNA satu spesies tanaman garut yang diisolasi dari Kecamatan Pengasih, Kulon Progo, Yogyakarta menggunakan metode 2-9.......................................................................................................... 39

Gambar 9. Hasil Elektroforesis DNA tanaman garut yang diisolasi dari 8 Kecamatan (4 Kabupaten) di Yogyakarta menggunakan metode 10................. 42

Gambar 10. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 4 dan suhu annealing 37º C pada agarosa 0,8% ...................................................................................................... . 64

Gambar 11. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 4 dan suhu annealing 30º C pada agarosa 0,8% ...................................................................................................... . 65

Gambar 12. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 1 dan suhu annealing 28º C pada agarosa 0,8% ...................................................................................................... 66

Gambar 13. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut Pajangan, Bantul dengan suhu annealing 28º C pada agarosa 1%. .......... 67

Gambar 14. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 1 dan suhu annealing 27º C pada agarosa 1.2 %. .................................................................................................... 68

Gambar 15. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 9 dan suhu annealing 27º C pada agarosa 1.2 %. .................................................................................................... 69

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Protokol penggunaan alat spektrofotometer ..................................62

Lampiran 2. Hasil elektroforesis optimasi PCR.................................................64

Lampiran 3. Hasil elektroforesis PCR ...............................................................68

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Ketahanan pangan suatu negara merupakan salah satu tolak ukur

keberhasilan pembangunan ekonomi nasional (Suryana, 2008). Dengan

potensi keanekaragaman hayati tertinggi ke dua di dunia setelah Brazil,

Indonesia seharusnya mampu memenuhi kebutuhan pangan domestiknya

(Setyowati & Rahayu, 2005). Akan tetapi, krisis dalam berbagai bidang pada

tahun 1998 telah mengantarkan Indonesia pada predikat negara pengimpor

beras terbesar di dunia (Sastra, 2002; Lassa, 2009). Pada tahun 2000 impor

beras, gandum, jagung, kedelai, kacang tanah, gula pasir, dan bawang putih

mencapai 16,62 triliyun (HKTI, 2001 dalam Sastra, 2002).

Untuk menanggulangi terjadinya krisis pangan yang mengancam

ketahanan pangan, presiden RI Ke-6 mencetuskan program revitalisasi

pertanian pada tahun 2005. Program revitalisasi pertanian memiliki tujuan

utama untuk memantapkan ketahanan pangan yang keberhasilannya ditandai

dengan tercapainya swasembada beras maupun non-beras. Salah satu upaya

yang dilakukan untuk mencapai swasembada non-beras adalah dengan

membudidayakan tanaman alternatif lokal selain beras seperti umbi-umbian

dan jagung (Lassa, 2009; Djaafar et al., n.d). Umbi-umbian merupakan salah

satu bagian dari tanaman yang memiliki peranan penting di bidang pangan

karena kandungan karbohidratnya yang tinggi (Richana & Sunarti, 2004).

2

Berbagai macam jenis umbi yang tersebar luas di Indonesia belum

termanfaatkan dengan baik, terutama setelah diberlakukannya ‘politik beras’

yang menjadikan konsumsi beras sebagai tolak ukur kesejahteraan masyarakat

dan penggunaan bahan pangan sebagai sumber energi alternatif (Richana &

Sunarti, 2004; Siahaan, n.d).

Salah satu jenis umbi yang cukup banyak ditemui di Indonesia adalah

garut (Maranta arundinacea L.) atau yang dalam bahasa Inggris disebut

sebagai arrow-root. Tanaman garut sudah cukup lama dikembangkan di DIY,

terutama karena tekstur pati yang dihasilkan relatif lebih halus dibandingkan

dengan tekstur pati jagung, singkong, dan umbi-umbian lainnya, sehingga

memiliki nilai ekonomi yang cukup baik (Djaafar et al., 2010; Sastra, 2002).

Tepung dari garut juga sudah banyak digunakan sebagai bahan baku

pembuatan makanan tradisional seperti mie, kue, es krim, maupun keripik dan

emping. Menurut laporan Ditjen tanaman pangan tahun 2009 tepung garut

memiliki kandungan lemak yang lebih rendah jika dibandingkan dengan

tanaman umbi-umbian lainnya (Tintin & Hadiatmi, 2009). Sementara

kandungan kalori yang dimiliki oleh garut hampir setara dengan jumlah kalori

tepung terigu dan beras. Selain kandungan lemak yang rendah, umbi garut

juga memiliki indeks glikemik yang rendah sehingga dapat digunakan sebagai

sumber energi pengganti beras bagi penderita diabetes (Djaafar et al., n.d).

Di DIY, persebaran tanaman garut berada di empat kabupaten, yaitu

Bantul (Kecamatan Sedayu dan Pajangan), Kulon Progo (Kecamatan Sentolo,

Lendah, dan Pengasih), Sleman (Kecamatan Prambanan), dan Gunung Kidul

3

(Kecamatan Semin) (Djaafar et al., 2010). Tidak seperti tanaman budidaya

lainnya, garut tidak membutuhkan perawatan khusus, karena kemampuan

adaptasinya terhadap naungan dan lahan marginal. Oleh karena itu, tanaman

ini cukup potensial untuk dikembangkan secara monokultur, terutama di

daerah luar Jawa (Sastra, 2002). Meskipun demikian, budidaya tanaman garut

di beberapa wilayah luar pulau Jawa masih belum dapat dilakukan secara

intensif (Djaafar et al., 2010).

Salah satu faktor yang menjadi penyebab kurang berkembangnya

budidaya tanaman garut adalah belum tersedianya kultivar unggul yang siap

dibudidayakan secara komersial (Sastra, 2002). Salah satu indikator bahwa

tanaman garut dapat dikatakan sebagai kultivar unggul adalah besarnya

kemampuan tanaman dalam menghasilkan tepung dengan kadar pati yang

tinggi. Umumnya umbi garut mengandung pati lebih dari 20% atau dapat

menghasilkan sekitar 17-18% pati jika diekstrak (Chorbishley, 1984 dalam

Handoyo et al., n.d).

Perbedaan kemampuan tanaman garut dalam menghasilkan pati

dipengaruhi oleh keragaman genetik yang dibawa oleh tanaman serta faktor

lingkungan (Sastra, 2002). Untuk mendapatkan tanaman garut yang dapat

digunakan sebagai kultivar unggul diperlukan informasi mengenai keragaman

genetik tanaman. Hal ini dikarenakan proses pemuliaan tanaman dapat

dilakukan ketika ada sumber informasi genetik yang memadai dan juga pola

kekerabatan antara varietas tanaman garut baik secara fenotipik maupun

molekuler (Maftuchah, 2009). Penanda molekuler dapat digunakan untuk

4

menyeleksi tanaman induk yang akan dibudidayakan secara komersial secara

tepat dan efisien (Correa, 1999 dalam Maftuchah, 2009). Hal ini dikarenakan

menurut Lim et al., (1999), penanda molekuler dapat digunakan untuk

mengevaluasi keragaman dan kekerabatan pada tingkat genetik. Studi

kekerabatan dan keragaman genetik untuk spesies yang genomnya belum

diketahui dapat dilakukan dengan analisis RAPD (Tigney et al., 1998 dalam

Roslim et al., 2003). Analisis menggunakan RAPD dapat menghasilkan

keragaman yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan analisis menggunakan

isozim dan RFLP (Liu & Furnier 1993).

Tahapan dalam proses analisis keragaman genetik menggunakan RAPD

yaitu isolasi DNA genom, pemurnian dan penetapan kualitas dan kuantitas

DNA, seleksi primer, dan analisis polimorfisme (Dwiatmini et al., 2003).

Permasalahan yang umum ditemui dalam proses isolasi dan purifikasi DNA

tanaman adalah degradasi DNA oleh enzim endonuklease, tingginya

kandungan polisakarida, senyawa inhibitor seperti polifenol dan metabolit

sekunder lain yang dapat mengganggu reaksi enzimatik (Padmalatha &

Prasad, 2006). Tingkat kemurnian DNA hasil isolasi juga menjadi salah satu

faktor penentu keberhasilan proses amplifikasi DNA menggunakan primer

acak seperti analisis RAPD (Windiastika, 2012; Puchooa, 2004). Protokol

isolasi DNA tanaman dan amplifikasinya menggunakan primer acak telah

banyak dikembangkan, namun tidak setiap prosedur dapat diaplikasikan pada

setiap spesies tanaman sekalipun memiliki hubungan kekerabatan yang dekat

(genus yang sama) (Padmalatha & Prasaad, 2006).

5

Garut merupakan salah satu anggota famili Zingiberaceae yang sangat

resisten terhadap berbagai macam hama dan penyakit tanaman. Hal ini

mengindikasikan adanya senyawa kimia allelopathic yang terdapat pada akar

dan daunnya (Pradeepkumar et al., 2008). Hasil penelitian Pradeepkumar

(2004) menunjukkan bahwa perlukaan buatan pada daun akan menginduksi

sintesis senyawa fenol, polifenol oksidase dan peroksidase sebagai mekanisme

pertahanan. Keberadaan senyawa tersebut dapat menurunkan kualitas DNA

hasil isolasi dan mempengaruhi upaya analisis DNA selanjutnya. Oleh karena

itu, penelitian ini difokuskan pada optimasi ekstraksi DNA dengan

memodifikasi metode ekstraksi. Proses ekstraksi dilakukan dengan

menggunakan dua jenis detergen yang luas dikembangkan untuk isolasi DNA

tanaman yaitu, CTAB dan SDS (Zidani et al., 2005). Selain itu juga dilakukan

optimasi PCR-RAPD dengan melakukan variasi jenis reagen, primer, dan suhu

annealing sehingga protokol kerja yang dihasilkan diharapkan dapat

digunakan untuk analisis keanekaragaman dan hubungan kekerabatan tanaman

garut berbasis PCR-RAPD.

B. RUMUSAN MASALAH

1. Bagaimanakah metode ekstraksi yang optimum untuk isolasi DNA

pada daun garut?

2. Bagaimanakah kondisi PCR yang optimum untuk amplifikasi DNA

menggunakan RAPD pada tanaman garut?

6

C. TUJUAN PENELITIAN

1. Mengetahui metode ekstraksi yang optimum untuk isolasi DNA pada

daun garut.

2. Mengetahui kondisi PCR yang optimum untuk amplifikasi DNA

menggunakan RAPD pada tanaman garut.

D. MANFAAT PENELITIAN

1. Sebagai database penelitian mengenai protokol ekstraksi DNA dan

kondisi reaksi PCR-RAPD yang sesuai untuk daun garut.

2. Sebagai salah satu upaya untuk mendukung upaya pemuliaan tanaman

pangan alternatif lokal yang mempunyai prospek ekonomi yang cukup

baik.

54

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Dari hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa:

1. Modifikasi metode ektraksi menggunakan buffer ekstraksi CTAB yang

dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1990) mampu menghasilkan

DNA dengan kualitas dan kuantitas yang lebih baik dan konsisten

dibandingkan dengan metode ekstraksi DNA Deng et al. (1995). Kondisi

optimum untuk mendapatkan DNA garut adalah dengan penambahan

PVP 2%, penambahan RNase (4µg/ml) yang diinkubasikan pada suhu

(-20ºC) selama satu malam dan sampel berupa kuncup daun garut segar

yang dipotong kecil-kecil sebelum dibekukan pada suhu (-80ºC) selama

kurang dari tiga hari.

2. Kondisi PCR menggunakan reagen PCR Kit Roche maupun Mega Mix-

Royal, suhu annealing 37, 30, 29, 28, dan 27º C, dan primer RAPD

Short 1-13 masih memerlukan optimasi lebih lanjut, karena kondisi

tersebut belum mampu mengamplifikasi keseluruhan sampel garut dan

lengkuas (outgroup) yang diujikan. Selain itu tingkat keragaman yang

dihasilkan juga masih rendah.

55

B. Saran

Dengan memperhatikan hasil penelitian yang telah dilakukan,

disarankan pada penelitian berikutnya untuk ekstraksi DNA tanaman dengan

kandungan polisakarida tinggi sebaiknya dipilih daun yang masih kuncup

dan lembut. Kondisi PCR-RAPD yang disarankan adalah menggunakan

reagen PCR Kit karena amplikon yang dihasilkan lebih baik jika

dibandingkan dengan reagen PCR Mix. Akan tetapi, masih perlu dilakukan

optimasi konsentrasi komponen reagen dan jenis primer yang digunakan.

56

DAFTAR PUSTAKA

Abdullah, Y., Schneider, B., & Pettersen, M. (2008). Occurrence of rosmarinic acid, chlorogenic acid, and rutin in Marantacea species. Phytochemistry letters, (199-203).

Abun, Rusmana, D., & Saefulhadjar, D. (2005). Efek ransum menggunakan ampas umbi garut produk fermentasi oleh kapang Aspergillus niger terhadap imbangan efisiensi protein dan konversi ransum pada ayam broiler. Laporan Penelitian Fakultas Peternakan Universitas Padjajaran.

Alzate-Marin, A.L., Guidugli, M.C., Soriani, H.H., Martinez, C.A., & Mestriner, M.A. (2009). An efficient and rapid DNA minipreparation procedure suitable for PCR/SSR and RAPD analyses in tropical forest tree species. Brazilian Archives of Biology and Technology, 52(5), 1217-1224.

Anand, R.M., Nandakumar, N., Karunakaran, L., Ragunathan, M., & Murugan, V. (2005). A survey of medicinal plants in Kollimalai hill tract, Tamil Nandu. Explorer: Research Article.

Ardiana, D.W. (2009). Teknik isolasi DNA genom tanaman pepaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi buffer CTAB. Jurnal Teknik Pertanian, 14 (1), 12-6.

Asada, K. (1992). Ascorbate peroxidase-a hydrogen peroxidase scavenging enzyme in plants. Physiol Plant, 85, 235-241.

Bardakci, F. (2001). Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers. Turk. J. Biol, 25, 185-196.

Candra, I.P. (2011). Keragaman genetik nilam (Pogostemon cablin Benth) yang dibudidayakan di Bali berdasarkan marka Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). [Thesis]. Denpasar: Universitas Udayana.

Cano, M.P., Lobo, M.G., & De Ancos, B. (1998). Peroxidase and polyphenol oxidase in long term frozen stored papaya slices: Differences among hermaphrodite and female papaya fruits. J. Sci. Food Agric, 76, 35-141.

Colpaert, B.N., Cavers, S., Bandou, E., Caron, H., Gheysen, G., & Lowe, A.J. (2005). Sampling tissue for DNA analysis of trees: trunk cambium as an alternative to canopy leaves. Silvae Genetica, 54,6.

Demeke, T., & Adams, R.P. (1994). The use of PCR-RAPD analysis in plant taxonomy and evolution. Boca Raton. CRC Press: 179-191.

Deng, Z.N., Gentile, A., Nicolosi, E., Domina, E., Vardi, A., & Tribulato, E. (1995). Identification on individu and invitro lemon mutans by RAPD markers. J. Hort. Sci, 70(1), 117-125.

57

Dinas Kehutanan Provinsi Jawa Barat. (2012). Jalawure, Tumbuhan Liar Sumber Pangan Alternatif. Diakses 4 Juni 2012 dari Website Resmi Dinas Kehutanan Provinsi Jawa Barat: http://www.garutkab.go.id/pub/news/plain/7553-jalawure-tumbuhan-liar-sumber-pangan-alternatif/

Djaafar, T.F., Rahayu, S., & Murwati. (n.d). Prosiding Seminar Nasional Teknologi Inovatif Pascapanen untuk Pengembangan Industri Berbasis Pertanian: Pengolahan Emping Garut sebagai Salah Satu Bentuk Penganekaragaman Pangan Dalam Rangka Mendukung Kegiatan Industri Rumah Tangga. Diakses 4 Juni 2012, dari http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/26139/prosiding_seminar_teknologi_inovatif_pascapanen-53.pdf?sequence=1

Djaafar, T.F., Sarjiman, & Pustika, A.B. (2010). Pengembangan budi daya tanaman garut dan teknologi pengolahannya untuk mendukung ketahanan pangan. Jurnal Litbang Pertanian, 29(1).

Do, N., & Adams, R.P. (1991). A simple technique of removing plant polysaccharides contaminants from DNA. BioTechniques,10(2), 162-166.

Doyle, J.J., & Doyle, J.L. (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12, 13-15.

Dwiatmini, K., Mattjik, N.A., Aswidinnor, H., & Toruan-Matius, N.L. (2003). Analisis pengelompokan dan hubungan kekerabatan spesies anggrek Phalaenopsis berdasarkan kunci determinasi fenotipik dan marka molekuler RAPD. Jurnal Hortikultura, 13(1), 16-17.

El-Twab, M.H.A., & Zahran, F.A. (2008). Extracting total genomic DNA of Chrysanthemum sensu lato by CTAB and SDS without both liquid nitrogen and phenol. Chromosome Botany, 3, 83-88.

Espelie, K.E., Franceschi, V.R., & Kolattukudy, P.E. (1986). Immunocytochemical localization and time course of appearance of an anionic peroxidase associated with suberization in wound healing potato tuber tissue. Plant Physiol, 81, 487-492.

Faridah, D.N. (2011). Perubahan karakteristik kristalin pati garut (Maranta arundinacea L.) dalam pengembangan pati resisten tipe III. [Disertasi]. Bandung. Institut Pertanian Bogor.

Fillamajor, F.C., & Jukema. (1996). Maranta arundinacea L. Plant resources of South East Asia. Plant Yielding Non-seed Carbohydrates, Prosea, Bogor.

Handoyo, D., & Rudiretna, A. (2001). Prinsip umum pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(1), 17-29.

Ibrahim, R.I.H. (2011). A modified CTAB protocol for DNA extraction from young flower petals of some medicinal plant species. Dalam. Geneconserve, (pp. 165-182). University Khartoum: Sudan.

Karsinah, Sudarsono, Setyobudi, L., & Aswidinnor, H. (2002). Keragaman genetik plasma nutfah jeruk berdasarkan analisis penanda RAPD. Jurnal Bioteknologi Pertanian, 7(1), 8-16.

58

Kimball, J.W. (2008). Biologi (5th ed.) (S. Soetarmi & N. Sugiri, Terj). Jakarta: Erlangga. (Karya asli dipublikasikan 1983).

Lagrimini, L.M. (1991). Wound induced deposition of polyphenols in transgenic plants over expressing peroxidase. Plant Physiol, 96, 577-583.

Lagrimini, L.M., Gingas, V., Finger, F., Rothstein, S., & Liu, T-TY. (1997). Characterization of antisense transformed plants deficient in the tobacco anionic peroxidase. Plant Physiol, 114, 1187-1196.

Lassa, J.A. (2009). Memahami kebijakan pangan dan nutrisi Indonesia: studi kasus Nusa Tenggara Timur 1958-2008. Journal of NTT Studies, 1(1): 29.

Lim, SH., Teng PC., Lee, YH., & Goh, CJ. (1999). RAPD analysis of some species in the genus Vanda (Orchidaceae). Annuals of Botany, 83, 193-196.

Liu Z., & Furnier GR. 1993. Comparison of allozyme, RFLP and RAPD markers for revealing genetic variation within and between Trembling Aspen and Bigtooth Aspen. Theor. Appl. Genet, 87, 97-105.

Maftuchah & Zainudin, A. (2007). Prosiding Inovasi Teknologi Jarak Pagar untuk Mendukung Program Desa Mandiri Energi: Studi Pendahuluan Variasi Genetik Jarak Pagar Lokal (Jathropha curcas L.) berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA.Malang, Jawa Timur: Pusat Pengembangan Bioteknologi Universitas Muhammadiyah Malang.

Maftuchah. (2009). Analisis keragaman genetik tanaman jarak lokal (Jathropha curcas L.) berdasarkan penanda molekuler Random Amplified Polymorphic DNA. GAMMA, 5 (1), 54-62.

Majumder, D.A.N., Hassan, L., Abdurrahim, M., & Kabir, M.A. (2011). Development of an efficient protocol for genomic DNA extraction from Mango (Mangifera indica). Nusantara Bioscience, 3(3), 105-111.

Malinis, A.P., & Pacardo. (2012). Adaptation of arrowroot (Maranta arundinacea) processing technology in typhoon prone marginal ares in Bicol. OIDA International Journal of Suistainable Development, 04:03.

Merh, P.S., Daniel, M., Sabnis, S.D. (1986). Chemistry and taxonomy of some members of the Zingiberales. Curr. Sci. 55, 835-839.

Nkongolo, K.K., Klimaszewska, K., & Gratton, W.S. (1998). DNA yields and optimization of RAPD patterns using spurce embryogenic lines, seedlings, and needles. Plant Mol. Biol. Reporter. 16, 1-9.

Padmalatha, K., & Prasad, M.N.V. (2006). Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of selected medicinal and aromatic plants of conservation concern from Peninsular India. African Journal of Biotechnology, 5(3), 230-234.

59

Pasakinskiene, I., & Paplauskiene, V. (1999). Floral meristems as a source of enhanced yield and quality of DNA in grasses. Plant Cell Reports, 18, 490-492.

Petersen, M., & Simmonds, M.S.J. (2003). Rosmarinic acid. Phytochemistry, 62, 121-125.

Pharmawati, M. (2009). Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada Grevillea spp. (Proteaceae). Jurnal Biologi, 13(1), 12-16.

Pikkart M.J., & Villeponteau, B. (1993). Suppression of PCR amplification by high levels of RNA. Biotechniques, 14, 24-25.

Poedjiadi, A., & Supriyantini, T. (2006). Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia.

Porebski, S., Bailey, L.G., & Baum, B.R. (1997). Modification of CTAB DNA. Plant Molecular Biology Reporter, 15(1), 8-15.

Pradeepkumar, S. (2004). Investigation of allelochemicals in arrowroot (Maranta arundinacea L.). [Thesis]. Thiruvananthapuram: University of Kerala.

Pradeepkumar, S., Nair, G. M., & Padmaja, G. (2008). Purification and characterization of peroxidase from arrowroot (Maranta arundinacea L.) leaves. Journal of Root Crops, 34(2), 164-171.

Prayitno, E., & Nuryandani, E. (2011). Optimization of DNA extraction of physic nut (Jatropha curcas) by selecting the appropriate leaf. Nusantara Bioscience, 3(1), 1-6.

Puchooa, D. (2004). A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from lychee (Litchi chinensis Sonn.). African Journal of Biotechnology, 3(4), 253-255.

Puchooa, D., & Venkatasamy. (2005). A protocol for the isolation of DNA from Trochetia boutoniana. International Journal of Agriculture & Biology, 7(1), 82-85.

Qalbi, N. (2009). Uji lacak balak kayu jati dengan penanda RAPD. [Skripsi]. Bandung: Institut Pertanian Bogor.

Radu, S., & Kqueen, C.Y. (2002). Preliminary screening of endophytic fungi from medicinal plants in Malaysia for antimicrobial and antitumor activity. Malaysian Journal of Meddicinal Sciences, 9(2), 23-33.

Rezaian, M.A., & Krake, L.R. (1987). Nucleic acid extraction and virus detection in grapevine. Journal of Virological Methods. 17, 277-285.

Richana, N., & Sunarti, T.C. (2004). Karakterisasi sifat fitokimia umbi dan tepung pati dari umbi ganyong, suweg, ubi kelapa dan gembili. Jurnal Pascapanen, 29-37.

Roslim, D.I., Hartana, A., & Suharsono. (2003). Hubungan genetika populasi kelapa dalam Banyuwangi, Lubuk Pakam dan Paslaten berdasarkan analisis RAPD (Random Amplified PolymorphicDNA). Jurnal Natur Indonesia, 6 (1), 5-10.

Rukmana, R. (2000). Garut: Budidaya dan Pasca Panen. Yogyakarta: Kanisius.

60

Sahu, S.K., Thangaraj, M., & Kathiresan, K. (2012). DNA extraction protocol for plants with high level of secondary metabolites and polysaccharides without using liquid nitrogen and phenol. International Scholarly Researche Network Molecular Biology.

Sastra, D.R. (2002). Identifikasi keragaman genetik tanaman garut(Maranta arundinacea L.) berdasarkan marka morfologi.[Disertasi]. Bandung: Institut Pertanian Bogor.

Setyowati, F.M., & Rahayu, M. (2005). Keanekaragaman dan pemanfaatan tumbuhan di Pulau Nusakambangan-Cilacap, Jawa Tengah. Jurnal Teknik Lingkungan Hidup, 6 (1), 291-302.

Sharma, A.D., Gill, P.K., & Singh, P. (2002). DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants. Plant Molecular Biology Reporter, 20(4), 415.

Sharma, A.D., Namdeo, A.G., & Mahadik, R.R. (2008). Molecular markers: new prospect in plant genome analysis. Pharmacology Reviews, 2(3), 23-31.

Siahaan, H.M. (n.d). Prosiding Lokakarya Nasional II Penganekaragaman Pangan: Revolusi Kebijakan dan Aksi Menuju Penganekaragaman pangan. Diakses 13 Juni, 2012, dari http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/25710/Rekonstruksi_Kelembagaan_Sosial-7.pdf

Sukamto, L.A., Ahmad, F., & Wawo, A.H. (2010). Pengaruh oryzalin terhadap tingkat ploidi tanaman garut (Maranta arundinacea). Bulletin Littro, 21 (2), 93-102.

Sumadi, & Marianti, A. (2007). Biologi Sel. Yogyakarta: Graha Ilmu. Suryana, A. (2008). Menelisik ketahanan pangan, kebijakan pangan, dan

swasembada beras. Pengembangan Inovasi Pertanian, 1(1), 1-16.Suryanto, D. 2003. Melihat keanekaragaman organisme melalui beberapa

teknik genetika molekuler. Universitas Surabaya. Syafaruddin & Santoso. (2011). Optimasi teknik isolasi dan purifikasi

DNA yang efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). Jurnal Littri, 17(1), 11-17.

Tintin & Hadiatmi. (2009). Garut alternatif pangan yang potensial. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian, 31(5), 18-19.

Tjitrosoepomo, G. (2007). Taksonomi tumbuhan (Spermatophyta). Yogyakarta: UGM Press.

Weeden, N.F., Timmerman, G.M., Hemmat, M., Kneen, B.E., Lodhi, M.A. (1992). Inheritance and Reliability of RAPD Markers. Dalam Prosiding: Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. Crop Science Society of America: Madison, WI.

Wilkie, S.E., Issac, P.G., & Slater, R.J. (1993). Random amplification polymorphic DNA (RAPD) markers for genetic analysis in Allium. Theor. Appl. Genet., 86, 497-504.

Williams, C.A., & Harborne, J.B. (1977). The leaf flavonoids of the Zingiberales. Biochem. Syst. Ecol, 5, 221-229.

61

Windiastika, G. (2012). Teknik isolasi DNA benih tanaman teh perkebunan (Camellia sinensis L.). Diakses 3 November 2012 dari Website Balai Besar Perbenihan & Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya: http://ditjenbun.deptan.go.id/

Yusuf, M., Wahab, M.A., Yousuf, MD., Chowdhury, J.U., & Begum, J. (2007). Some tribal medicinal plants of Chittagong Hill Tracts, Bangladesh. Bangladesh J. Plant Taxon, 14(2), 117-128.

Yuwono, T. (2005). Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga. Yuwono, T. (2008). Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada

University Press. Zidani, S., Ferchichi, A., & Chaieb, M. (2005). Genomic DNA extraction

method from pearl millet (Pennisetum glaucum) leaves. African Journal of Biotechnology, 4(8), 862-866.

62

Lampiran 1. Protokol penggunaan alat spektrofotometer (Smart Spec Plus

BioRad)

Mengukur kuantitas dan kemurnian DNA rantai ganda (double stranded

DNA/dsDNA) pada pengenceran 50 X

1. Spektrofotometer dinyalakan dan dibiarkan selama minimal 15 menit

untuk memanaskan lampu dan melakukan self diagnosis sebelum

digunakan untuk membaca sampel. Sumuran spektrofotometer harus

kosong dari cuvet selama proses ini.

2. Pilih “DNA/RNA”, kemudian ikuti petunjuk yang diberikan oleh alat

untuk mengatur proses pembacaan sampel

3. Jika pada alat sudah tertulis 1 = 50 µg ml-1 tekan enter

4. Pilih “Dilution factor” dan masukkan “50” atau sesuai angka pengenceran

yang diinginkan lalu tekan enter.

5. Masukkan 100 µl larutan blanko (TE 1X atau yang lain) ke dalam cuvet

yang bebas dari kotoran yang dapat mengganggu pembacaan sampel dan

dipastikan tidak ada gelembung

6. Cuvet berisi sampel (2µg DNA + 98 µl TE 1X, atau sesuai setting

pengenceran yang diinginkan) dimasukkan ke dalam sumuran

spektrofotometer, diposisikan sesuai dengan arah semburan cahaya.

7. Sumuran ditutup kemudian tekan tombol read blank pada alat

8. Cuvet dikeluarkan dari sumuran spektrofotometer dan dicuci

menggunakan akuades / buffer TE 1X

63

9. Sampel berikutnya dimasukkan ke dalam cuvet kemudian dibaca

absorbansinya dengan menekan tombol read sample

10. Cuvet dicuci kembali menggunakan akuades / buffer TE 1X

11. Sampel selanjutnya dibaca dengan cara yang sama dengan langkah 8-10

12. Setelah semua sampel dibaca, kelurkan cuvet dari sumuran

spektrofotometer dan tekan “3” pada alat untuk mencetak keseluruhan data

sampel yang telah dibaca atau sampel yang hasilnya belum diprint. Atau

bisa juga dengan memilih”1” atau “2” pada alat (sesuai kebutuhan)

13. Tekan “cancel” pada alat untuk keluar dari progam atau mengakhiri

pembacaan, kemudian “<”, lalu “exit assay”

14. Biarkan alat selama 15 menit, kemudian dimatikan

64

Lampiran 2. Hasil elektroforesis optimasi PCR

Gambar 10. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 4 dan suhu annealing 37º C pada agarosa 0,8%. M: I Kbp Marker(Microzone Ltd.); lane 1: Pengasih, Kulon Progo 1.1; lane 2: Pengasih, Kulon Progo 1.2; lane 3: Pajangan, Bantul 1.1; lane 4: Prambanan, Sleman 1.2; lane 5: Semin, Gunung Kidul 1.2; Sedayu, Bantul 1; lane 6: Sedayu, Bantul 1; lane 7: Sedayu, Bantul 1.2; lane 8: Lendah, Kulon Progo 1; lane 9: Lendah, Kulon Progo 1.1; lane 10: Sentolo, Kulon Progo 1.2; lane 11: Umbulharjo, DIY 1.1, lane 12: Umbulharjo, DIY 1.2

65

Lampiran 2. Lanjutan

Gambar 11. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10). Lane1-3 menggunakan primer 4 dan suhu annealing 30º C pada agarosa 0,8%. M: 1 Kbp Marker(Microzone Ltd.); lane 1: Pengasih, Kulon Progo 1.1; lane 2: Pengasih, Kulon Progo 1.2; lane 3: Pajangan, Bantul 1.1. Lane 4-6 menggunakan primer 5. Lane 4: Prambanan, Sleman: 1.2; lane 5: Semin, Gunung Kidul 1.2; lane 6: Sedayu, Bantul: 1

66

Lampiran 2. Lanjutan

Hasil Elektroforesis Optimasi PCR (Suhu Annealing 29º C) tidak diperlihatkan.

Merupakan pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut

(metode 10) yang berasal dari Pajangan, Bantul 1.1. menggunakan primer 4 dan

suhu annealing 27º C pada agarosa 0,8% dan menghasilkan satu amplikon.

Lampiran 2. Lanjutan

Gambar 12. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10)menggunakan primer 1 dan suhu annealing 28º C pada agarosa 0,8%. M: 1 Kbp Marker (Microzone Ltd.); lane 2: Pajangan, Bantul 1.1; lane 3: Prambanan, Sleman 1.2; lane 4: Semin, Gunung Kidul 1.2; lane 5: Lendah, Kulon Progo 1; lane 6: Umbulharjo, DIY 1.1. Lane 7-11 menggunakan primer 9. Lane 7: Pajangan, Bantul 1.1; lane 8: Prambanan, Sleman 1.2; lane 9: Semin, Gunung Kidul 1.2; lane 10: Lendah, Kulon Progo 1; lane 11: Umbulharjo, DIY 1.1. Lane12 dan 13 berturut-turut menggambarkan pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 4 dan 5. Lane 12: Sedayu, Bantul 1.1; lane 13: Lendah, Kulon Progo 1; lane 14: -

67

Lampiran 2. Lanjutan

Gambar 13. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut Pajangan, Bantul dengan suhu annealing 28º C pada agarosa 1%. M: 1 Kbp Marker (Microzone Ltd.); lane 1: primer 1; lane 2: primer 2; lane 3: primer 3; lane 4: primer 4; lane 5: primer 5; lane 6: primer 6; lane 7: primer 7; lane 8: primer 8; lane 9: primer 9; lane 10: primer 10; lane 11: primer 11; lane 12: primer 12; lane 13: primer 13

68

Lampiran 3. Hasil elektroforesis PCR

Gambar 14. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 1 dan suhu annealing 27º C pada agarosa 1.2 %. Lane 1 dan 7: 1 Kbp Marker (Microzone Ltd.); lane 2: Pajangan, Bantul 1.1; lane 3: Prambanan, Sleman 1.2; lane 4: Semin, Gunung Kidul 1.2; lane 5: Lendah, Kulon Progo 1; lane 6: Umbulharjo, DIY 1.1

69

Lampiran 3. Lanjutan

Gambar 15. Pemisahan produk amplifikasi PCR-RAPD genom tanaman garut (metode 10) menggunakan primer 9 dan suhu annealing 27º C pada agarosa 1.2 %. Lane 1 dan 7: 1 Kbp Marker (Microzone Ltd.); lane 2: Pajangan, Bantul 1.1; lane 3: Prambanan, Sleman 1.2; lane 4: Semin, Gunung Kidul 1.2; lane 5: Lendah, Kulon Progo 1; lane 6: Umbulharjo, DIY 1.1