Carolina Hendra PM (141710101014)

PERHITUNGAN DAN PENGGORESAN MIKROBAI. Perhitungan MikrobaMacam metode perhitungan koloni menurut Schelgel (1994), adalah :

1. Metode langsung adalah metode di mana massa agar ditentukan sesudah sel -selnya diendapkan oleh sentrifuse.

2. Metode tidak langsung adalah metode yang didasari penentuan intensif kekeruhan suspensi sel dan dapat digunakan untuk menetapkan massa. Isolasi mikroba adalah memisahkan mikroba dengan mikroba lain untuk diidentifikasi jenisnya. Tujuan isolasi adalah untuk mendapatkan biakan murni. Metode yang digunakan untuk melakukan isolasi adalah metode cawan gores dan metode cawan tuang.

Begitu pula menurut Jutono, dkk (1980) ada 2 cara perhitungan jumlah mikrobia yaitu perhitungan secara langsung (direct method) dan secara tidak lengsung (indirect method).A. Perhitungan mikroba secara langsungPerhitungan jumlah mikrobia secara langsung, dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa cara perhitungan antara lain:1. Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikrospis

Pada cara ini mula-mula dibuat preparat mikroskopik pada gelas benda, suspensi bahan atau biakan mikrobia yang telah diketahui vulumenya diratakan di atas gelas benda pada suatu luas tertentu setelah itu preparat dicat dan dihitung jumlah rata-rata sel tiap petak atau tiap bidang pemandangan mikroskop. Luas bidang pemandangan mikroskop dihitung dengan mengukur garis tengahnya. Jadi jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda seluruhnya dapat dihitung, sehingga dapat diperoleh jumlah mikrobia tiap cc bahan atau cairan yang diperiksa (Jutono dkk, 1980).

2. menggunakan counting chamberPerhitungan ini dapat menggunakan haemacytometer, Petroff-Hausser Bacteria Counter, dan alat-alat lainnya yang sejenis. Dasar perhitungannya ialah dengan menempatkan 1 tetes suspensi bahan atau biakan mikrobia pada alat tersebut, ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati dengan mikroskop dengan perbesaran sesuai besar kecilnya mikrobia. Dengan menentukan jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya dan alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikrobia tiap cc (Jutono dkk, 1980).

Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan denganpertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1mm2 terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besarterdiri dari 16 kotak kecil. Alat haemocytometer digunakan di bawah mikroskop,sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm. Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai0,2 mm. Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah sel per mL sampel dapat dihitungsebagai berikut:

1. Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak

2. Jumlah sel per mm3 sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar (1/0,02)3. Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm3sampel 103 = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak (1/0.02)x 10^34. Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak 50 103Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, makajumlah sel per ml sampel adalah: 12 1,25 106= 1,5 107Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitungterdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagimenjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagimenjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotakkecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akanmemenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volumedapat diketahui.Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapatmenghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yangdigunakan. Misalnya. Bila pewarna trypan blue dicampurkan kedalam larutan selmaka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru.Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasihomogenitas dan data mendeteksi.

Pada metode ini digunakan membran filter yang berfungsi untuk menyaring sel mikroba yang terdapat pada sampel. Sampel dilewatkan pada membran filter polycarbonate berwarna hitam (digunakan warna hitam untuk memudahkan pengamatan sel menggunakan sinar fluorosence). Selanjutnya sel mikroba diwarnai dengan bahan warna fluorosence seperti acridine orange dan diamati dibawah mikroskop. Arcidine orange akan mewarnai mikroba dan memancarkan cahaya kuning atau hijau sehingga sangat mudah untuk dihitung dengan menggunakan mikroskop fluorosence.

Suspensi bahan mula-mula disaring sejumlah volume tertentu kemudian disaring dengan filter membrane yang telah disterilkan terlebih dahulu. Dengan menghitung jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran dapat dihitung jumlah sel dari volume suspensi yang disaring (Jutono dkk, 1980).Beberapa kerugian perhitungan jumlah mikroba secara langsung :

a. sel yang mati tidak dapat dibedakan dengan sel yang hidup

b. sel-sel ukuran kecil sangat sulirt untuk dilihat dan mungkin terlompati dalam menghitung srhingga memberi perhitungan dibawah jumlah sebenarnya.

c. Kurang peka, karena jumlah suspensi contoh harus paling sedikit mengandung 106 sel/ml sebelum setuiap sel dapat dilihat dalam suatu ruang pandang mikroskop yang berarti bahwa larutan yang berisi kurang dari 106 sel/mlntidak dapat dihitung.d. Kecepatan yang tinggi sukar diperoleh

e. Pemeriksaan mikroskop yang terus menerus menjemukan.

f. Suspensi contoh harus bebas dari zat-zat partikulat lain karena hal ini dapat mrnutupi sl pada saat dihitung.

B. Perhitungan Secara Tidak Langsung

Perhitungan mikrobia secara tidak langsung, dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup atau hanya menentukan jumlah mikrobia yang hidup saja. Untuk menentukan jumlah mikrobia yang hidup dapat dilakukan setelah suspensi bahan atau biakan mikrobia diencerkan beberapa kali dan ditumbuhkan dalam medium dengan cara tertentu tergantung dari macamnya bahan dan sifat mikrobianya (Jutono dkk, 1991).

1. Menggunakan sentrifuge

Caranya ialah 10 cc biakan cair mikrobia disentrifuge dengan menggunakan sentrifuge yang biasa digunakan untuk menentukan jumlah butir-butir darah. Kecapatan dan waktu sentrifugasi harus diperhatikan. Setelah ditentukan volume mikrobia keseluruhan maka dapat dipakai untuk menentukan jumlah sel-sel mikrobia tiap cc, yaitu dengan membagi volume mikrobia keseluruhan dengan volume rata-rata tiap sel mikrobia (Suriawiria, 1985).

2. Berdasarkan kekeruhan

Dasar penentuan cara ini adalah jika seberkas sinar dilakukan pada suatu suspensi mikrobia maka makin pekat (keruh) suspensi tersebut, makin besar intensitas sinar yang diabsorbsi sehingga intensitas sinar yang diteruskan makin kecil (Jutono dkk, 1980). Untuk perhitungan jumlah bakteri berdasarkan kekeruhan digunakan alat-alat seperti photoelectric turbidimeter electrophotometer, spectrophotometer, nephelometer, dan alat-alat lain yang sejenis. Alat-alat ini menggunakan sinar monokromatik dengan panjang gelombang tertentu (Dwijoseputro, 1990).

3. Menggunakan perhitungan elektronik (electronic counter)

Alat ini dapat untuk menentukan beribu-ribu sel tiap detik secaa tepat. Prinsip kerjanya alat ini adanya gangguan-gangguan pada aliran ion-ion yang bergerak diantara 2 elektroda. Penyumbatan sementara oleh sel mikrobia pada pori sekat yang terdapat diantara kedua elektroda sehingga terputusnya aliran listrik. Jumlah pemutusan aliran tiap satuan waktu dihubungkan dengan kecepatan aliran cairan yang mengandung mikrobia adalah ukuran jumlah mikrobia dalam cairan tersebut.

4. Berdasarkan analisa kimia

Cara ini didasarkan atas hasil analisa kimia sel-sel mikrobia. Makin banyak sel-sel mikrobia, makin besar hasil analisa kimianya secara kuantitatif.

5. Berdasarkan berat kering

Terutama digunakan untuk penentuan jumlah jamur benang, misalnya dalam industri mikrobiologi. Kenaikkan berat kering suatu mikrobia diiringi dengan kenaikkan sintesa dan volume sel-sel dapat menentukan jumlah mikrobia

6. Menggunakan cara pengenceran

Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia yang hidup saja. Dasar perhitungannya ialah mengencerkan sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikrobia secara bertingkat.

7. Menggunakan cara Most Probable Number (MPN)

Metode ini dilakukan pengenceran dengan beberapa kali ulangan, secara matematik hasilnya dapat untuk menentukan kemungkinan besar jumlah mikrobia yang terdapat dalam suspense.

Dalam metode MPN, pengenceran sampel harus lebih tinggi dari pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinkubasi dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan yang lain tidak mengandung sel sama sekali. Dengan demikian, setelah diinkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positif. Sedangkan tabung lainnya negatif (Dwidjoseputro, 2005). Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari 3 seri tabung berbeda dengan tabel untuk 5 seri tabung, kombinasi yang diambil terdiri dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif. Sedangkan pada pengenceran yang berikutnya ada tabung yang negatif, kombinasi yang diambil terdiri dari 3 pengenceran (Dwidjoseputro, 2005).Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1 : 10 dari sampel tersebut. Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan (Dwidjoseputro, 2005).Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masing-masing dimasukan 1 ml kedalam tabung reaksi yang berisi medium, dimana untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif. Kriteria tabung positif atau tidak ditandai dengan timbulnya kekeruhan atau gas pada tabung durham. Misalnya, pada pengenceran pertama 3 tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran kedua tabung positif. Pada pengenceran ketiga 1 tabung positif, dan pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positif, kombinasi menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil 3 pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kommbinasiini kemudian dicocokan dengan tabel MPN, kemudian nilai MPN sampel dapat dihitung (Dwidjoseputro, 2005).Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari 3 seri tabung berbeda dengan tabel untuk 5 seri tabung berbeda dengan tabel untuk 5 seri tabung. Kombinasi dipilih dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung gas yang negatif, kombinasi yang diambil dari 3 pengenceran. Jika pada pengenceran yang keempat dan seterusnya masih ditemukan tabung yang positif tersebut ditambahkan pada angka kombinasi ketiga mencapai jumlah maksimum. Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba tertentu yang terdapat diantara campuran campuran mikroba lain. Misalnya, jika digunakan medium kaldu laktosa, ditunjukan dengan terbentuknya gas dalam tabung durham. Cara ini dapat digunakan untuk menentukan MPN kelompok bakteri koliform, termasuk juga bakteri-bakteri yang dapat memfermentasikan laktosa (Dwidjoseputro, 2005).Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas atau sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semakin besar jumlah sampel yang di masukan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin rendah tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif yang dihasilkan sangat memepengaruhi metode ini. Frekuensi positif atau negatif ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan. Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah. 1) bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel, 2) sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk ecoli terpisah sempurna tiap selnya dan termasuk rantai, 3) media yang dipilih telah sesuai dengan untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal 1 sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut, 4) jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup. Sel yang terkena dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak terdeteksi (Hadioetomo, 1990). 8. Berdasarkan jumlah koloni (Plate count)

Cara ini yang paling umum digunakan untuk perhitungan jumlah mikrobia. Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan dengan kelipatan 10 (Jutono dkk, 1980). Menurut Jutono (1980), tidak semua jumlah bakteri dapat dihitung. Ada beberapa syarat perhitungan yang harus dipenuhi, yaitu :

1. Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.

2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader.

3. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang bertururt-turut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya dirata-rata, tetapi jika lebih besar dari 2 yang dipakai jumlah mikrobia dari hasil pengenceran sebelumnya.

4. Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata.

Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini seringkali digunakan pengenceran. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebih dahulu dikocok dengan baik sehingga kelompok sel dapat terpisah. Pengenceran sel dapat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah mikroorganisme yang benar. Namun pengenceran yang terlalu tinggi akan menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya relatif rendah (Hadioetomo, 1990).

Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Dimana jumlah terbaik adalah antara 30 sampai 300 sel mikrobia per ml, per gr, atau per cm permukaan (Fardiaz, 1992). Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit sedikit jumlah mikrobia, dimana suatu saat didapat hanya satu mikrobia pada satu tabung. Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikrobia maksimal yang dapat dihitung, optimal setelah masa tersebut yaitu akhir inkubasi. Selama masa inkubasi, sel yang masih hidup akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata (Waluyo, 2004).

Berikut merupakan contoh data yang diperolrh dari suatu pengamatan :Tabel 1. Hasil Perhitungan Bakteri secara Langsung

Suspensi bakteriFaktor pengenceranJumlah bakteri

Tanah10-44,25 x 109

Susu10-39,95 x 1011

Tabel 2. Perhitungan Jumlah Bakteri Tanah secara Tidak Langsung

PengenceranKoloni bakteriRata-rataJumlah bakteriKeterangan

AB

10-3SpreaderSpreader--

10-436Spreader36 x 10-436 x 104Warna : kuning, putih

Bentuk koloni : irreguler, sirkuler, curled, toruloid

10-556666 x 10-5Warna : putih susu

Bentuk koloni : sirkuler, rhizoid, amoeboid, irreguler

10-680 30080 x 10-6Warna : krem

Bentuk koloid : sirkuler

Tabel 3. Perhitungan Jumlah Bakteri Susu secara Tidak Langsung

PengenceranKoloni bakteriRata-rataJumlah bakteriKeterangan

AB

10-356Spreader56 x 10-356 x 103Warna : putih susu & krem

Bentuk koloni : rhizoid, irreguler, myceloid

10-476Spreader76 x 10-4Warna : putih susu

Bentuk koloni : sirkulair

10-511Spreader-Warna : putih susu

Bentuk koloni : circular

10-610710107 x 10-6Warna : krem

Bentuk koloid : circular & rhizoid

Perhitungan jumlah bakteri secara langsung digunakan rumus jumlah rata-rata bakteri dihitung dengan hand counter atau koloni counter, angka 25 diperoleh dari banyaknya petak dalam hemositometer yakni perkalian antara panjang dan lebarnya 5 x 5, sedangkan untuk faktor pengenceran adalah merupakan pengenceran yang digunakan saat percobaan. Pada perhitungan bakteri secara langsung menggunakan pengenceran bakteri 10-3 untuk bakteri susu atau 10-4 untuk bakteri tanah karena dalam pengenceran tersebut bakteri yang ada dalam medium dapat dihitung, populasinya tidak padat dan juga tidak sedikit. Populasi bakteri yang padat dapat mempersulit perhitungan karena bakteri yang ada tumpang tindih dan polulasi yang sedikit kurang mewakili jumlah bakteri yang ada secara keseluruhan. Jadi pengenceran tersebut antara suspensi yang diambil dari pengenceran terdahulu untuk diencerkan kembali, jumlah bakteri yang ada lebih memencar satu sama lain dan mudah dihitung. Bakteri susu dengan pengenceran 10-3 setelah penghitungan didapat hasil 9,95 x 1011 mm3 dan untuk bakteri tanah dengan pengenceran 10-4 dengan penghitungan didapat hasil 4,25 x 109 mm3.

Perhitungan jumlah bakteri secara langsung memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihannya, adalah waktunya yang digunakan singkat, penghitungannya lebih mudah, tidak membutuhkan bahan yang banyak. Sedangkan kekurangannya adalah tidak dapat membedakan sel hidup dan mati dan sel yang berukuran kecil sulit dilihat dengan mikroskop.

Beberapa syarat perhitungan dengan menggunakan metode ini adalah :

1. Tidak ada spreader.

2. Jumlah koloni mulai dari 30-300.

3. Perbandingan jumlah bakteri antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran yang lebih kecil :

Jika 2, hasil perhitungan dirata-rata.

Jika > 2, dipakai hasil pengenceran yang sebelumnya.Perhitungan jumlah bakteri secara langsung maupun secara tidak langsung dipengaruhi oleh beberapa faktor, yakni :

1. Faktor pengenceran, semakin tinggi pengenceran suatu suspensi maka akan semakin sedikit jumlah bakteri yang dikandung atau tidak ada sama sekali

2. Temperatur dan pH, berkaitan dengan pertumbuhan bakteri pada suhu dan pH optimum

3. Komposisi medium, medium yang digunakan untuk penanaman harus sesuai dengan bakteri yang akan dihitung

4. Segi teknis yaitu Alat yang digunakan dan tingkat ketelitian dalam penghitunganII. Goresan Mikroba

Ada beberapa metode untuk mengisolalsi bakteri antara lain metode gores, metode tuang dan sebagainya. Salah satu yang paling sering digunakan yaitu metode gores. Metode ini didasarkan pada prinsip yaitu mengencerkan mikroorganisme sedemikian rupa sehingga individu spesies satu yang lainnya dapat dipisahkan. Menurut Nuniek (2001) isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu cara penggoresan dan penaburan. Ada beberapa teknik goresan antara lain :1. Goresan T

Untuk mendapat goresan T, ada beberapa langkah yang harus diikuti antara lain:

a. Lempengan dibagi menjadi tiga bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan Petri.b. Inokulasi daerah I dengan sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.c. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali.

d. Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan terus goreskan di daerah IIe. Pijarkan kembali ose dan dinginkan kembali.

f. Prosedur diatas diulang lagi untuk daerah III.2. Goresan Kuadran

Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4 seperti yang terlihat pada gambar.

3. Goresan Radian

Berikut merupakan cara-cara untuk melakukan goresan radian antara lain:

a. Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.

b. Pijarkan ose dan dinginkan kembali.

c. Putar lempengan agar 90o dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan.

d. Pijarkan ose. 4. Goresan SinambungBerikut merupakan cara-cara untuk melakukan goresan sinambung antara lain :

a. Ambil satu mata ose suspense dan goreskan setengah permukaan lempengan agar

b. Jangan pijarkan ose putar lempengan 180o , gunakan sisi mata ose yang sama lalu gores pada sisa permukaan lempeng agar.

Nuniek,2001.

DAFTAR PUSTAKAJutono, Soedono, S., S. Hartanti, Suhandi, D. S., K. Soesanto. 1980. Analisis PraktikumMikrobiologi Umum untuk Perguruan Tinggi. UGM Press, Yogyakarta.Schlegel, H. G. (1994). Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.

Hadioetomo, R. 1990. Mikrobiologi Dasar-Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.Fardiaz, S. 1992. Mikirobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Dwidjoseputro. D.2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Dwidjoseputro, D. 1990. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta

Suriawiria, U. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Penerbit Angkasa. Bandung.

Nuniek,T.2001.Diktat kuliah MikrobiologiIndustri. Teknik Kimia FTI-ITS :Surabaya.