LAPORAN PRAKTIKUM

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NAMA : RACHMA SURYA M

NIM : H311 12 267

KELOMPOK : III (TIGA)

HARI/TGL.PERC . : RABU/ 23 APRIL 2014

ASISTEN : AGUSTIANI

LABORATORIUM BIOKIMIAJURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Seperti yang telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga

gugus yang reaktif pada asam amino yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan gugus

rantai samping. Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik, diantaranya

adalah dengan melalui tes ninhydrin, dan sebagainya. Akan tetapi, selain uji spesifik

berdasarkan ciri khas reaksi kimianya, asam amino dapat pula diidentifikasi bahkan

dipisahkan dengan beberapa metode, salah satunya adalah melalui kromatografi lapis

tipis (KLT).

Pemisahan asam amino dengan metode ini didasari oleh kemampuan

suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fasa

stasioner atau yang lazim disebut sebagai fasa diam, dimana bila suatu zat terlarut

yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama dan tidak saling

bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut di dalam kedua pelarut

seimbang.

Pada kromatografi lapis tipis, yang digunakan sebagai fasa stasioner

adalah suatu lembaran tipis silika gel. Untuk memperoleh pemisahan asam amino

yang baik, dapat digunakan dua fase pelarut, dimana setiap jenis asam amino

mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Perbandingan

kecepatan perpindahan komponen dengan permukaan fasa mobile merupakan dasar

untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan. Oleh karena itu

melalui percobaan ini akan dilakukan analisis asam amino dengan menggunakan

metode kromatografi lapis tipis.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1 Maksud Percobaan

Maksud dilakukannya percobaan ini adalah untuk mengetahui cara pemisahan

dan identifikasi asam amino dalam suatu contoh.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah :

1. Menghitung nilai Rf dari beberapa jenis asam amino dan larutan sampel.

2. Mengidentifikasi asam amino dalam larutan sampel berdasarkan nilai Rf nya.

1.3 Prinsip Percobaan

Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan menggunakan

metode kromatrografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari campuran n-butanol,

asam asetat dan air, dan fase diamnya berupa lapisan tipis silika gel.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Asam amino ialah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam

amino terdapat sebagai komponen protein mempunyai gugus –NH2 pada atom karbon

α dari posisi gugus –COOH (Poedjiadi dan Supriyanti, 1994).

Asam amino yang pertama kali ditemukan adalah asparagin, pada tahun 1860

dan yang paling terakhir adalah treonin, yang belum teridentifikasi sampai tahun

1938. Sumber asam amino biasanya memiliki nama umum atau biasa, yang kadang

diturunkan dari sumber pertama-tama molekul ini diisolasi. Semua asam amino yang

ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugud karboksilat dan gugus

amino terikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan

yang lainnya pada gugus rantaoi sampingnya atau gugus R, yang bervariasi dalam

struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutannya dalam air (Lehninger, 1982).

Gambar 2. Rumus umum asam amino

Asam amino adalah senyawa yang mempunyai rumus umum +H3NCH -

(R)COO-, besifat ion dan hidrohfil. Asam-asam amino saling berbeda gugus R-nya.

Ada sekitar 20 macam asam amino penting yang merupakan pembentuk protein dan

disebut asam amino hidrolisat, seperti alanin (Ala), arginin (Arg), sistein (Sis),

glutamin (Gln), asam glutamat (Glu), glisin (Gly), histidin (His), iso leusin (Leu),

lisin (Lys), metionin (Met), fenilalanin (Phe), prolin (Pro), serin (Ser), treonin (Thr),

triptofan (Trp), tirosin (Tyr), dan valin (Val) (Rediatning dan Kartini, 1987).

Asam amino dibagi menjadi dua klasifikasi, yaitu (Devi, 2010) :

1. Asam Amino Esensial

Asam amino esensial tidak dapat diproduksi oleh tubuh sehingga harus ada

dalam diet. Apanila tubuh akan membenyuk jaringan baru, jaringan baru tersebut

hanya terbentuk jika semua asam amino esensial tersedia dalam satu saat yang

bersamaan. Asam amino esensial terdiri dari: alanine, arginine, aspartate, asam

aspartate, sistin, asam glutamate, glutamin, glisin, dan prolin.

2. Asam Amino Nonesensial

Asam amino ini dapat diproduksi dalam tubuh sehingga tidak perlu

dikonsumsi atau tidak perlu tersedia diet. Asam amini nonesensial terdiri atas:

histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilealanin, treonin, triptofan, valin, serin,

dan tirosin.

Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik

menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-

macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas

masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino

tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri,

kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis.Salah satu metode yang

banyak memperoleh pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam

kromatografi ialah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi

penukar ion. Kromatografi kertas, merupakan salah satu jenis kromatografi partisi,

yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaaan kelarutan dalam dua pelarut

yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini

cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan

sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung kertas

dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan proses

kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam

amino yang mudah larut dalam pelarut tetentu ini, misalnya pelarut organik, akan

terbawa naik lebih jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian

atas atau bagian akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan

sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan terpisah satu dengan

lain, dan dengan penyemprotan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut

akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang telah

terpisah itu (Poedjiadi dan Supriyanti, 1994).

Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan

perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat

dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar.

Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase stasioner) dan fase gerak (fase

mobile). Fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fse

diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda.

Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun

semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).

Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik dapat digunakan dua

fase pelarut, misalnya pasangan fenol- air, n-Butanol- air, atau dengan tiga fase

pelarut tersebut dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi, kertas

digunakan sebagai pendukung air. Campuran komponen yang akan dipisahkan

ditempatkan pada fasa stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fase cair,

maka fasse cair akan melalui fase stasioner  sambil membawa komponen tersebut,

dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan kecepatan

permukaan fasa mobile (cair) merupakan dasar untuk mengidentifikasikan komponen

yang dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini disingkat dengan Rf (Rate Of Front)

(Tim Dosen, 2013).

Di tahun 1903 Tswett menemukan teknik kromatografi. Teknik kromatografi

ini digunakan sebagai cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi,

komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam.

Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul

campuran terserap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori

partikel atau terbagi ke dalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau di

dalam pori. Proses ini dikenal sebagai proses absorpsi (penyerapan). Laju

perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu di dalam kolom atau lapisan tipis zat

penyerap secara langsung berhubungan dengan bagian molekul-molekul tersebut di

antara fase bergerak dan fase diam. Jika ada perbedaan penahanan secara selektif,

maka masing-masing komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yang

tergantung pada karakteristik masing-masing penyerapan. Jika pemisahan terjadi,

masing-masing komponen keluar dari kolom pada interval waktu yang berbeda,

mengingat bahwa proses keseluruhannya adalah fenomena migrasi secara diferensial

yang dihasilkan oleh tenaga pendorong tidak selektif berupa aliran fase bergerak

(Khopkar, 2010).

Kromatografi lapis tipis (KLT), teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh

Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak

sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan

terbentuklah kromatogram. Metode dikenal juga sebagai kromatografi kolom

terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan

pemisahannya tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang

terpisahkan (Khopkar, 2010).

BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1. Bahan Percobaan

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah larutan glisin, tirosin,

sampel X, eluen (n-butanol : asam asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v), larutan

penyemprot ninhidrin 2 %, plat KLT, akuades, selotip dan tissue roll.

3.2. Alat Percobaan

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah chamber, pipa kapiler

0,5 mL, gelas ukur 10 mL, botol semprot, pipet tetes, cawan petri, gunting, gegep,

pensil, penggaris, dan oven.

3.3. Prosedur Percobaan

Dibuat larutan eluen dengan menggunakan larutan n-butanol, asam asetat, dan

air dengan perbandingan 2,5 : 6 : 2,6 v/v. Kemudian eluen dimasukkan ke dalam

chamber, dihomogenkan lalu tutup dan tunggu sampai larutan tersebut jenuh. Pada

plat KLT dibuat garis pembatas kurang lebih 1 cm pada bagian atas dan bawah. Plat

KLT kemudian diaktifkan dengan memasukkannya ke dalam oven selama 15 menit.

Larutan sampel X dan standar tirosin dan glisin kemudian ditotolkan pada garis yang

telah dibuat. Plat dimasukkan dalam chamber yang telah jenuh, kemudian ditutup

kembali. Setelah eluen mencapai batas yang telah ditentukan, plat dikeluarkan

kemudian dikeringkan. Setelah plat kering, plat lalu disemprotkan dengan larutan

ninhidrin 2% dan dikeringkan dalam oven. Plat yang telah kering kemudian

dikeluarkan dan diamati noda yang terbentuk. Noda yang timbul dilingkari

menggunakan pensil dan diukur jaraknya. Dari jarak tersebut dapat ditentukan nilai

Rf larutan tersebut.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Tabel 1. Hasil pengamatan jarak noda

Noda Jarak eluen (cm) Jarak noda (cm) Rf (cm)

Sampel X1 5,2 2,35 0,45

Sampel X2 5,2 1,65 0,32

Glisin 5,2 1,8 0,35

Tirosin 5,2 2,4 0,46

4.2. Reaksi

Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dan asam amino :

4.3. Pembahasan

Dari percobaan yang dilakukan, dua larutan standar akan digunakan sebagai

pembanding larutan sampel X yang ingin diketahui. Ketiga larutan tersebut

ditotolkan pada plat KLT. Pada saat elusi terjadi, baik larutan sampel maupun larutan

standar tidak dapat terlihat. Larutan ninhidrinlah yang berfungsi untuk pemberian

warna. Adapun tujuan pengeringan plat supaya larutan dapat dideteksi dan

menguapkan pelarut yang tidak diinginkan.

Larutan eluen yang digunakan terbuat dari campuran n-butanol, asam asetat

dan air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Pemilihan ketiga pelarut ini

didasarkan pada perbedaan kepolaran dari ketiga pelarut tersebut, dengan urutan

kepolaran air >n-butanol > asam asetat. Setiap asam amino mempunyai koefisien

partisi tertentu. Hal inilah yang akan mempengaruhi kecepatan reaksi suatu larutan.

Eluen dimasukkan ke dalam chamber dan dibiarkan beberapa saat hingga eluen jenuh

dan uapnya memenuhi chamber

Saat plat dimasukkan ke dalam chamber, larutan harus telah berada dalam

keadaan jenuh. Hal ini dimaksudkan agar proses pengelusian dapat berjalan dengan

lancar dan cepat dan untuk mencegah penguapan eluen. Lalu pada saat dimasukkan,

noda tidak boleh ikut terendam dengan fase gerak karena jika ikut terendam maka

noda akan bergerak ke arah bawah, bukannya ke atas. Tujuan plat KLT dikeringkan,

supaya noda yang timbul tidak melebar dan mempersulit perhitungan Rf.

Setelah plat disemprot dengan ninhidrin dan dikeringkan, didapatkan 2 noda

dengan warna berbeda yaitu ungu dan orange. Dari hasil tabel 1, dapat dilihat bahwa

nilai Rf sampel X mendekati nilai Rf tirosin dan glisin, yang berarti sampel terdiri

atas campuran glisin dan tirosin. Sewaktu diperoleh sampel X, salah satu noda

sampel terdapat ekor. Hal ini dapat terjadi karena pada saat penotolan mungkin saja

terjadi beberapa keselahan. Untuk mencegah hal ini terjadi, pada saat penotolan zat

tersebut harus ditotolkan secukupnya pada garis batas.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan:

1. Nilai Rf asam amino glisin adalah 0,35, asam amino tirosin 0,46, asam amino

serta sampel X adalah 0,32 dan 0,45.

2. Berdasarkan nilai Rf, larutan sampel X memiliki jarak tempuh noda yang

mendekati larutan asam amino tirosin dan glisin.

5.2 Saran

5.2.2 Saran untuk Laboratorium

Saya menyarankan kepada pihak laboratorium supaya dapat mengecek

barang-barang yang memang sudah tidak layak pakai lagi.

5.2.1 Saran untuk Percobaan

Saya menyarankan agar dapat disediakan jenis-jenis asam amino lain,

sehingga kita mempunyai lebih banyak contoh perbandingan .

5.2.3 Saran untuk Asisten

Saya menyarankan kepada kakak asisten agar bisa lebih mengawasi

praktikannya.

DAFTAR PUSTAKA

Devi, N., 2010, Nutrition and Food, Kompas, Jakarta.

Khopkar, S.M., 2010, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.

Lehninger, A.L., 1982, Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1, Erlangga, Jakarta.

Poedjiadi, A., dan Supriyanti F.M.T., 2005, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta.

Rediatning, W.S., dan Kartini, N.H., 1987, Analisis Asam Amino Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Secara Derivatisasi Prakolom dan Pascakolom, Proceesings ITB, 20 (1): 41-59.

Tim Dosen Biokimia, 2013, Penuntun Praktikum BiokimiaLaboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar.

LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 28 April 2014

Asisten Praktikan

AGUSTIANI RACHMA SURYA M

Lampiran 1. Bagan Kerja

- Digunting dan diberi tanda

- Dikeringkan dalam oven untuk mengaktifkan lapisan tipis

- Ditotolkan larutan contoh dan sampel

- Dikeringkan

- Dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen (n-butanol : asam

asetat : air = 2,5 ml : 0,6 ml : 2,6 ml) yang telah jenuh.

- Dielusi sampai tanda batas yang telah ditentukan

- Dikeluarkan dari chember dan dikeringkan

- Disemprot dengan larutan ninhidrin 0,1 %

- Dikeringkan dalam oven selama beberapa menit pada suhu 60 oC.

- Ditandai dengan diberi lingkaran dengan menggunakan pensil

- Diukur jarak noda dari tempat penotolan

- Diukur jarak tempuh eluen

- Dihitung nilai Rf-nya

-

Noda

Data

Plat KLT

Lampiran 2. Perhitungan nilai Rf

R f=Jarak tempuh sampelJarak tempuh eluen

a. Glisin

R f=1,8 cm5,2 cm

=0 ,35

b. Tirosin

R f=2,4 cm5,2 cm

=0 ,46

c. Sampel

R f 1=2,35 cm5,2 cm

=0 ,45

R f 2=1,65 cm5,2 cm

=0 ,32

Lampiran 3. Daftar nilai Rf 20 asam amino

Sumber : http://www.biotopics.co.uk/as/amino_acid_chromatography.html

Amino acid Rf value

alanine 0.38

arginine 0.20

asparagine 0.5

aspartic acid 0.24

cysteine 0.4

glutamine 0.13

glutamic acid 0.30

glycine 0.26

histidine 0.11

isoleucine 0.72

leucine 0.73

lysine 0.14

methionine 0.55

phenylalanine 0.68

prolinenot a true amino acid - shows up as yellow

0.43

serine 0.27

threonine 0.35

tryptophan 0.66

tyrosine 0.45

valine 0.61

Lampiran 4. Foto Percobaan

Gambar 1. Noda Pada KLT