ATLAS PARA PATOLOGIALESIONES MACRO-MICRO

Dr. JAIME AUGUSTO ORTIZ SALAZARMédico veterinario y zootecnista

Aspectos generales

•Neutrofilia, sangre periférica - Microscópico•Exudación - Microscópico•Marginación y diapédesis de neutrófilos - Microscópi co•Inflamación con necrosis, vasculitis y trombosis - Mi croscópico•Exudado de fibrina - Microscópico•Exudado fibrinoso, pericardio - Macro y Microscópico•Exudado purulento, pericardio - Macroscópico•Bronconeumonía aguda - Microscópico•Abcesos, pulmón - Macro y Microscópico•Endometritis crónica - Microscópica•Inflamación crónica, paredes bronquiales - Microscóp ico•Abceso, ORGANIZACIÓN - Microscópico•Tejido de granulación - Microscópico•Inflamación granulomatosa, pulmón - Macro y Microscó pico•Células gigantes (Langhans) en granuloma - Microscópi co•Células epiteloides en granuloma - Microscópico•Nódulo en silicosis, pulmón - Microscópico

Lesión Celular•Hipertrofia Cardíaca Concéntrica - Macroscópico•Necrosis Coagulativa, Bazo - Macroscópico•Necrosis Licuefactiva, Hígado - Microscópico•Necrosis Licuefactiva, Cerebro - Macro y Microscópic o•Necrosis caseosa, Pulmón - Macro y Microscópico•Cambio graso, Hígado - Macro y Microscópico•Cirrosis, Hígado - Macroscópico•Amiloidosis Macro y Microscópico•Amiloidosis Renal - Macro y Microscópico•Lipofucsina, Hígado - Microscópico•Hemosiderosis - Microscópico•Esclerótica Ictérica (en ojo humano) - Macroscópica•Bilirrubina, Hígado - Microscópico•Antracosis, pulmón - Macro y microscópico•Calcificación Distrófica, estómago - Microscópico•Calcificación Metastásica, pulmón – Microscópico

Las colectas de fluído extravascular pueden ser clasificadas como:Exudado: Colecta de fluído extravascular que es rico en proteínas y/o células. El fluído parece turbio.Transudado: Colecta de fluído extravascular que es básicamente un ultrafiltrado de plasma con pequeñas proteínas y puede haber o no una pequeña cantidad de células. El fluído aparece transparente macroscópicamente.

Las efusiones dentro de cavidades corporales pueden ser descriptas además como:Serosas: un transudado principalmente con fluído edematoso y pocas células.Serosanguinolentas: efusión con eritrocitos.Fibrinosas (serofibrinosas): presencia de fibrina que abandona el fluído intravascular y es derivado a un exudado rico en proteínas.Purulentas: efusión con muchos PMN´s presentes.

La inflamación aguda está caracterizada por un aumento de células inflamatorias. Tal vez el más simple indicador de una inflamación aguda es un incremento en el número de los glóbulos blancos sanguíneos en la sangre periférica, aquí marcados por un aumento de neutrófilos segmentados (PMN)

Aquí observamos vasodilatación con exudación que ha llevado a un torrente de fluido con fibrina dentro del espacio alveolar, junto con PMN´s. La serie de eventos en el proceso de inflamación son:

1. Vasodilatación : conduce a un mayor flujo sanguíneo en el área de inflamación, dando como resultado rubor y calor.

2. Permeabilidad vascular : las células endoteliales se vuelven más permeables, ya sea por lesión directa de la célula endotelial o por acción de mediadores químicos.

3. Exudación : fluídos, proteínas, eritrocitos y leucocitos escapan del espacio intravascular como resultado de un incremento en la presión osmótica extravascular y un aumento de la presión hidrostática intravascular.

4. Estasis vascular : enlentece la sangre en la corriente con vasodilatación y exudación fluída para permitir a los mediadores químicos y células inflamatorias reunir y responder al estímulo.

La vasculitis mostrada aquí demuestra la destrucción que puede acompañar un proceso inflamatorio aguda y la interacción con el mecanismo de coagulación. La pared arterial está experimentando necrosis, y hay formación de un trombo en el lumen.

A mayor aumento, la vasculitis con necrosis de la pared arterial puede observarse. Se puede notar los fragmentos que quedan de núcleos de los neutrófilos (cariorrexis). La inflamación aguda es un proceso no selectivo que puede conducir a la destrucción tisular.

Como se observa en el diagrama precedente, los PMN´s que están marginadosen contacto con la pared de la vénula que está dilatada (flecha), son presionados hacia la membrana basal (diapédesis ) y se dirigen afuera hacia el espacio extravascular.

Este es un ejemplo de un entramado de fibrina en un fluído con PMN´s en un área de inflamación aguda. Esta colecta de fluído es la que produce el tumor o tumefacción de una inflamación aguda.

La exudación de un fluído rico en proteínas dentro de una cavidad conduce a la formación de un transudado. La fibrina en este fluído puede formar un exudado fibrinoso en las superficies. Aquí, la cavidad pericárdica ha sido abierta para revelar una pericarditis fibrinosa con un entramado pálido de fibrina entre el pericardio visceral y parietal.

Microscópicamente, el exudado fibrinoso puede ser observado como un entramado acidófilo de fibrina sobresaliendo desde la superficie del pericardio (arriba a la izquierda). Debajo de la fibrina encontramos algunas células inflamatorias dispersas.

Este es un exudado purulento en el cual el exudado fluido también contiene un gran número de células inflamatoria.

Los PMN´s que se observan están en el alvéolo, indicando una bronconeumonía aguda del pulmón. Los PMN´s forman un exudado supurativo en el alvéolo.

Numerosos neutrófilos llenan el alvéolo en este caso de broncopneumoníaacompañada de una alta fiebre. Pseudomona aeruginosa fue cultivada de esputos. Se deben notar los capilares dilatados en las paredes alveolares por vasodilatación con el proceso de inflamación aguda.

Inflamación aguda extensa que conduce a la formación de abcesos, que se observan aquí con abcesos redondeados (el material purulento ha sido drenado) en lóbulos.

Un abceso es una colecta localizada de PMN´s. Aquí vemos un microabceso en el miocardio. El centro basófilo irregular está formado por bacterias que son las causantes de la inflamación.

Aquí pueden observar otro abceso local en pulmón. Los alvéolos en ese área fueron destruídos.

Inflamación crónica es más difícil de entender, porque es más variable. Aquípueden ver una endometritis crónica (subaguda) con linfocitos y células plasmáticas en el estroma endometrial. En general, el infiltrado inflamatorio de la inflamación crónica consiste principalmente de células mononucleares : linfocitos, células plasmáticas y macrófagos.

Inflamación crónica con destrucción de la pared bronquial. Un infiltrado inflamatorio se extiende del lumen hacia abajo a la izquierda.

Este abceso posee una mezcla de células inflamatorias, pero la pared del abceso se está "organizando" con fibroblastos y generación de neovasos(angioblastos forman capilares) .

A mayor aumento el tejido de granulación posee capilares , fibroblastos y una variable cantidad de células inflamatorias (mayormente mononucleares , pero con la posibilidad de que estén presentes algunos PMN).

La resolución de la inflamación a mundo implica el crecimiento de capilares y fibroblastos. Esto forma el tejido fino de la granulación. Aquí, un infarto de miocardio agudo se encuentra en esta fase de resolución. Hay capilares numerosos y el colágeno se está ubicando para formar una cicatriz. El miocardono infartado está presente en el sector izquierdo de la imagen.

Esta es una sitio biopsia de piel en reparación vista una semana luego del corte. La superficie de la piel se re-epitelizó, y bajo este epitelio hay un tejido de granulación con pequeños tuvos capilares y fibroblastos formando colágeno. Después de un més, sólo una pequeña cicatríz colagenosapermanecerá.

La reacción inflamatoria es a veces principalmente una forma de reparación y formación de cicatriz, como se puede ver aquí en un nódulo de sílice en pulmón. El sílice inhalado persiste indefinidamente y produce una reacción inflamatoria que está marcada por una fibrosis prominente. Densos depósitos de colágeno se ven en el centro del nódulo.

LESIONES CELULARES

Hipertrofia Cardiaca - En este caso involucra al ventrículo izquierdo . El número total de fibras musculares no aumenta, pero el tamaño individual puede aumentar en respuesta a un incremento en la carga de trabajo, destacándose un marcado aumento de espesor en este paciente que sufre una hipertensión sistémica.

•Infarto Anémico - Bazo. Dos grandes infartos (áreas de necrosis isquémica, en este caso coagulativa) se observan en este bazo seccionado. Como la etiología de necrosis coagulativa es usualmente vascular con pérdida de aporte sanguíneo, el infarto ocurre en una zona de distribución vascular. Por esto los infartos son a menudo con forma de cuña con la base en la cápsula del órgano.

• Etiología: Se debe a la necrosis isquémica provocada por la falta de aporte sanguíneo adecuado al tejido. En general se deben a obstrucción del riego arterial (como en este caso) o en menor medida a interferencias en el retorno venoso (por congestión). La consistencia del bazo (que reduce la intensidad de la hemorragia) y la oclusión arterial del mismo provocan que el infarto sea anémico y no hemorrágico.

• Macroscópicamente primero hay una zona pálida, hinchada y mal delimitada, luego hay tejido amarillento y mejor delimitado. Porúltimo hay sustitución con tejido fibroso. La necrosis presenta forma de cuña.

• Microscópicamente se observa necrosis coagulativa a caseosa en la zona afectada (no hay tejido linfoide, se preserva la arquitectura celular pero se pierden las pulpas blancas y rojas, los límites celulares están mal definidos e incluso se observa estructura fibrilar con algunos núcleos como único contenido). Alrededor de la zona de necrosis hay focos hemorrágicos (borde hiperémico que separa el tejido normal de la zona infartada) y más allá aparece una estructura basófila puntillada de núcleos redondos casi sin citoplasma (linfocitos). Desarrollo de respuesta inflamatoria aguda. Hay una posterior invasión de tejido de granulación y cicatriz colágena en la zona de necrosis.

Absceso - El hígado muestra un absceso pequeño con presencia de neutrófilos. Este absceso es un ejemplo de una necrosis licuefactiva localizada.

• Etiología: Característica de infecciones bacterianas focales y ocasionalmente provocada por infecciones micóticas.

• Macroscópicamente se observa tejido de aspecto semilíquido . Si el proceso se desencadenó por inflamación aguda por infección, suele haber material amarillento y cremoso (pus con piocitos).

• Microscópicamente hay pérdida de detalle y arquitectura celular debido a la digestión celular que puede ser por heterólisis (enzimas de neutrófilos) o autólisis (enzimas propias de esa célula lisada). Hay llegada de PMN (piocitosen este caso que forman pus). En el centro del foco necrótico suele haber bacterias.

• La zona acidófila es zona viable, y la zona basófila y otras zonas claras indican necrosis (formación de abcesos).

• Puede haber precipitados Ag/Ac ("DRUSAS"). En caso de encontrarlos puedo suponer que la etiología es actinomicitales o micosis. Si no observo precipitados la etiología podría ser streptococcos.

Infarto cerebral - Macroscópicamente se observa en el extremo superior izquierdo de la imagen un área de necrosis licuefactiva.

A medida que este infarto se está reorganizando y resolviendo, la necrosis licuefactiva conduce a la resolución con espacios cavitarios

Esta es una necrosis licuefactiva de cerebro en un paciente que sufrió un derrame con una pérdida focal de riego sanguíneo a una porcion de cerebro (infarto cerebral). El tipo de infarto es destacado por la pérdida de neuronas y células de la neuroglía y formación de zonas claras (espacios libres de células) ubicados en el sector izquierdo-central de esta imagen.

A mayor aumento, la necrosis licuefactiva del cerebro permite observar algunos macrófagos (corresponden a la microglía) que están "limpiando" los restos celulares (células barredoras de espuma) y se ubican a la derecha de la imagen.

• Necrosis caseosa - Aspecto macroscópico. En la imagen de la izquierda se observa necrosis caseosa en un linfonódulo con tuberculosis. El nodulo tiene un aspecto blanco amarillento parecido a queso. Este tipo de necrosis es una combinación de necrosis coagulativa y licuefactiva que es característica en inflamaciones granulomatosas. En la imagen derecha la necrosis caseosa está más extendida, con granulomasamarronados y de color similar al queso, en la porción superior de este pulmón en un paciente con tuberculosis. La destrucción de tejido es tan extendida que hay áreas con cavidades siendo formadas mientras los restos necróticos (principalmente líquidos) son drenados por vía bronquial .

La enfermedad granulomatosa puede extenderse, aquí se observan numerosos granulomas confluentes en un caso de tuberculosis pulmonar.

La naturaleza focal de la inflamación granulomatosa se demuestra en esta sección microscópica de pulmón en la cual hay granulomas dispersos en el parénquima. Por esto la radiografía de torax en pacientes con tuberculosis u otras enfermedades granulomatosas es a menudo descripta como "reticulonodudular". Una biopsia puede llegar a fallar y no captar lesiones por unerror en el lugar de toma de muestra o de técnica.

Aquí se observan dos granulomas pulmonares. Estas inflamaciones granulomatosas contienen macrófagos epiteliales, células gigantes , linfocitos, células plasmáticas y fibroblastos. Puede llegar a presentarse, además, algún neutrófilo.

Las células gigantes se forman por fusión de varios macrófagos epiteliales. Se consideran aquí dos células gigantes de Langhans en las cuales los núcleos se alinean alrededor de la periferia de la célula y adquieren una disposición "en herradura". Los macrófagos epiteliales acidófilos adicionales componen la mayoría del resto del granuloma.

Microscópicamente la necrosis caseosa está caracterizada por áreas de necrosis acelulares acidófilas, como se ven en la imagen en el sector superior derecho, rodeado de un proceso inflamatorio granulomatoso. Los granulomas caseosos pueden ser causados por hongos dimórficos como H. capsulatum o C. neoformans.

Esto es un granuloma caseoso. Las células epitelioides rodean un área central de la necrosa que aparece irregular, amorfa y de color rosa.

Estas son células epiteliodes alrededor del centro de un granuloma. Consiguen su nombre del hecho de que tienen porciones de citoplasma rosado similares a las células epiteliales escamosas. Sus núcleos tienden a ser largos y fibrosos.

• Etiología: es causada por la infección persistente por microorganismos como Mycobacterium tuberculosis (en este caso), Treponema Pallidum, hongos, etc.

• Macroscópicamente se observa tejido blanco (parecido al queso fresco) y blando. Mezcla de zonas de necrosis caseosa y coagulativa. Los granulomas tuberculosos caseificantes (tubérculos) se observan como pequeños puntos blanco-amarillentos.

• Microscópicamente el foco aparece como restos granulares amorfos compuestos por células coaguladas, fragmentadas, encerradas dentro de un borde inflamatorio definido como reacción granulomatosa. Hay pérdida de detalle y arquitectura celular . Zona acidófila central amorfa con zonas basófilas (calcificación distrófica, no se observan en las imágenes de esta página). Alrededor del foco necrótico hay una zona de PMN. Granuloma:zona focal de inflamación granulomatosa formada por acúmulo de células epiteliodes (son características del proceso) y necrosis caseosa rodeados por células gigantes , linfocitos, y por fuera fibroblastos y tejido conjuntivo. Pueden existir focos de calcificación distrófica.

Cambio Graso - Aspecto macroscópico de un hígado con acumulación de lípidos. Toma un tinte amarillento debido a la presencia de carotenos (se almacenan en tejidos con alto contenido lipídico).

Acumulaciones intracelulares de una variedad de materiales puede ocurrir en respuesta a una lesión celular. Aquí hay un cambio graso de hígado en el cual se conduce a una acumulación de lípido en el citoplasma de los hepatocitos.

El acúmulo en citoplasma es una mezcla de grasas neutras, tanto TAG como ésteres de colesterol, los cuales se extraen con el alcohol, con lo cual vemos los lugares que fueron ocupados por las grasas y que no están teñidos con las técnicas colorantes tradicionales (hematoxilina / eosina). Los núcleos son picnóticos y periféricos (en el caso de una acumulación de agua y sal los núcleos serían centrales).

Cirrosis Hepática. La lesión del hígado puede conducir a una fibrosis y regeneración de los hepatocitos en nódulos. Esta firme apariencia nodular del hígado como la que se observa en la foto es llamada cirrosis.

Cirrosis. Nódulos parenquimatosos hiperplásicos separados por bandas fibrosas con distorsión de la arquitectura normal del hígado, moderada infiltración de células mononucleares. Perro.

Bazo Lardáceo - Acumulación de Amiloide. Sustancia proteínica amorfa de paredes de los senos esplénicos dando lugar a un bazo "lardáceo". En otros casos la acumulación de amiloide está limitada a los folículos, produciendo un bazo "zagú" con gránulos parecidos a tapioca. Cerdo.

Amiloidosis. Esta es una tinción de Rojo Congo para revelar depósitos de amiloide, que es un material proteináceo que puede almacenarse en células y tejidos. Es una sustancia homogénea, hialina, acidófila, amorfa y extracelula r.

• Etiología: En algunas enfermedades que provocan procesos inflamatorios prolongados como la tuberculosis, artritis reumatoide, osteomelitis crónica, la respuesta de fase aguda provoca una producción excesiva de proteína sérica amiloide con plegamiento Beta , de modo que es irremovible (ya que no hay mecanismo que la remueva). Tambien puede deberse a enfermedades crónicas que desencadenen procesos inflamatorios con producción de pSAA, o tambien se asocia a plasmacitoma con producción exacerbada de cadenas livianas de IgG, IgM e IgD.

•• Macroscópicamente puede observarse de muchas formas. La

Amiloidosis en Riñón puede observarse como puntillado blanco grisáceo evidente sobre la corteza en los glomérulos, conjuntamente con un aumento de tamaño y consistencia. En bazo puede observarse en dos presentaciones, de las cuales una es BAZO SAGÚ (puntitos blancos diseminados por la pulpa blanca) y la otra es BAZO LARDÁCEO (los depósitos siguen los sinusoides y se obtiene un aspecto similar a lapanceta).

•• Microscópicamente Material proteináceo hialino acidófilo de aspecto

uniforme u homogéneo que suele ubicarse en riñón en los glomérulos, en la pared de los vasos y peritubularmente (las células tubulares degeneran) o bien en bazo se ubican en la pulpa blanca, alrededor de las arteriolas centrales (periarterial) donde hay restos de linfocitos. Se diferencia del tejido conectivo porque en este último los núcleos se ubican en forma alargada siguiendo una dirección y un orden, mientras en el amiloide puede haber núcleos dispersos azarosamente en cualquier dirección.

Amiloidosis en Riñón. Aquí encontramos una enfermedad renal crónica que puede incrementar el tamaño del riñón. Esta enfermedad es la amiloidosis. Depósitos pálidos de amiloide se presentan en la corteza, y son más visibles en la imagen al medio del sector superior.

Amiloidosis en Riñón. Los depósitos amorfos color acidófilo pueden encontrarse alrededor de arterias, en el intersticio o en glomérulos. Una tinción de rojo congo puede demostrar el material amiloide que se tiñe rosado.

Amiloidosis glomerular. Deposición amiloide en la zona más interior de la membrana glomerular de la base, teñida de violeta. En algunos lugares hay penetración de la membrana basal en su zona más exterior por pequeñas proyecciones espiculares amiloides. Los túbulos vecinos contienen material proteínico rosado e inclusiones violeta. Perro. Tinción para glucoproteínas.

• Macroscópicamente puede observarse de muchas formas. En riñón puede observarse un puntillado blanco grisáceo evidente sobre la corteza en los glomérulos, conjuntamente con un aumento de tamaño y consistencia.

• Microscópicamente Material proteináceo hialino acidófilo de aspecto uniforme u homogéneo que suele ubicarse en riñón en los glomérulos, en la pared de los vasos y peritubularmente (las células tubulares degeneran).

• El amiloide se diferencia del tejido conectivo porque en este último los núcleos se ubican en forma alargada siguiendo una dirección y un orden, mientras en el amiloide puede haber núcleos dispersos azarosamente en cualquier dirección.

Lipocromo (Lipofucsina) en hígado. El pigmento pardo amarronadointracelular, endógeno y perinuclear (señalado en un hepatocito por la flecha) polímero de lípidos poliinsaturados de membrana provenientes de autofagocitosis, y que al peroxidarse se vuelven indigestibles y no se extraen con alcohol. Se acumulan con el tiempo en células con alto metabolismo y que no se renuevan (particularmente en hígado y corazón, además de cerebro y músculo liso). No posee mayores consecuencias, pero ilustra el resultado final del proceso de autofagocitosis en el cual restos intracelulares son secuestrados y volcados dentro de estos cuerpos residuales de lipocromo.

Esclerótica humana Ictérica. La esclerótica es amarilla porque el paciente tiene ictericia. El color blanco normal de la esclerótica ocular es un buen lugar para buscar ictericia en el exámen clínico.

Hemosiderina en Pulmón - El material pardo-amarronado ubicado en macrófagos alveolares es hemosiderina, que se acumuló como resultado de fagocitosis de glóbulos rojos sanguíneos y liberación del hierro en el grupo Hemo. Los macrófagos barren los restos celulares, los que pueden eventualmente ser reutilizados. Los macrófagos cargados con hemosiderina se denominan "células de la insuficiencia cardíaca"

Hemosiderina en Hígado - Reacción de Azúl de Prusia es utilizada para detección de presencia de Hierro y se observa grandes cantidades de hemosiderina presente en hepatocitos y células de Kupffer.

Bilirrubina en Hepatocitos. El material verde-amarillento o verde-amarronado que puede observarse en pequeños conductos biliares en el hígado en esta imagen es el pigmento Bilirrubina.

• Etiología: Todo trastorno relacionado con la liberación de la Hb de los eritrocitos puede desencadenar el proceso. Por ejemplo, puede darse por hemólisis intravascular, virus de la anemia infecciosa equina, hemorragias, etc.

• Macroscópicamente el tejido es blando, aguachento y pálido. Es de color amarillo-verdoso

• Microscópicamente se observa un pigmento amarronado intra y extracelular. Lobulillos de aspecto uniformes. Tinción amarronada. La vena centrolobulillarestá congestiva, los sinusoides están dilatados cargados de bilis y los hepatocitos pueden tener signos de destrucción por autólisis. Se observan núcleos picnóticos.

• No se observa reacción inflamatoria.

Antracosis - Pulmón. Las líneas blancas que se ven entre los lóbulos de pulmón bajo la superficie pleural son debidas a pigmentos antracóticos.

Aquí el pigmento antracótico se encuentra en macrófagos ubicados en un linfonódulo.

Calcificación Distrófica - Estómago. A la izquierda se observa una arteria con calcificaciones en su pared. Hay tambien depósitos de calcio basófilos en la submucosa. El calcio se deposita preferentemente en tejidos que estén dañados.

Calcificación Metastásica - Pulmón. Se observa en el pulmón de un paciente con hipercalcemia.

TROMBOSIS Y PATOLOGIA VASCULAR

Esta es la trombosis coronaria, una de las complicaciones del aterosclerosis. El trombo rojo oscuro se ve en la arteria coronaria descendente anterior.

Aquí la trombosis coronaria se ve a mayor aumento. El trombo estáocluyendo el lumen y produce isquemia y/o infarto del miocardio.

Esta es la apariencia de un émbolo pulmonar en una rama mayor de la arteria pulmonar.

Este émbolo pulmonar se adhiere a la pared de la arteria pulmonar (como puede ser tambien cualquier otro vaso sanguíneo). Si el paciente sobrevive, el tromboémbolo se organiza y la mayor parte es removido.

La coagulación intravascular diseminada (CID) es una consecuencia de la extensa activación del sistema de la coagulación con lesión endotelial y/o por el desbloqueo de sustancias tromboplásticas en la circulación. CID se puede ver en varias infecciones severas, trauma, neoplasia, y complicaciones obstétricas, entre otros casos. Los trombos pequeños de fibrina se pueden formar en arterias pequeñas del cerebro, corazón, pulmones, riñones, y de otros órganos; y producen daño isquémico en el tejido al cual afectan.

Aneurisma verminoso (arteritis y falso aneurisma)Dilatación aneurísmica sacular de la aorta torácica como consecuencia del debilitamiento de la pared arterial debida a la infección por Strongylus vulgaris. Caballo.

NEOPLASIA

Microscopicamente el adenocarcinoma metastásico se ve aquí en un nodo linfático. Es común para los carcinomas que hagan metástasis a los linfonódulos. Los primeros nodos implicados son ésos que drenan el sitio del primario.

Histiocitoma caninoTumor de células histiocíticas con ligera infiltración linfocítica. Están presentes muchas figuras mitóticas.

Carcinoma de células escamosasFormación de un callo córneo, columnas y racimos de células tumorales no diferenciadas. Se pueden ver "perlas de queratina" centrales rodeadas por epitelio y hacia la periferia por tejido conectivo.