LAPORAN STRUKTUR DAN FUNGSI BIOMOLEKUL KI3161

Percobaan 2

Karakterisasi Protein:

Penentuan Kadar dan Elektroforeis Gel Akrilamid

Nama : Muhammad Hairuddin

NIM : 10513050

Kelompok : 2

Nama Asisten :

Tanggal Percobaan : 29 September 2015

Tanggal Pengumpulan : 1 Oktober 2015

LABORATORIUM BIOKIMIA

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2015

PERCOBAAN 2

KARAKTERISASI PROTEIN:

Penentuan Kadar dan Elektroforesis Gel Akrilamid

I. Tujuan

- Menentukan kadar protein dengan metode Lowry dan Bradford

- Menentukan karakter fisik protein

II. Teori Percobaan

Untuk menentukan kadar suatu protein terdapat beberapa metode yang biasa

digunakan antara lain yaitu metode Biuret, metode Lowry, metode Bradford, dan lain

sebagainya. Masing-masing metode tersebut memiliki kelebihan dan kekurangannya

masing-masing. Terdapat beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam pemilihan

metode yang terbaik dan tepat antara lain yaitu banyaknya material atau sampel yang

tersedia, waktu yang diperlukan untuk melakukan pengukuran, dan ketersediaanya alat

spektrofotometri UV dan VIS.

Penentuan kadar protein dengan metode Lowry adalah suatu metode penentuan

yang menggunakan reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen Folin-Ciocalteu.

Reagen Folin-Ciocalteu ini adalah fosfomolibdat dan fosfotungstat. Metode Lowry ini

adalah modifikasi dari metode Biuret, dimana penambahan reagen Biuret pada metode

Lowry akan meningkatkan sensitivitasnya. Karena kompleks Cu-protein yang dihasilkan

pada metode Biuret akan mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat yang akan

menghasilkan tungsten dan molybdenum yang memberikan warna biru.

Penentuan kadar protein dengan metode Bradford tidak jauh berbeda dengan

metode Lowry yaitu sama-sama sensitif mendeteksi gugus-gugus fenolik seperti tirosin,

dan tiptopan. Namun pada metode Bradford reagen yang digunakan adalah CBBG

(Coomaise Briliant Blue G250). Reagen CBBG bebas memiliki warna merah kecoklatan

dengan Imaks=465 nm, di dalam kondisi basa reagen ini akan berupa anion yang aktif

mengikat protein sehingga menghasilkan warna biru dengan nilai Imaks=595 nm. Jumlah

CBBG yang terikat dengan protein akan proporsional dengan muatan positif yang

ditemukan pada protein.

Elektroforesis merupakan salah satu teknik yang digunakan untuk memisahkan

suatu molekul, dalam hal ini makromolekul didalam media berpori dan bermedan listrik (

bermuatan). Makromolekul yang banyak dipisahkan atau dikarakterisasi dengan teknik ini

adalah protein dan asam nukleat. Pemisahan protein ini menggunakan media akrilamid dan

pemisahan asam nukleat (DNA) dengan menggunakan agarosa. Teknik elektroforesis

poliakrilamid menggunakan sodium dodesil sulfat (SDS). Adanya penambahan SDS akan

menghomogenkan muatan globular atau denaturasi protein dengan muatan negatif dari

SDS sehingga molekul sampel akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif.

Eletroforesis dengan akrilamid mengandung SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-

Poliacrylamid Gel Electrophoresis). Pada SDS-PAGE ini terdapat dua bagian penting yaitu

stacking gel dan separating gel.

III. Data pengamatan

1. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

Konsentrasi (g/L) Absorban (A)

Standar 1 40 0.073

Standar 2 80 0.118

Standar 3 120 0.210

Standar 4 160 0.308

Standar 5 200 0.275

Sampel 1 0.066

Sampel 2 0.1108

Sampel 3 0.427

2. Penentuan kadar protein dengan metode Bradford

Konsentrasi (g/L) Absorban (A)

Standar 1 4 0.218

Standar 2 8 0.290

Standar 3 12 0.357

Standar 4 16 0.474

Standar 5 20 0.493

Sampel 1 0.316

Sampel 2 0.801

Sampel 3 0.840

3. SDS-PAGE

Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3

1.5 0.4 0.6

2.6 0.7 1.7

- 1.5 2.8

- 2 -

- 2.6 -

IV. Pengolahan data

1. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

Persamaan kurva = y= 0.002x-0.022

Dengan y= absorbansi dan x= konsentrasi

Sampel 1:

y= 0.002x-0.022

0.066 = 0.002x-0.022

0.066+0.022=0.002x

0.088=0.002x

x= 44 g/L

dengan cara yang sama untuk sampel 2 dan 3 di dapatkan konsentrasinya masing-

masing adalah 66.4 g/L dan 224.5 g/L

0.07

0.12

0.21

0.31

y = 0.002x - 0.022R = 0.9758

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Ab

sorb

ansi

(A

)

Konsentrasi (g/L)

Kurva Konsentrasi VS Absorbansi

2. Penentuan kadar protein dengan metode Bradford

Persamaan kurva = y= 0.0171x+0.1511

Dengan y= absorbansi dan x= konsentrasi

Sampel 1:

y= 0.0171x+0.1511

0.316 = 0.0171x+0.1511

0.316-0.1511=0.0171x

0.1649=0.0171x

x= 9.643 g/L

dengan cara yang sama untuk sampel 2 dan 3 di dapatkan konsentrasinya masing-

masing adalah 38.005 g/L dan 40.2865 g/L

0.218

0.29

0.357

0.493

y = 0.0171x + 0.1511R = 0.9998

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 5 10 15 20 25

Ab

sorb

ansi

(A

)

Konsentrasi (g/L)

Kurva Konsentrasi VS Absorbansi

V. Pembahasan

VI. Kesimpulan

VII. Daftar pustaka

Colowick, S.P and Kaplan, N.O (1957), Methods in Enzymology, vol. V, Acad. Press

Inc, New York, p. 448-450.

Holme, D.J and Peck, H (1993), Analytical Biochemistry, 2nd Ed., Longman

Scientific and Technical, New York.

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, L.A and Randall, R.J (1951), Protein measurement

with the folin phenol reagent, The Journal of Biological Chemistry, p.265-275.

Alexander, R.R and Griffiths, J.M (1993), Basic Biochemical Methods, 2nd Ed., A John

Wiley & Sons, Inc., New Cork.