33

BAB 3. METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian true eksperimental di laboratorium bersifat komparatif dengan desain rancangan acak lengkap.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Tempat pelaksanaan penelitian ini adalah Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan September 2014.3.4 Desain Penelitian

Keterangan:

P = Populasi tikus wistar (Rattus Novergicus)

S = Sampel yang memenuhi kriteria inklusi

Awal = pengukuran kadar LDL sebelum induksi kuning telur dan PTU

X0= Induksi kuning telur ayam dan PTU selama dua minggu

Pre = Pengukuran kadar LDL setelah induksi kuning telur dan PTUR= Random SamplingK+= Kelompok kontrol positif yang diberikan simvastatin

K-= Kelompok kontrol negatif yang diberikan aquades

P1= Kelompok perlakuan yang diberikan infusa daun salam

P2= Kelompok perlakuan yang diberikan infusa daun seledri

X1= Pemberian simvastatin selama satu minggu

X2= Pemberian aquades ad libitum selama satu minggu

X3= Pemberian infusa daun salam selama satu minggu

X4= Pemberian infusa daun seledri selama satu minggu

Post = Pengukuran kadar LDL setelah perlakuan X1, X2, X3, dan X43.4 Variabel Penelitian

a. Variabel independen : infusa daun salam konsentrasi 20% dan daun seledri konsentrasi 20%

b. Variabel dependen : kadar LDL tikus wistar model dislipidemiac. Variabel kontrol : Simvastatin (kontrol positif), Aquadest (kontrol negatif)

3.5 Pemilihan Sampel dan Penentuan Besar Sampel

Sampel yang akan digunakan adalah tikus wistar (Rattus novergicus) yang telah memenuhi kriteria inklusi yaitu, tikus yang sehat, berjenis kelamin jantan, berusia antara dua samapai 3 bulan, dan berat badan antara 150-200 gram. Tikus yang memiliki kriteria eksklusi sebelum maupun selama penelitian harus dikeluarkan dari sampel. Kriteria eksklusinya adalah tikus yang sakit atau mati. Sampel dalam penelitian ini adalah sebanyak 28 ekor tikus, yang didasarkan pada rumus Federer.Penghitungan besar sampel menurut Rumus Federer :

(n 1) (t 1 ) 15

(n 1) (4 1) 15

(n 1 ) (3) 15

n 1 5

n 6n : jumlah ulangan

t : jumlah kelompok perlakuan

3.6 Definisi Operasional

a. Infusa daun salamDaun salam yang digunakan dalam penelitian ini didapatkan dari Pasar Tanjung di Jember. Daun salam dipilih yang segar dan diambil bagian daunnya saja untuk kemudian dibuat dalam bentuk infusa. Infusa daun salam diberikan dengan cara oral sonde sebanyak satu kali dalam sehari selama satu minggu. Dosis infusa daun salam yang diberikan pada tikus adalah 2 gram/KgBB/hari. Cara pembuatan dan perhitungan dosis infusa daun salam dapat dilihat di prosedur penelitian pada halaman 30.b. Infusa daun seledri

Daun seledri yang digunakan dalam penelitian ini didapatkan dari Pasar Tanjung di Jember. Daun seledri dipilih yang segar dan diambil bagian daunnya saja untuk kemudian dibuat dalam bentuk infusa. Infusa daun seledri diberikan dengan cara oral sonde sebanyak satu kali dalam sehari selama satu minggu. Dosis infusa daun seledri yang diberikan pada tikus adalah 2 gram/KgBB/hari. Cara pembuatan dan perhitungan dosis infusa daun seledri dapat dilihat di prosedur penelitian pada halaman 30.c. Kadar LDL

Kadar LDL pada penelitian ini diukur sebanyak tiga kali, yaitu sebelum induksi kuning telur dan PTU selama dua minggu, sebelum perlakuan pemberian infusa daun salam, daun seledri, dan simvastatin, serta setelah perlakuan selama satu minggu. Sampel darah diambil dengan cara melakukan insisi pada bagian distal ekor tikus untuk mengambil darahnya sebanyak 1 ml.

Sampel darah yang didapatkan digunakan untuk pemeriksaan kadar LDL menggunakan metode indirek. Untuk mengukur kadar LDL, terlebih dahulu sampel darah disentrifus, kemudian diukur kadar kolesterol total, trigliserida, dan HDL dengan metode endpoint menggunakan alat Mikrolab 300. Hasil yang didapatkan dimasukkan ke dalam rumus perhitungan kadar LDL menurut Friedewald (Widiastuti, 2003).

Perhitungan kadar LDL:LDL (mg/dl) = kolesterol total (HDL + )

Batas normal kadar LDL darah pada tikus adalah 7 27,2 mg/dL. (Riesanti, 2012).

d. Tikus wistar model dislipidemia

Tikus wistar model dislipidemia pada penelitian ini didapatkan dengan cara induksi mengunakan kuning telur ayam dan PTU. Dosis kuning telur ayam yang diberikan adalah 10 ml/KgBB/hari dan dosis PTU yang diberikan adalah 2 mg/KgBB/hari. Kuning telur dan PTU diberikan dengan cara oral sonde sebanyak satu kali dalam sehari selama dua minggu.e. Simvastatin

Simvastatin yang digunakan dalam penelitian ini adalah produksi Novell dan berbentuk tablet 10 mg. Simvastatin tidak dapat larut dalam air sehingga untuk melarutkannya perlu ditambahkan CMC (Carboxy Methyle Cellulose) agar terbentuk suspensi simvastatin. Suspensi simvastatin yang terbentuk diberikan dengan cara oral sonde sebanyak satu kali dalam satu hari selama satu minggu dengan dosis 0,18 mg/200 gramBB/hari. Cara pembuatan dan perhitungan dosis simvastatin dapat dilihat di prosedur penelitian pada halaman 31.3.7 Alat dan Bahan Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan, beaker glass, api bunsen, oral sonde, dan tabung reaksi. Untuk bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun salam, daun seledri, pakan tinggi lemak yaitu kuning telur ayam, pakan tikus standar, PTU, tablet simvastatin, CMC, dan aquades.

3.8 Prosedur Penelitian

3.8.1 Cara Pembuatan dan Perhitungan Dosis

a. Infusa Daun Salam

Daun salam dicuci dan dipotong halus, ditimbang sebanyak 5 gram kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass, ditambahkan aquades 100 ml, dan dipanaskan selama 15 menit. Selanjutnya campuran tersebut dikeluarkan dan disaring. Dari larutan tersebut diambil 80 ml kemudian dipanaskan lagi sampai tersisa 20 ml.

Hasilnya terbentuk infusa daun salam dengan konsentrasi 20%, yaitu 4 gram daun salam dalam 20 ml aquades. Dosis infusa daun salam yang diberikan pada tikus adalah 2 gram/KgBB/hari. Tikus dengan berat badan 200 gram akan diberikan infusa sebanyak 2 ml.Perhitungan dosis infusa daun salam:

Konsentrasi daun salam 20% = 20 gram daun salam dalam 100 ml air

= 4 gram daun salam dalam 20 ml air

Dosis = 10 ml/KgBB = 2 gram/KgBB

Dosis tikus (200 gram) = 2 ml/200 gramBB = 0,4 gram/200 gramBB/hari

b. Infusa Daun Seledri

Daun seledri dicuci dan dipotong halus, ditimbang sebanyak 5 gram kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass, ditambahkan aquades 100 ml, dan dipanaskan selama 15 menit. Selanjutnya campuran tersebut dikeluarkan dan disaring. Dari larutan tersebut diambil 80 ml kemudian dipanaskan lagi sampai tersisa 20 ml.

Hasilnya terbentuk infusa daun seledri dengan konsentrasi 20%, yaitu 4 gram daun seledri dalam 20 ml aquades. Dosis infusa daun seledri yang diberikan pada tikus adalah 2 gram/KgBB/hari. Tikus dengan berat badan 200 gram akan diberikan infusa sebanyak 2 ml.

Perhitungan dosis infusa daun seledri:

Konsentrasi daun seledri 20% = 20 gram daun seledri dalam 100 ml air

= 4 gram daun seledri dalam 20 ml air

Dosis = 10 ml/KgBB = 2 gram/KgBB

Dosis tikus (200 gram) = 2 ml/200 gramBB = 0,4 gram/200 gram BB/hari

c. Larutan PTU 0,02%

PTU digerus sampai berbentuk serbuk halus, kemudian dilarutkan ke dalam aquades. Konsentrasi PTU 0,02% dibuat dengan cara melarutkan 0,02 gram PTU dalam 100 ml air. Dosis PTU yang diberikan pada tikus adalah 2 mg/KgBB/hari.

Perhitungan dosis PTU:PTU konsentrasi 0,02% = 0,02 gram PTU dalam 100 ml air

Dosis tikus = 10 ml/KgBB = 2 mg/KgBB/hariDosis tikus (200 gram) = 2 ml/200 gramBB = 0,4 mg/200 gramBB/hari

d. Suspensi Simvastatin

Simvastatin tidak bisa larut dalam air, sehingga suspensi simvastatin dibuat dengan melarutkan serbuk simvastatin ke dalam larutan CMC. Larutan CMC 1% dibuat dengan cara melarutkan 1 gram CMC ke dalam aquades panas sampai volume 100 ml. Didiamkan selama 15 menit, setelah itu diaduk sampai diperoleh massa yang homogen. Kemudian ditimbang tablet simvastatin yang setara dengan 10 mg simvastatin pada manusia, yaitu 0,18 mg untuk tikus dengan berat badan 200 gram. Tablet simvastatin dgerus sampai halus, lalu ditambahkan ke dalam larutan CMC dan diaduk sampai homogen.Perhitungan dosis simvastatin:

Dosis simvastatin pada manusia = 10 mg/kgBB/hariDosis tikus (200 gram) = 0,018 x 10 = 0,18 mg/200 gramBB/hariKonsentrasi simvastatin 0,01% = 0,01 gram dalam 100 ml air

= 10 mg dalam 100 ml air = 0,1 mg/ml

Volume simvastatin yang diberikan pada tikus = 1,8 ml/200 gramBB/hari3.8.2 Perlakuan / Intervensi terhadap Hewan Coba

Intervensi atau perlakuan yang dilakukan terhadap hewan coba terdiri dari pemberian induksi kuning telur dan PTU, pemberian infusa daun salam dan daun seledri, serta pemberian suspensi simvastatin. Intervensi yang dilakukan berupa penyondean. Proses penyondean dilakukan sebanyak satu kali dalam sehari.

Terdapat beberapa risiko potensial yang dapat terjadi akibat intervensi oral sonde, antara lain, aspirasi paru dan perlukaan saluran pencernaan atas (mulut dan esofagus). Untuk memperkecil risiko tersebut, proses penyondean harus dilakukan dengan cara yang tepat dan alat sonde yang dapat memperkecil risiko. Saat melakukan proses penyondean tikus harus dipegang dengan cara yang benar, caranya bagian pangkal ekor tikus tikus dipegang dengan tangan kanan, bagian tengkuk tikus dijepit dengan telunjuk dan ibu jari tangan kiri. Posisi tubuh tikus dibalikkan sehingga permukaan perut menghadap atas dan ekor dijepitkan di antara jari manis dan kelingking tangan kiri. Alat oral sonde ditempelkan pada langit-langit mulut tikus, kemudian perlahan-lahan dimasukkan sampai ke esofagus. Alat oral sonde yang digunakan adalah spuit yang ujungnya tumpul dan dihubungkan dengan selang yang lentur dan lunak.

3.8.3 Pengambilan Spesimen

Spesimen yang diambil dalam peneliian ini adalah darah. Darah diambil dengan cara membuat insisi pada bagian distal dari ekor tikus, darah yang diambil sebanyak 1 ml. Proses pengambilan darah dilakukan sebanyak tiga kali. Pada awal sebelum induksi, sebelum perlakuan (Pre), dan setelah perlakuan (Post). Jarak waktu antar pengambilan darah yang pertama dan kedua adalah dua minggu, sedangkan jarak waktu antara pengambilan darah kedua dan ketiga adalah satu minggu.

Sampel darah diambil melalui ujung ekor di bagian distal dengan cara membuat insisi menggunakan scalpel tajam. Proses ini dilakukan oleh dua orang, orang pertama bertugas memegang tikus dengan mantap menggunakan dua tangan, sedangkan orang kedua bertugas membuat insisi dan mengambil darah. Bagian yang akan disayat ditentukan terlebih dahulu, kemudian disayat dengan mantap mengguanaan scalpel melalui satu kali sayatan. Darah yang keluar langsung diteteskan dan ditampung ke dalam tabung reaksi. Setelah proses pengambilan sampel selesai, bagian ujung ekor dibersihkan dengan kasa dan diberikan povidine iodine.

Terdapat beberapa risiko potensial yang dapat terjadi akibat proses pengambilan darah, antar lain perdarahan yang telalu banyak akibat sayatan yang terlalu panjang dan infeksi pada daerah perlukaan. Untuk memperkecil risiko potensial yang dapat terjadi, proses penyayatan harus dilakukan dengan hati-hati dan teliti. 3.9 Analisis Data

Data yang didapatkan dari penelitian ini berupa data numerik / kuantitatif rasio yang didapatkan dari pengukuran, yaitu kadar LDL darah tikus wistar. Data inilah yang menjadi skala pengukuran dari variabel dependen. Jenis hipotesis yang digunakan adalah komparatif pre post, yaitu membandingkan kadar LDL sebelum dan setelah pemberian infusa daun salam dan daun seledri. Hipotesis lain yang digunakan adalah hipotesis komparatif untuk membandingkan pengaruh infusa daun salam dan daun seledri terhadap kadar LDL darah tikus wistar model dislipidemia.

Kelompok data yang digunakan untuk menguji efek pemberian infusa daun salam dan daun seledri secara tunggal terhadap kadar LDL, adalah kelompok data berpasangan. Sebab, data tersebut didapatkan dari individu yang sama karena pengukuran berulang Sehingga untuk menguji efek masing-masing infusa terhadap penurunan kadar LDL digunakan metode uji t berpasangan.Hipotesis komparatif yang digunakan untuk membandingkan kadar LDL dari empat kelompok perlakuan yang terdapat dalam penelitian ini menggunakan data yang tidak berpasangan, karena data berasal dari individu yang berbeda, Maka untuk membandingkan kadar LDL dari keempat kelompok, digunakan metode analisis data One Way ANOVA.

Terdapat beberapa syarat yang harus terpenuhi untuk melakukan pengujian dengan menggunakan metode One Way ANOVA. Syarat tersebut adalah distribusi data yang normal dan homogen. Sehingga perlu dilakukan uji normalitas untuk mengetahui apakah distribusi data normal atau tidak serta uji homogenitas untuk mengetahui varians data bersifat homogen atau tidak. Untuk melakukan uji normalitas ada beberapa metode yang dapat dilakukan, yaitu uji chi-kuadrat, uji Kolmogorov-Smirnov, dan Shapiro Wilk. Karena jumlah sampel yang yang digunakan dalam penelitian ini kurang dari 50, maka metode yang digunakan adalah Shapiro Wilk. Sedangkan untuk uji homogenitas menggunakan uji Levene.

Apabila setelah dilakukan uji normalitas dan uji homogenitas, didapatkan hasil distribusi data yang tidak normal dan tidak homogen, maka uji one way ANOVA tidak dapat dilakukan dan pengujian harus dilakukan dengan metode non parameterik Kruskal Wallis.

3.10 Alur Penelitian

28 ekor tikus jantan galur wistar

Usia 2 3 bulan, berat badan 150 200 gram

Adaptasi 1 minggu

Pengukuran kadar LDL darah tikus awal

Induksi kuning telur ayam dan PTU

Dosis 2 mg/KgBB/hari selama 2 minggu

Pengukuran kadar LDL darah tikus

Diberikan perlakuan selama 1 minggu

Kelompok K-

Tikus wistar diberikan aquades ad libitumKelompok P1

Tikus wistar diberikan infusa daun salam dosis 2 gram/KgBB/hari Kelompok P2

Tikus wistar diberikan infusa daun seledri dosis 2 gram/KgBB/hari Kelompok K+

Tikus wistar diberikan simvastatin dosis 0,18 mg/200 gramBB/hari

Pengukuran kadar LDL darah tikus

Analisis Data

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

Kadar LDL diukur sebanyak tiga kali, sebelum induksi kuning telur dan PTU (kadar LDL awal), setelah induksi kuning telur dan PTU (kadar LDL Pre), dan setelah pemberian simvastatin, infusa daun salam, dan daun seledri (kadar LDL Post). Rata-rata hasil pengukuran kadar LDL awal dan kadar LDL Pre beserta standar deviasi (SD) disajikan dalam Tabel 4.1.

Tabel 4.1 Hasil pengukuran kadar LDL sebelum dan setelah induksi kuning telur dan PTU serta standard deviasi (SD)

Kadar LDLAwalPre

Rata-rata3350,67

SD17,0321

Berdasarkan hasil rata-rata pengukuran kadar LDL awal dan kadar LDL Pre dapat diketahui bahwa terdapat peningkatan kadar LDL sebesar 17,67 mg/dl dari 33 mg/dl menjadi 50,67 mg/dl. Rata-rata hasil pengukuran kadar LDL sebelum dan setelah diberikan perlakuan dari keempat kelompok beserta besar penurunan kadar LDL (delta) dan presentase penurunan kadar LDL, disajikan pada Tabel 4.2.

Tabel 4.2 Hasil pengukuran kadar LDL sebelum dan setelah diberikan perlakuan serta besar penurunan kadar LDL (delta)

KelompokPrePostDeltaPresentase

K+43,1535,467,6817,79

P153,283122,2841,81

P254,9530,2824,6744,89

K-51,2838,3612,9125,17

Berdasarkan nilai rata-rata kadar LDL tersebut, dapat diketahui bahwa Kelompok P2 memiliki nilai rata-rata kadar LDL tertinggi setelah pemberian induksi kuning telur dan PTU selama dua minggu untuk membuat tikus menjadi dislipidemia, sedangkan rata-rata terendah terdapat pada kelompok K+. Setelah perlakuan selama satu minggu, kelompok K- memiliki nilai rata-rata kadar LDL darah tertinggi, sedangkan kelompok P2 memiliki nilai rata-rata terendah. Penurunan kadar LDL darah tertinggi terdapat pada kelompok P2, sedangkan penurunan kadar LDL darah terendah terdapat pada kelompok K+.

Grafik peningkatan kadar LDL setelah induksi dan penurunan kadar LDL setelah perlakuan disajikan dalam Gambar 4.1.

Gambar 4.1. Grafik kadar LDL awal, Pre, dan Post4.2 Analisis Hasil

Analisis data statistik yang digunakan dalam penelitian ini adalah menggunakan uji t berpasangan atau paired sample t test dan uji one way ANOVA. Uji t berpasangan digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan yang signifikan dari dua buah mean (rata-rata) variabel yang dibandingkan dari sampel yang sama setelah perlakuan berulang. Dalam penelitian ini yang dibandingkan adalah kadar LDL sebelum mendapatkan perlakuan dan kadar LDL setelah mendapatkan perlakuan. Uji one way ANOVA digunakan untuk menguji signifikansi perbedaan rata-rata data pada sampel yang lebih dari dua kelompok dan independen.

Uji t berpasangan termasuk ke dalam uji statistik parametrik, syarat yang harus terpenuhi adalah data yang dianalisis berasal dari kelompok yang berpasangan (dependen) dan terdistribusi normal. Sementara untuk uji one way ANOVA, syarat yang harus terpenuhi adalah data sampel berasal dari kelompok yang independen, varian homogen, dan terdistribusi normal. Untuk mengetahui apakah data terdistribusi secara normal atau tidak, harus dilakukan uji normalitas.

Uji normalitas yang dipilih adalah uji Shapiro Wilk, karena jumlah sampel kurang dari atau sama dengan 50. Hasil uji normalitas dari keempat kelompok menunjukkan bahwa data terdistribusi normal, karena nilai signifikansi p>0,05 pada semua kelompok. Nilai signifikansi untuk kelompok K+ adalah p=0,815, K- adalah p=0,594, P1 adalah 0,142, dan P2 adalah p=0,211. Uji homogenitas yang digunakan adalah uji Levene, dimana hasilnya juga menunjukkan varian data yang homogen dengan nilai signifikansi p=0,712 atau p>0,05. Karena hasil yang didapatkan adalah data terdistribusi normal dan varian homogen, maka dapat dilakukan pengujian dengan menggunakan uji t berpasangan dan uji one way ANOVA.

Hipotesis (Ho) yang digunakan untuk mengambil keputusan adalah tidak terdapat perbedaan kadar LDL darah tikus wistar dislipidemia sebelum dan setelah perlakuan. Taraf kepercayaan yang digunakan adalah 95% atau p=0,05. Sehingga interpretasinya adalah Ho diterima apabila p>0,05, yang berarti tidak terdapat perbedaan kadar LDL darah sebelum dan setelah perlakuan. Sedangkan, Ho ditolak apabila p