BAB 4 METODE PENELITIAN - eprints.umm.ac.ideprints.umm.ac.id/41295/5/BAB 4.pdf · 1) Sonde 2) Spuit...
Transcript of BAB 4 METODE PENELITIAN - eprints.umm.ac.ideprints.umm.ac.id/41295/5/BAB 4.pdf · 1) Sonde 2) Spuit...
21
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian true experimental dengan
menggunakan metode post test only control group design.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas kedokteran
Universitas Muhammadiyah Malang dengan estimasi waktu 36 hari pada bulan
Maret 2017
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian
4.3.1 Kriteria Subjek
Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih Rattus novergicus
strain wistar jantan yang di peroleh dari Laboratorium Biomedik FK
UMM.
4.3.2 Sampel
Sampel penelitian adalah tikus Rattus novergicus strain wistar
jantan yang di ambil secara random dari populasi tikus.
4.3.3 Besar sampel
Besar sampel penelitian dapat diambil dari populasi tikus wistar
putih Rattus novergicus strain wistar jantan dengan menggunakan rumus
Frederer dan Resource Equation Methode :
22
(r – 1)(p – 1) ≥ 15
(r – 1)(4 – 1) ≥ 15
4r – 4 ≥ 15
r ≥ 4,5 (Supranto, 2007)
Untuk menetukan jumlah total hewan coba yang akan digunakan oleh penelitian
ini dihitung menggunakan rumus Resource Equation Methode.
E = total number of animal – total number of group
= (5x4) – 4 = 16
Untuk mengantisipasi terjadinya drop out maka dilakukan koreksi dengan :
Cadangan = 𝑛
1−𝑓
= 4
1−0,2
= 5
Setalah dihitung menggunakan rumus diatas didapatkan 16 ekor tikus
dibutuhkan untuk penelitian, dan ditambah dengan cadangan sebanyak 4 ekor
tikus. Total sampel tikus yang dipakai dalam penelitian ini sebanyak 16 ekor
dengan debagi 4 kelompok masing-masing kelompok terdiri dari 4 ekor tikus dan
1 cadangan.
4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel
23
Teknik pengambilan sampel pada penelitian ini dilakukan dengan
cara simple random sampling.
4.3.5 Kriteria Sampel Penelitian
a. Kriteria Inklusi
1. Tikus putih Rattus novergicus strain wistar jantan
2. Umur 2-3 bulan
3. Berat badan 150-200 gram
4. Gerakan tikus yang aktif
b. Kriteria Eksklusi
1. Tikus yang cacat sebelum perlakuan
2. Tikus sakit sebelum perlakuan
3. Tikus mati sebelum perlakuan
c. Kriteria Drop out
1. Tikus yang sakit dalam perlakuan ditandai dengan gerakan yang
kurang aktif, diare atau feses lunak tidak mau makan dan
minum,postur tubuh cendrung tiduran pada lantai kandang,
suara akan lebih banyak mencicit ketika dipegang (Koolhas,
2010).
2. Tikus mati selama perlakuan
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kulit jeruk lemon
(Citrus limon)
4.4.2 Variabel Tergantung
24
Variabel tergantung pada peneilitian ini adalah kadar LDL
dalam darah tikus putih Rattus novergicus strain wistar jantan.
4.5 Definisi Operasional Variabel
4.5.1 Ekstrak Kulit Jeruk Lemon
Kulit jeruk lemon didapatkan dari UPT. Materia Medika kota
Batu. Kulit jeruk lemon kering yang dimaserasi menggunakan sistem
pelarut etanol 96% dan aseton dengan dosis 125 mg/kgBB, 250
mg/kgBB dan 300 mg/kgBB, diberikan kepada tikus menggunakan
sonde selama 15 hari.
4.5.2 Kadar LDL
Kadar LDL dalam plasma tikus yang diukur setelah perlakuan
dengan metode direct precipitat yang akan dilakukan di
Laboratorium Biomedik FK UMM.
4.6 Bahan dan Instrumen peelitian
a. Alat dan bahan pemeliharaan tikus :
1) Kandang tikus
2) Penutup kandang
3) Air mineral dan botol minum untuk tikus
4) Diet pakan BR-1
b. Alat dan bahan pembuatan elstrak kulit jeruk lemon (Citrus limon)
c. Alat dan bahan pembedahan tikus:
1) Alat bedah minor
2) Papan bedah
3) Handscoon
25
4) Kapas dan tisu
5) Kloroform
6) Spuit 3 cc
7) Botol sediaan
d. Alat dan bahan analisis serum:
1) Pipet mikro 100 dan 1000 ul
2) Rak kuvet
3) Tabug kuvet
4) Reagen Presipitat
5) Reagen kolesterol total
6) Sentrifuge
e. Alat lain :
1) Sonde
2) Spuit 3 cc
3) Kertas label
4) Kamera
26
4.7 Alur Penelitian
20 ekor tikus putih wistar jantan dibagi menjadi 4 keompok
Adaptasi selama 7 hari dan pemberian pakan BR-1
14 hari dilakukan perlakuan pemberian induksi 1ml/100 gram minyak
goreng deep frying pada semua kelompok
Kelompok 1
Kontrol positif
Tidak diberikan
ekstrak kulit
jeruk lemon
(Citrus limon)
Setiap 1 ekor tikus dianatesi dengan klorofom dengan cara inhalasi
Dilakukan pembedahan dan pengambilan sampel darah pada
ventrikel kirir hewan coba dengan menggunakan spuit 3 cc
Analisis data
Laporan
Kelompok 2
Diberikan
ekstrak kulit
jeruk lemon
dengan dosis
sebesar
450mg/ekor/hari
selama 14 hari
Kelompok 3
Diberikan
ekstrak kulit
jeruk lemon
dengan dosis
sebesar
600mg/ekor/hari
selama 14 hari
Kelompok 4
Diberikan
ekstrak kulit
jeruk lemon
dengan dosis
sebesar
750mg/ekor/hari
selama 14 hari
Pengukuran LDL dalan darah pada sampel darah hewan coba
27
4.8 Prosedur penelitian
4.8.1 Proses adaptasi
Adaptasi yang dilakukan kepada hewan coba selama 7 hari dengan
suhu ruangan 20-22 ̊C agar tikus dapat beradaptasi dengan lingkungan
yang baru.
4.8.2 Pembagian kelompok sampel
Sampel hewan coba yang digunakan pada penelitian ini sebanyak
20 ekor yang akan dibagi menjadi 4 kelompok seperti berikut :
a. Kelompok 1 : terdapat 4 ekor tikus putih wistar jantan dengan
perlakuan pemberian induksi minyak goreng deep frying sebanyak 1
ml/gram BB tikus selama 14 hari
b. Kelompok 2 : terdapat 4 ekor tikus putih wistar jantan dengan
perlakuan pemberian induksi minyak goreng deep frying sebanyak 1
ml/gram BB tikus selama 14 hari, setelah itu dilanjutkan dengan
pemberian ekstrak kulit jeruk lemon (Citrus limon) dengan dosis 450
mg/ekor/hari selama 14 hari.
c. Kelompok 3 : terdapat 4 ekor tikus putih wistar jantan dengan
perlakuan pemberian induksi minyak goreng deep frying sebanyak 1
ml/gram BB tikus selama 14 hari, setelah itu dilanjutkan dengan
pemberian ekstrak kulit jeruk lemon (Citrus limon) dengan dosis 600
mg/ekor/hari selama 14 hari.
d. Kelompok 4 : terdapat 4 ekor tikus putih wistar jantan dengan
perlakuan pemberian induksi minyak goreng deep frying sebanyak 1
ml/gram BB tikus selama 14 hari, setelah itu dilanjutkan dengan
28
pemberian ekstrak kulit jeruk lemon (Citrus limon) dengan dosis 750
mg/ekor/hari selama 14 hari.
4.8.3 Pembuatan ekstrak kulit jeruk lemon (Citrus limon)
a. Bahan baku ekstrak : kulit jeruk lemon dikumpulkan dan dicuci bersih,
dipotong kecil-kecil dan dikeringkan, kulit jeruk lemon yang sudah
keringkan kemudian di tumbuh menjadi bubuk, hasil bubuk dari kulit
jeruk lemon akan di ekstrak.
b. Proses ekstrak : bubuk kulit jeruk lemon direndam dengan etanol 96%
dan aseton dengan perbandingan 4:1 dan dijauhkan dari jangkauan
matahari selama 3 hari proses ini disebut proses maserasi, setelah
proses maserasi selesai kemudian difilter dengan corong Buchner, jika
masih terdapat ampas dari proses tersebut maka lakukan maserasi
kembali. Hasil dari filtrasi dipekatkan menggunakan evaporator untuk
mendapatkan ekstrak kering.
4.8.4 Penentuan dosis ekstrak kulit jeruk lemon
Dosis ekstrak kulit jeruk lemon (Citrus limon) yang dibutuhkan
dalam penelitian ini adalah 2250 mg/kgBB, 3000 mg/kbBB dan 3750
mg/kgBB (Solihah, 2016). Dosis yang di perlukan oleh tikus dengan berat
200 gr pada penelitian ini sebesar:
a. Dosis 1 = 2250 mg/kgBB x 0,2 = 450 mg/ekor/hari
b. Dosis 2 = 3000 mg/kgBB x 0,2 = 600 mg/ekor/hari
c. Dosis 3 = 3750 mg/kgbb x 0,2 = 750 mg/ekor/hari
Untuk dosis selama 15 hari perlakuan di perlukan dosis sebanyak:
29
a. Dosis 1 = 450 mg x 15 x 5 = 33750 mg (untuk 5 tikus dalam
15 hari)
b. Dosis 2 = 600 mg x 15 x 5 = 45000 mg (untuk 5 tikus dalam
15 hari)
c. Dosis 3 = 750 mg x 15 x 5 = 56250 mg (untuk 5 tikus dalam
15 hari)
Dosis yang dibutuhkan oleh kelompok perlakuan 1,2 dan 3
dalam 15 hari masa perlakuan pada penelitian ini sebanyak 135000 mg
= 135 g.
4.8.5 Pembuatan minyak goreng deep frying
Minyak goreng deep frying didapatkan dari 1 liter minyak goreng
yang digunakan untuk menggoreng kentang pada suhu 177 ̊C selama 5
kali penggorengan selama 15 menit (Mujahidin, 2014).
Pemberian minyak goreng deep frying yang dapat meningkatkan
kadar LDL dalam darah sebesar 1 ml/100 g berat tikus diberikan secara
oral dengan sonde selama 14 hari (Raharjo et al, 2015).
4.8.6 Proses pembedahan hewan coba
a. Proses anastesi
Proses anastesi dilakukan dengan cara menuangkan klorofoam 0,67
ml pada kapas dan dimasukkan kedalan toples, masukkan satu persatu
hewan coba kedalam toples dan tunggu selama 60 detik agar tikus
benar-benar terbius (Alexandru, 2011).
30
b. Proses pembedahan
Proses pembedahan dilakukan dengan alat bedah minor, setelah
tikus terbius dengan baik (pingsan) maka tikus diletakkan di papan lilin
dan difiksasi pada keempat kakinya, dibedah pada bagian abdomen
hingga bagian leher, dilakukan pegambilan darah pada ventrikel kiri
jantung tikus sebanyak 3 ml menggunakan spuit 3 cc (Alexandru,
2011).
c. Proses penguburan
Setelah melakukan proses pembedahan bangkai hewan coba harus
dikubur dengan cara dimasukkan kedalam poli bag atau kantong
plastik, masing-masig kantong poli bag atau kantong plastik berisikan
max 10 bangkai hewan coba, kemudian dikubur dalam tanah dengan
kedalaman tanah 1 meter.
4.8.7 Pengukuran kadar LDL
a. Pembuatan precipitant LDL
Ambil sampel serum darah hewan coba menggunakan mikro pipet
sebanyak 100 µl dimasukkan kedalam tabung, ambil precipitant reagent
sebanyak 1000 µl kemudian dicampurkan kedalam tabung yang berisi
sampel, setelah itu dicampur dan diinkubasi pada suhu ruangan selama
15 menit, sentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 20 menit
kemudian ambil sebanyak 100 µl untuk di campurkan dengan kolesterol
total.
31
b. Pembuatan kolesterol total
Reagent koleserol total dimasukkan kedalam 2 tabung sebanyak
1000 µl dimana masing-masing tabung diberi label sempel dan standart,
masukkan sampel precipitant sebanyak 100 µl kedalam tabung yang
bertuliskan label sampel dan serum sampel darah hewan coba sebanyak
100 µl pada tabung yang bertuliskan label standart. Masing-masing
tabung dicampurkan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu
ruangan, kemudian baca absorban sampel dan standart pada gelombang
500 nm.
Cara menghitung kolestrol total :
𝑘𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = C (sampel)xA (sampel)
A standart
c. Penghitungan LDL
LDL = kolesterol total – kolesterol precipitant
4.8.8 Analisis data
Analisis data pada penelitian ini menggunakan analisis data uji
normalitas, uji one way anova, uji post hoc.
a. Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui apakah suatu group data
terdistribusi secara normal atau tidak. Uji normalitas menggunakan
shapiro-wilk, data dikatan normal apabila signifikan >0,05.
b. Uji homogenitas dilakukan untuk mengetahui varian data homogen
atau tidak, dalam penelitain menggunakan uji homogenitas dengan uji
levene
32
c. Uji one way anova dilakukan apabila uji shapiro-wilk menunjukkan
hasil data normal. Uji one way anova dilakukan untuk melihat apakah
terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dengan
kelompok perlakuan, hasil uji one way anova dikatakan signifikan jika
p <0,05.
d. Uji post hoc bonferroni dilakukan apabila uji one way anova
didapatkan hasil ragam homogen, sedangkan uji post hoc tamhane’s
dilakukan apabila uji one way anova didapatkan hasil ragam yang
tidak homogen.
e. Uji regresi linier dilakukan untuk mengetahui apakah terdapat hubugan
yang sangat kuat antara ekstrak kulit jeruk lemon terhadap kadar LDL
pada tikus wiatar jantan (Rattus nivergicus) yang diinduksi oleh
minyak goreng deep frying.