1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Salah satu jenis tumbuhan di Indonesia yang berkhasiat sebagai antibakteri

adalah tumbuhan pecut kuda atau Stachytarpheta jamaicensis (L.) Vahl. anggota

suku Verbenaceae. Secara empirik, tanaman ini digunakan untuk pengobatan

antara lain, alergi dan penyakit respiratori seperti batuk, flu, asma, dan bronkitis.

Tumbuhan ini juga digunakan untuk gangguan pencernaan seperti indigesti, ulser,

konstipasi, dispepsia, dan digesti lemah (Taylor, 2005). Penyakit-penyakit di atas

umumnya merupakan penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri.

Skrining senyawa aktif antibakteri dalam tumbuhan dilakukan untuk

membuktikan khasiat dari tumbuhan yang diteliti, sehingga menaikkan nilai

tambah dari tumbuhan tersebut sebagai obat penanggulangan infeksi dalam bentuk

fitofarmaka (Balistika dkk., 2004). Dalam pengembangan fitofarmaka,

standarisasi dan persyaratan mutu simplisia obat tradisional merupakan hal yang

perlu diperhatikan (Dewoto, 2007). Standarisasi simplisia dibutuhkan karena

menurut Foster (1989), kandungan aktif tanaman obat dipengaruhi oleh berbagai

faktor, diantaranya adalah perbedaan genetik yang tidak nampak dari gambaran

morfologi tiap tanaman dan populasi yang berpengaruh terhadap produksi

metabolit sekunder.

2

Bidang bioteknologi yang berkembang sangat cepat memungkinkan

budidaya tumbuhan secara in vitro untuk menghasilkan senyawa aktif yang

diinginkan dalam jumlah yang besar. Salah satu teknik biokteknologi adalah

dengan kultur kalus. Menurut Wetherell (1982), metode ini memiliki beberapa

keuntungan, salah satunya yaitu metabolit sekunder tanaman segera diperoleh

tanpa perlu menunggu tanaman dewasa dan dapat ditingkatkan kadarnya dengan

cara memodifikasi mediumnya. Modifikasi yang sering dilakukan pada komposisi

media untuk produksi metabolit sekunder diantaranya adalah mengurangi atau

menghilangkan zat pengatur tumbuh, mengurangi kadar fosfat dan meningkatkan

konsentrasi sukrosa atau penggunaan sumber karbon dan nitrogen (Bhojwani &

Razdan, 1996). Sukrosa dalam sel kalus akan terhidrolisis membentuk glukosa

dan fruktosa. Monosakarida hasil hidrolisis akan digunakan sebagai sumber energi

dan sumber karbon yang digunakan untuk pembentukan metabolit primer dan

sekunder melalui jalur glikolisis dan siklus Krebs. Menurut Etika (2000),

sukrosa akan meningkatkan pertumbuhan kalus pada kadar di atas 20-30 g/L.

Penelitian yang dilakukan oleh Puspitasari (2002) menunjukkan bahwa

biomassa kalus dan kadar terpenoid sari kloroform kalus daun legundi atau Vitex

trifolia anggota suku Verbenaceae mengalami peningkatan pada medium dengan

kadar sukrosa 60 g/L. Sari kalus daun dan akar tumbuhan Premna serratifolia L.

anggota suku Verbenaceae menunjukkan aktivitas penghambatan bakteri patogen

(Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Non-haemolytic

Streptococci, Streptococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella

typhimurium) lebih tinggi dibandingkan sari tanaman induk (Singh, 2011).

3

Sehingga dalam penelitian ini diharapkan dapat diketahui pengaruh penambahan

sukrosa dalam medium Murashige-Skoog (MS) padat terhadap pertumbuhan kalus

daun pecut kuda dan aktivitas antibakteri sari kloroform kalus daun pecut kuda

secara bioautografi terhadap bakteri Escherichia coli.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan masalah sebagai berikut:

1. Bagaimana pengaruh penambahan sukrosa dalam media Murashige-Skoog

(MS) padat terhadap pertumbuhan kultur kalus daun pecut kuda?

2. Apakah sari kloroform kalus daun pecut kuda mempunyai aktivitas

antibakteri E. coli berdasarkan uji bioautografi?

3. Bagaimana profil kromatogram kultur kalus daun pecut kuda dibandingkan

dengan daun tanaman induk?

C. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Mengetahui pengaruh penambahan sukrosa dalam media Murashige-Skoog

(MS) padat terhadap pertumbuhan kultur kalus daun pecut kuda.

2. Mengetahui aktivitas antibakteri sari kloroform kalus daun pecut kuda

terhadap E. coli berdasarkan uji bioautografi.

3. Mengetahui profil kromatogram kultur kalus daun pecut kuda dibandingkan

dengan daun tanaman induk.

4

D. Manfaat Penelitian

Penelitian ini dalam jangka pendek dapat digunakan sebagai informasi

ilmiah tentang pengaruh variasi sukrosa dalam media MS-padat terhadap

pertumbuhan kalus daun pecut kuda, profil kromatogram, dan aktivitas

antimikroba senyawa aktif dalam kalus daun pecut kuda. Lebih lanjut, senyawa

aktif yang bertanggungjawab terhadap aktivitas antibakteri dapat diketahui. Dan

untuk jangka panjang, diharapkan dalam penelitian selanjutnya dihasilkan bibit

unggul tanaman pecut kuda yang dapat digunakan sebagai salah satu tanaman obat

dengan aktivitas antibakteri lebih baik.

E. Tinjauan Pustaka

1. Uraian tentang pecut kuda

a. Nama lokal

Pecut kuda dengan nama daerah disebut jarong, jarongan, jarong

lalaki, daun sangketan, ki meurit beureum (Sunda); biron, karomenal,

nyarang, sekar laru, ngadirenggo, remek getih, rumjarum, laler mengeng

(Jawa); sui in sui, sangko hidung (Sulawesi); Rai rai, dodinga (Maluku).

b. Deskripsi

Pecut kuda berasal dari Florida Selatan daerah Miami-Dade,

Monroe, Collier dan Lee. Pecut kuda dapat ditemukan di Afrika timur

dan barat, Madagaskar, Pulau Rukyu Jepang, Taiwan, subkontinental

India, Australia, Indonesia, Malaysia, dan di beberapa daerah Pantai

Pasifik. Jenis tumbuhan termasuk terna menahun dengan tinggi

5

tumbuhan mencapai 1 m dan tumbuh melebar sampai 2 m. Batang mula-

mula tegak kemudian bercabang-cabang, batang utama berwarna hijau,

bentuk batang bersegi empat, cabang batang yang dekat dengan tanah

berwarna hijau keabu-abuan sampai hijau kecokelatan. Daun tunggal

berhadapan bentuk helaian daun bulat telur sampai lanset, pertulangan

daun menyirip, dan sedikit melengkung di ujung tulang daun. Panjang

daun 1 - 4,5 inchi dan lebar daun 0,75 – 2,5 inchi, pangkal runcing, tepi

bergerigi, ujung runcing sampai meruncing. Bunga majemuk bulir,

panjang ibu tangkai bunga sampai 30 cm. Setiap bunga duduk pada ibu

tangkai bunga dengan tangkai bunga yang sangat pendek. Ibu tangkai

bunga berbentuk panjang dan melengkung seperti bentuk pecut kuda.

Kelopak bunga terdiri atas lima helai berbentuk tabung yang menempel

pada ibu tangkai bunga, berwarna hijau. Mahkota bunga berlekatan

membentuk tabung mahkota, berwarna biru-ungu, dengan bagian tengah

tabung berwarna putih, ujung tabung mahkota bunga terbagi menjadi 5

lobus (cuping). Tinggi tabung 0,5 – 1,0 cm. Benang sari 5 berseling

dengan lobusnya, kepala sari berwarna kuning kecokelatan. Putik

berjumlah 1, terletak di bagian tengah helaian mahkota bunga. Berbunga

sepanjang tahun (Brown, 2012).

6

Gambar 1. Pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis (L.) Vahl)

Gambar 2. Morfologi pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis (L.) Vahl)

(a) ibu tangkai bunga (panjang dan melengkung di bagian ujung seperti pecut kuda);

(b) bunga terletak di ibu tangkai bunga berupa bunga bulir berwarna biru-ungu;

(c) daun (bentuk telur-lanset dengan tepi bergerigi.

c. Sistematika untuk pecut kuda

Kedudukan kategori taksa untuk jenis pecut kuda di dalam

sistematika tumbuhan adalah sebagai berikut :

a b c

7

divisi : Spermatophyta

anak divisi : Angiospermae

kelas : Dicotyledoneae

bangsa : Lamiales

suku : Verbenaceae

marga : Stachytarpheta

jenis : Stachytarpheta jamaicensis (L.) Vahl

(Backer & van den Brink, 1965; Steenis, 1997)

d. Kandungan kimia

Uji pendahuluan fitokimia pada daun pecut kuda menunjukkan

bahwa di dalamnya mengandung metabolit sekunder saponin, tanin dan

flavonoid (Idu dkk., 2007). Menurut Costa (1960), keseluruhan bagian

tanaman pecut kuda mengandung senyawa asam klorogenat. Melita &

Castro (1996), sari daun pecut kuda mengandung senyawa iridoid

ipolamiide, glikosida fenilpropanoid, dan verbascosida. Menurut

Subramanian dkk. (1974) jenis tumbuhan anggota marga Stachytarpheta,

dalam hal ini Stachytarpheta indica mengandung senyawa friedelin

(termasuk golongan senyawa triterpen).

e. Manfaat

Secara etnobotani, tanaman pecut kuda berkhasiat sebagai

penghilang nyeri, obat lambung, obat cacing, obat bengkak-bengkak,

pelancar air seni, penurun tekanan darah, pencahar, pelancar laktasi,

penenang, obat sakit perut, dan obat sesak nafas (Schapoval, 1998).

8

Tanaman ini juga digunakan untuk alergi dan kondisi respiratori seperti

batuk, flu, asma, bronkitis, dan yang lain. Selain itu juga digunakan

untuk gangguan pencernaan seperti indigesti, ulcer, konstipasi, dispepsia,

dan digesti lemah. Untuk pasien yang sedang hamil dan pasien hipotensi

tidak dianjurkan untuk mengkonsumsi tanaman ini karena bersifat abortif

dan hipotensif (Taylor, 2005).

Penelitian yang dilakukan oleh Sashidaran dkk. (2007)

menunjukkan bahwa daun pecut kuda memiliki potensi untuk

dikembangkan menjadi obat antidiare. Hasil penelitian tersebut yaitu

pada dosis 250 dan 500 mg/kg, sari metanolik daun pecut kuda secara

signifikan menunjukkan aktivitas antidiare (p < 0.05). Berdasarkan uji

antibakteri, ektrak metanolik menunjukkan aktivitas hambat meoderat

terhadap Escherichia coli, Staphylococcus epidermis dan Pseudomonas

aeruginosa, dengan nilai MIC 5.00 mg/mL.

2. Uraian tentang Kultur Jaringan Tanaman

a. Kultur jaringan tanaman

Kultur jaringan tanaman dapat disebut juga sebagai perbanyakan

tanaman secara in-vitro (Wetherell, 1982). Kultur jaringan tanaman adalah

teknik untuk menumbuhkan suatu protoplas, sel, jaringan, dan organ pada

media buatan dengan komposisi nutrisi tertentu dalam keadaan tanpa

mikroorganisme (Staba, 1982).

Ide awal mengenai teknik ini berasal dari ilmuwan Jerman,

Haberlandt pada awal abad ke-20. Penelitian awal dimulai dari kultur akar,

9

embrio, dan kalus/jaringan (Thorpe, 2012). Haberlandt memperkirakan

bahwa tumbuhan utuh dan fungsional dapat diregenerasi dari sel tunggal.

Meskipun semua organisme multiseluler memiliki siklus sel yang sama,

sel tumbuhan memiliki kualitas totipotensi yang lebih baik dibanding sel

hewan. Hal ini menunjukkan bahwa sel tunggal dapat menjadi tumbuhan

utuh melalui mekanisme pengaturan selama pembelahan sel. Pengaturan

ini dapat menyebabkan proses diferensiasi berlangsung setelah terjadinya

proses dediferensiasi suatu jaringan. Hal ini memungkinkan suatu organ

daun yang diinokulasikan ke dalam media yang sesuai akan menghasilkan

kalus sehingga kalus tersebut akan berdiferensiasi menghasilkan akar,

batang dan daun (Loyola-Vargas & Ochoa-Alejo, 2012).

Sifat sel dengan totipotensi yang tinggi tidak cukup untuk

kesuksesan kegiatan kultur jaringan. Faktor media tempat tumbuh,

lingkungan yang mempengaruhinya (kelembapan, temperatur, cahaya),

dan sterilitas baik eksplan maupun media merupakan hal mutlak yang

harus terkendali. Faktor yang berpengaruh di dalam pengerjaan kultur

jaringan adalah penguasaan teknik dan prosedur kerja yang baik (Santosa

& Nursandi, 2002). Kultur jaringan mempunyai tiga tujuan, yaitu

perbanyakan tanaman, produksi metabolit sekunder dan perbaikan

kualitas tanaman. Produksi metabolit sekunder dapat dilakukan dengan

kultur kalus dan kultur sel (Gunawan, 1995).

10

b. Sterilisasi

Hal penting dalam kultur jaringan adalah kondisi kultur yang bebas

dari kontaminasi biologis dan terjaga dalam keadaan aseptik selama

manipulasi, pertumbuhan dan penyimpanan (Cassells, 2012). Metode

sterilisasi dibagi menjadi dua, yaitu secara fisik dan kimia. Metode

sterilisasi kimia dilakukan dengan menggunakan bahan-bahan kimia,

sedangkan metode sterilisasi fisik dapat dilakukan dengan cara panas

baik panas kering maupun panas basah, radiasi, dan filtrasi (Pratiwi,

2006).

Menurut Iliev dkk. (2010), sterilan kimia yang dapat digunakan

dalam kultur jaringan tanaman diantaranya adalah etanol 95 dan 70%

(v/v), larutan NaClO atau Ca(ClO)2 0,5–5% atau 3–7% (b/v), larutan

HgCl2 0,1–0,2% (b/v), dan sabun bakteriosidal. Sterilisasi kimia ini

digunakan untuk mensterilisasi eksplan, alat-alat, dan permukaan area

kerja.

Sterilisasi peralatan dan media biasanya dilakukan dengan

menggunakan alat yang disebut otoklaf. Alat ini bekerja atas dasar

temperatur dan tekanan. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi

adalah 121°C dengan tekanan antara 15 -18 psi (pounds per squar inch)

selama 15 menit (Santosa & Nursandi, 2002).

Sterilisasi ruang kultur digunakan metode sterilisasi penyaring

dengan alat yang disebut LAF (Laminar Air Flow). LAF merupakan salah

satu contoh dari filter HEPA (High Efficiency Particulate Air). Filter ini

11

terdiri atas lipatan selulosa asetat yang memungkinkan untuk menyaring

udara bebas debu dan bakteri, dan (Pratiwi, 2006). Untuk sterilisasi ruang

transfer/penabur, ruang inkubasi, ruang kultur umumnya dilakukan

dengan sinar ultra violet. Khusus untuk LAF biasanya sebelum

penggunaan dibersihkan dengan etanol 70% kemudian lampu ultra violet

dinyalakan selama 1-2 jam (Santosa & Nursandi, 2002). Etanol efektif

membunuh bakteri dan fungi namun tidak dapat membunuh endospora

dan virus non-enveloped. Mekanisme aksi etanol adalah dengan

mendenaturasi protein mikroorganisme, melarutkan lipid dari membran

mikroorganisme termasuk lipid pada virus bersampul (enveloped virus).

Sinar UV bereaksi dengan asam nukleat sel mikroorganisme sehingga

menyebabkan ikatan antara molekul-molekul timin yang bersebelahan

membentuk dimer timin. Senyawa dimer timin dapat menghalangi

replikasi DNA normal dengan menutup jalan enzim replikasi (Pratiwi,

2006).

c. Eksplan

Sebagian organ atau jaringan yang digunakan dalam kultur

jaringan disebut eksplan (George, 2008). Eksplan akan menunjukkan

pertumbuhan dan perkembangan tertentu. Arah pertumbuhan dan

perkembangan atau regenerasi ditentukan oleh beberapa hal berikut, yaitu

komposisi media, zat pengatur tumbuh yang digunakan dan lingkungan

tumbuh (Gunawan, 1995).

12

Macam eksplan, ukuran, umur, dan cara pembudidayaan akan

mempengaruhi berhasil tidaknya kultur jaringan tanaman. Menurut

Wetherell (1982), aturan sederhana yang dapat digunakan sebagai dasar

dalam pemilihan eksplan adalah memakai sumber eksplan yang sehat dan

tumbuh kuat, memilih jaringan yang muda dan memakai eksplan yang

cukup besar. Kadang-kadang perlu dilakukan percobaan terlebih dahulu

bila akan mengkulturkan suatu jenis atau varitas tanaman yang belum

diketahui (Dixon, 1985).

d. Kultur kalus

Kultur kalus adalah teknik budidaya tanaman dalam suatu

lingkungan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan

ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali (Gunawan, 1995). Kalus

adalah suatu kumpulan sel amorphous yang berasal dari sel-sel jaringan

yang membelah diri secara terus-menerus. Penelitian pembentukan kalus

pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun

1960.

Sel-sel kalus diharapkan mampu memperbanyak dirinya secara

terus menerus dan dapat menghasilkan produk metabolit sekunder

tertentu (Santosa dan Nursandi, 2002). Pada awal pertumbuhan kalus

yaitu fase lag terjadi proses penyesuaian keadaan dan induksi

pembelahan sel. Kemudian pada fase logaritmik sel mulai membelah dan

kecepatan pertumbuhan sel menjadi konstan pada fase stasioner (George,

1993).

13

Kalus tidak hanya terdiri dari satu jenis. Kalus dapat dibedakan

berdasarkan penampakan, warna, derajat kekompakan, dan potensi

morfogeneik yang umumya tumbuh dari eksplan tunggal. Jenis kalus

yang diperoleh, dilihat dari kemampuan diferensiasi sel dan kapasitas

untuk regenerasi menjadi tumbuhan baru, tergantung dari asal dan umur

jaringan ekplan. Kalus yang kurang kompak atau kalus friabel umumnya

dipilih untuk inisiasi kultur suspensi (George, 2008).

Kultur kalus tanaman anggota suku Verbenaceae pernah dilakukan

Puspitasari (2002) pada daun legundi atau Vitex trifolia. Penambahan 1,0

mg/l 2,4-D dan 1,0 mg/l kinetin dalam media merupakan konsentrasi

yang optimum untuk meningkatkan laju pertumbuhan kalus daun

legundi secara in vitro.

e. Medium kultur

Keberhasilan dalam teknologi kultur jaringan tanaman terutama

disebabkan pengetahuan yang baik tentang lingkungan tumbuh eksplan

yang sesuai. Lingkungan yang cocok sebagian akan terpenuhi apabila

media kultur yang dipilih berdasarkan kebutuhan hara sel dan jaringan

(Santosa & Nursandi, 2002). Media kultur yang memenuhi syarat adalah

media yang mengandung nutrien makro dan mikro dalam kadar dan

perbandingan tertentu, serta sumber tenaga (umumnya digunakan

sukrosa). Seringkali juga mengandung satu atau dua macam vitamin dan

zat perangsang pertumbuhan (Wetherell, 1982). Media Murashige-Skoog

(MS) dan Schenk-Hildebrandt (SH) paling banyak digunakan untuk

14

kultur jaringan tanaman dan efektif untuk pertumbuhan kultur tanaman

dikotil dan monokotil. Keduanya diketahui sebagai media „high salt’

(dibandingkan dengan konsentrasi persenyawaan garam dengan „low

salt’ seperti pada media White) (Dixon, 1985). Media yang mengandung

bahan pemadat seringkali disebut media padat atau media semipadat

tergantung jumlah yang ditambahkan. Media ini secara luas digunakan

untuk penanaman eksplan, kultur kalus atau organ tanaman (termasuk

mikropropagasi) dan untuk penanaman kultur dalam jangka waktu lama

(George, 2008). Penggunaan media MS pada kultur kalus tanaman

anggota Verbenaceae dilaporkan oleh Puspitasari (2002) dan Singh

(2011).

Media kultur jaringan tanaman mengandung empat kelompok

senyawa, yaitu:

(1) Unsur anorganik

Terdapat dua macam unsur anorganik yaitu unsur makro dan

unsur mikro. Unsur - unsur yang dibutuhkan dalam jumlah besar

(unsur makro) di antaranya adalah nitrogen (N), kalium (K), kalsium

(Ca), fosfor (P), magnesium (Mg), dan sulfur (S). Sedangkan unsur

yang dibutuhkan dalam jumlah kecil (unsur mikro) meliputi besi

(Fe), nikel (Ni), klorin (Cl), mangan (Mn), seng (Zn), boron (B),

tembaga (Cu), dan molibnum (Mo). Unsur-unsur di atas bersama

dengan karbon (C), oksigen (O) dan hidrogren (H) merupakan unsur

penting. Selain itu, terdapat unsur seperti kobal (Co), aluminium

15

(Al), natrium (Na), dan iodin (I) yang merupakan unsur penting bagi

beberapa jenis tumbuhan, namun ketersediaannya dalam tumbuhan

sudah cukup (George & Klerk, 2008). Komponen media tersebut

akan mempengaruhi pertumbuhan dan metabolisme sel dalam media

kultur (Ramawat, 1999).

(2) Unsur organik

Pertumbuhan dan morfogenesis kultur jaringan tanaman

dapat ditingkatkan dengan penambahan dalam jumlah kecil unsur

organik, diantaranya yaitu vitamin, asam amino dan beberapa

suplemen organik lainnya. Vitamin yang sering ditambahkan dalam

media adalah tiamin (Vit. B1), asam nikotinat (niasin) dan piridoksin

(Vit. B6) serta myo-inositol (George & Klerk, 2008).

(3) Sumber karbon

Karbohidrat memiliki peran penting dalam kultur in vitro

sebagai sumber karbon dan energi serta untuk pengatur tekanan

osmotik media. Sukrosa merupakan sumber karbon yang sering

digunakan untuk mikropropagasi melalui kultur jaringan (Thorpe

dkk., 2008). Penelitian yang dilakukan oleh Nurchayati dan Afiah

(2010) menunjukkan hasil bahwa media tanpa penambahan sukrosa

(0 g/l atau kontrol) hingga akhir penelitian tidak terjadi inisiasi

kalus, sehingga disimpulkan bahwa sukrosa sangat mutlak

diperlukan untuk memacu inisiasi kalus. Menurut Thorpe dkk.

16

(2008), jumlah sukrosa yang sering ditambahkan dalam media

adalah 2-4%.

Sukrosa adalah sumber karbon yang paling mudah

ditranslokasi dalam jaringan tanaman dibandingkan karbohidrat

lain. Sukrosa masuk dalam glikolisis dan siklus Krebs untuk

membentuk ATP dan NADH. Sukrosa merupakan disakarida dan

terhidrolisis menjadi glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan

sebagai sumber karbon dan energi lebih besar untuk pertumbuhan.

Glukosa merupakan monosakarida yang menghasilkan energi lebih

rendah dibanding sukrosa. Hal ini menyebabkan sukrosa mampu

menyuplai energi dan karbon yang lebih besar dibanding glukosa

(Rohimatun & Darwati, 2011). Hidrolisis sukrosa menjadi glukosa

dan fruktosa dalam sel mempengaruhi tekanan osmotik sel.

Hidrolisis sukrosa ini menyebabkan penyerapan air ke dalam sel

lebih banyak sehingga tekanan turgor meningkat, yang selanjutnya

menyebabkan pembesaran dan pemanjangan sel (Suskendriyati,

2004). Sukrosa akan meningkatkan pertumbuhan kalus pada kadar di

atas 20-30 g/L (Etika, 2000).

(4) Zat pengatur tumbuh

Jaringan tanaman secara alami mengandung senyawa endogen

yang memilliki pengaturan atau regulasi berbeda dengan nutrien

untuk pertumbuhan dan perkembangan. Senyawa ini aktif dengan

konsentrasi yang sangat kecil. Senyawa ini dikenal sebagai hormon

17

tanaman. Senyawa sintetis dengan aktivitas fisiologi sama dengan

hormon tanaman, memiliki kemampuan untuk memodifikasi

pertumbuhan tanaman dengan mekanisme yang hampir sama. Saat

senyawa tersebut dimasukkan dalam media kultur jaringan tanaman,

maka dapat dinamakan sebagai zat pengatur tumbuh yang

mengindikasikan bahwa zat tersebut diperoleh dari luar jaringan

tanaman (senyawa eksogen). Terdapat berbagai macam ZPT,

diantaranya yaitu auksin, sitokinin, giberilin, etilen, dan asam

absisat (Machakova dkk., 2008).

f. Produksi metabolit sekunder melalui kultur jaringan tanaman

Kultur jaringan sejak lama telah digunakan sebagai salah satu

metode untuk produksi senyawa bioaktif dari tumbuhan. Kelebihan

penggunaan kultur jaringan dalam produksi senyawa bioaktif dibanding

dengan tumbuhan utuh antara lain adalah tidak adanya keterbatasan

iklim, tidak memerlukan lahan yang luas, dan senyawa bioaktif dapat

dihasilkan secara kontinyu dalam keadaan yang terkontrol. Sintesis

senyawa bioaktif oleh kultur kalus antara lain dilaporkan oleh Puspitasari

(2002) dan Husin (2003). Selanjutnya, kultur dapat dibuat dalam skala

besar dalam bioreaktor melalui proses bioteknologi yang tepat untuk

memproduksi metabolit, meningkatkan produksi metabolit sekunder

dengan penambahan senyawa kimia tertentu, memasukkan gen asing

dalam gen tanaman untuk menghasilkan protein rekombinan, atau protein

terekspresi yang memiliki jalur metabolit terbatas (Tang dkk., 2010).

18

Modifikasi yang sering dilakukan pada komposisi media untuk

produksi metabolit sekunder diantaranya adalah mengurangi atau

menghilangkan zat pengatur tumbuh, mengurangi kadar fosfat dan

meningkatkan konsentrasi sukrosa atau penggunaan sumber karbon dan

nitrogen (Bhojwani & Razdan, 1996).

3. Metode Penyarian

Ekstraksi atau penyarian merupakan peristiwa perpindahan massa zat

yang semula berada di dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga zat-zat

aktif larut dalam cairan penyari. Metode dasar penyarian adalah maserasi,

perkolasi dan penyarian dengan alat soxhlet. Metode ekstraksi dipilih

berdasarkan beberapa faktor seperti sifat bahan terutama sifat zat aktif yang

akan disari (Ansel, 1989).

Maserasi merupakan salah satu teknik penyarian yang paling

sederhana dalam menyari bahan obat yang berbentuk serbuk simplisia halus

(Voight, 1994). Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia

halus dengan pelarut yang dapat melarutkan zat aktif yang akan disari.

Adanya perbedaan konsentrasi di luar dan di dalam sel, cairan penyari akan

menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel sehingga zat aktif akan

larut didesak ke luar. Peristiwa ini berulang sehingga terjadi keseimbangan

konsentrasi antara larutan di luar dan di dalam sel. Cairan penyari yang

digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain (Ansel, 1989).

Keuntungan metode ini ialah cara pengerjaan, peralatan yang

digunakan sederhana, mudah diusahakan, dan aman untuk senyawa volatile

19

yang mudah hilang dalam pemanasan (golongan senyawa terpenoid).

Kerugian cara maserasi ialah pengerjaan yang lama dan penyariannya kurang

sempurna (Anonim, 1986).

4. Uraian tentang Metabolit Sekunder

Jalur metabolisme primer berbeda dengan metabolisme sekunder.

Metabolisme primer menghasilkan produk yang dinamakan metabolit primer.

Metabolit primer digunakan oleh seluruh organisme hidup untuk bertahan

hidup, seperti polisakarida, lemak dan asam nukleat. Berlawanan dengan jalur

metabolisme primer, terdapat jalur metabolisme sekunder yang melibatkan

senyawa-senyawa organik spesifik dan terjadi sangat terbatas di alam.

Metabolisme ini menghasilkan produk yang disebut sebagai metabolit

sekunder, seperti glikosida, flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan zat warna

(Dewick, 1999).

Senyawa pembangun metabolit sekunder merupakan turunan hasil

metabolisme primer (Gambar 3). Skema tersebut menunjukkan pembentukan

metabolit dari sumber karbon melalui proses fundamental fotosintesis,

glikolisis, dan siklus Krebs. Sebagian besar senyawa pembangun yang

menjadi penyedia biosintesis metabolit sekunder merupakan turunan dari

acetyl coenzyme A (acetyl-CoA), asam sikimat, asam mevalonat, dan 1-

deoxyxylulose 5-phosphate (Dewick, 1999).

20

Gambar 3. Hubungan metabolit primer dan metabolit sekunder (Dewick, 1999)

5. Uraian tentang Mikrobiologi

a. Bakteri uji aktivitas antibakteri

Bakteri adalah suatu organisme hidup yang memiliki struktur sel

sangat sederhana dan hanya bersel tunggal (uniseluler). Penggolongan

bakteri sangat beragam, salah satunya penggolongan bakteri berdasarkan

sifatnya, ada dua macam yaitu bakteri patogen dan bakteri nonpatogen.

Bakteri patogen adalah bakteri berbahaya yang seringkali menimbulkan

penyakit sedangkan bakteri nonpatogen adalah bakteri yang

21

menguntungkan dan dapat dimanfaatkan oleh manusia. Bakteri yang

dapat digunakan untuk uji aktivitas antibakteri meliputi bakteri Gram

positif dan Gram negatif. Mikroba-mikroba tersebut dapat digolongkan

dalam mikroba patogen dan atau perusak karena kedua golongan mikroba

tersebut yang akan dicegah pertumbuhannya dengan antibakteri

(Parhusip, 2006).

Senyawa antibakteri banyak terdapat dalam tanaman. Beberapa

tanaman monokotil yang memiliki aktivitas antibakteri di antara adalah

bawang putih segar dengan senyawa aktif alliine dan asam amino yang

mengandung sulfur, jahe dan lidah buaya. Pada tanaman dikotil terdapat

beberapa golongan senyawa di antaranya yaitu seskuiterpen keton dalam

tanaman hops (senyawa humulene dan lupulene) dan dalam tanaman

myrrh (fulanodiene-6-one dan methoxyfuranoguaia-9-ene-8-one);

senyawa lakton protoanemonine dalam tanaman Anemone pulsatilla dan

anggota Ranunculaceae lain; senyawa sulfur dalam tanaman anggota

Cruciferae (Evans, 2002); senyawa triterpen Friedelin dalam tanaman

Begonia malabarica (Ramesh dkk., 2002).

b. Antibakteri

Antibakteri adalah zat yang membunuh bakteri atau menekan

pertumbuhannya. Oleh karena itu, kelompok senyawa yang beraktivitas

sebagai antibakteri digunakan untuk upaya kuratif pada penyakit infeksi

yang disebabkan oleh antibakteri. Pada beberapa bagian tanaman

mengandung senyawa yang dapat bersifat sebagai antibakteri. Senyawa

22

tersebut diproduksi secara biologis oleh tanaman, dan dapat menghambat

pertumbuhan dan aktivitas mikroba (Nycas, 1995).

c. Media pertumbuhan bakteri

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara

(nutrien) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan

menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi,

perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah

mikroba (Sutedjo dkk., 1996). Pengetahuan tentang habitat normal

mikoorganisme sangat membantu dalam pemilihan media yang cocok

untuk pertumbuhan mikroorganisme di laboratorium (Pratiwi, 2006).

d. Uji bioautografi

Bioautografi merupakan suatu metode yang spesifik untuk

mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis

(KLT) atau kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas antibakteri,

antifungi dan antiviral. Bioautografi juga merupakan suatu metode yang

cepat untuk mendeteksi antibiotik yang belum diketahui sebab ada

keterbatasan metode kimia atau fisika untuk substansi yang murni.

Sementara deteksi kimia reaksi warna hanya spesifik digunakan sebagai

pembanding hasil bioautografi sehingga kedua metode tersebut saling

melengkapi (Stahl, 1965).

Salah satu keuntungan metode bioautografi dibandingkan dengan

metode lain seperti difusi agar dan pengenceran adalah dapat digunakan

untuk mengetahui aktivitas biologi secara langsung dari senyawa

23

komplek, terutama terkait dengan kemampuan suatu senyawa untuk

menghambat pertumbuhan mikroba (Kavanagh, 1972), selain untuk

pemisahan dan identifikasi. Kelebihan lainnya, metode bioauografi

tersebut cepat, mudah untuk dilakukan, murah, hanya membutuhkan

peralatan sederhana, dan interpretasi hasilnya relatif mudah serta akurat

(Kusumaningtyas dkk., 2008).

Metode bioautografi dibedakan menjadi tiga macam yaitu

bioautografi kontak, bioautografi imersi atau bioautografi agar overlay

dan bioautografi langsung. bioautografi kontak dilakukan dengan

meletakkan lempeng kromatogram hasil elusi senyawa yang diuji di atas

media padat yang sudah diinokulasi dengan mikroba uji. Adanya

senyawa antimikroba ditandai dengan adanya daerah jernih yang tidak

ditumbuhi mikroba. pada bioautografi agar overlay, lempeng

kromatogram dilapisi dengan agar yang masih cair yang sudah

diinokulasikan dengan mikroba uji. Setelah agar mengeras, lempeng

kromatogram diinkubasi dan diwarnai dengan tetrazolium dye.

Penghambatan dapat dideteksi dengan terbentuknya pita (band).

bioautografi langsung dilakukan dengan menyemprot lempeng

kromatogram dengan mikroba uji dan diinkubasi. zona hambat yang

terbentuk divisualisasikan dengan menyemprot lempeng kromatogram

dengan tetrazolium dye (Kusumaningtyas dkk., 2008).

24

6. Uraian tentang Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode

pemisahan yang cukup sederhana yaitu dengan menggunakan pelat kaca yang

dilapisi silika gel dengan menggunakan pelarut tertentu. Kelebihan KLT ialah

proses yang cepat, pemakaian jumlah pelarut dan jumlah cuplikan yang

sedikit (Gritter,1991).

Pada hakikatnya KLT melibatkan dua fase yaitu fase diam atau sifat

lapisan, dan fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fase diam dapat

berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap atau

penyangga untuk lapisan zat cair. Fase gerak dapat berupa hampir segala

macam pelarut atau campuran pelarut.

Identifikasi senyawa-senyawa yang terpisah pada kromatogram

umumnya menggunakan harga Rf (retardation factor/retention factor). Selain

harga Rf, identifikasi senyawa dapat menggunakan harga hRf (hundred

retardation factor), yaitu Rf dikalikan 100, sebagai pembulatan dua angka di

belakang koma yang terdapat pada harga Rf (Stahl, 1969). Harga hRf

didefinisikan sebagai berikut:

Harga hRf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis kurang tetap

jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas. Karena

itu pada lempeng yang sama di samping kromatogram dari zat yang diperiksa

perlu dibuat kromatogram dari zat pembanding kimia, lebih dengan kadar

yang berbeda-beda. Perkiraaan identifikasi diperoleh dengan pengamatan dua

25

bercak dengan harga hRf yang kurang lebih sama dan warna serta ukuran

yang sama. Ukuran dan intensitas bercak dapat digunakan untuk menentukan

kadar (Sudjadi, 1986).

Deteksi senyawa dapat dilihat dibawah sinar UV 254 nm dengan

adanya peredaman dan sinar UV 366 nm menunjukkan fluoresensi. Ada

beberapa golongan senyawa yang tidak dapat dideteksi dengan penyinaran

UV sehingga perlu dilakukan deteksi kimia menggunakan pereaksi penampak

bercak (dengan atau tanpa pemanasan). Salah satu pereaksi semprot yang

dapat digunakan adalah anisaldehid-asam sulfat. Pereaksi ini dapat digunakan

untuk identifikasi fenol, terpen, steroid, propilpropan, saponin, dan senyawa

pahit. Anisaldehid-asam sulfat yang digunakan untuk pereaksi semprot dibuat

dengan cara menambahkan 8 mL asam sulfat pekat dan 0,5 mL anisaldehid

dalam kondisi dingin ke dalam campuran 85 mL metanol dan 10 mL asam

asetat glasial. Deteksi dilanjutkan dengan pemanasan pada 100°C-105°C

sampai intensitas warna bercak maksimal (Stahl, 1985), atau pada 90°C-

125°C selama 1-15 menit (Jork dkk., 1990). Warna yang muncul akan

bermacam-macam mulai dari ungu, biru, merah, coklat maupun hijau

tergantung senyawa dalam bercak (Stahl, 1985).

26

F. Landasan Teori

Teknik kultur jaringan tanaman didasarkan pada sifat totipotensi yang

dimiliki sel tumbuhan. Totipotensi sel merupakan kemampuan setiap sel

tunggal untuk membelah, memproduksi sel terdiferensiasi, dan meregenerasi diri

menjadi tanaman sempurna apabila berada dalam lingkungan yang sesuai. Kultur

jaringan mempunyai tiga tujuan, yaitu perbanyakan tanaman, produksi metabolit

sekunder dan perbaikan kualitas tanaman. Produksi metabolit sekunder dapat

dilakukan dengan kultur kalus (Gunawan, 1995).

Modifikasi yang sering dilakukan pada komposisi media untuk produksi

metabolit sekunder diantaranya adalah mengurangi atau menghilangkan zat

pengatur tumbuh, mengurangi kadar fosfat dan meningkatkan konsentrasi sukrosa

atau penggunaan sumber karbon dan nitrogen (Bhojwani & Razdan, 1996).

Sukrosa sebagai sumber energi akan mempengaruhi pertumbuhan sel dan sebagai

substrat yang berperan dalam metabolisme akan mempengaruhi pembentukan

metabolit primer dan sekunder. Sukrosa akan meningkatkan pertumbuhan kalus

pada kadar di atas 20-30 g/L (Etika, 2000). Metabolit sekunder dapat diambil

melalui penyarian dengan pelarut tertentu. Senyawa dalam penyari dapat

diketahui aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi. Bioautografi

merupakan suatu metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada

kromatogram hasil kromatografi lapis tipis (KLT) atau kromatografi kertas yang

mempunyai aktivitas antibakteri, antifungi dan antiviral (Stahl, 1985).

27

G. Hipotesis

1. Peningkatan konsentrasi sukrosa di atas 30 g/L dalam media MS akan

meningkatkan pertumbuhan kalus daun pecut kuda.

2. Peningkatan konsentrasi sukrosa di atas 30 g/L dalam media MS akan

meningkatkan aktivitas antibakteri kalus pecut kuda.

3. Profil kromatogram kalus daun pecut kuda mirip dengan profil kromatogram

daun pecut kuda.