0097: Edy Giri R.P. dkk. KO-121

APLIKASI TEKNOLOGI HAMBURAN NEUTRON SUDUT KECIL (SANS)UNTUK INVESTIGASI ULTRASTRUKTUR DAN MEKANISME

SELF-ASSEMBLY VIRUS DEMAM BERDARAH SEBAGAI DASARPENGEMBANGAN TARGET OBAT DAN VAKSIN

Edy Giri Rachman Putra∗, Bharoto, Eddy Santoso, Nadi Suparno, dan Sairun

Bidang Spektrometri Neutron, Pusat Teknologi Bahan Industri Nuklir - BATANGedung 40 BATAN, Kawasan Puspiptek Serpong, Tangerang 15314

Telepon (021) 7566727, 7560922

∗e-Mail: giri@batan.go.id

Disajikan 29-30 Nop 2012

ABSTRAK

Peningkatan performa spektrometer hamburan sudut kecil (SANS) BATAN khususnya metode eksperimen SANS telahdilakukan dengan mengimplementasikan sistem kontrol baru pada sistem pengendali utama dan data akuisisi. Hal tersebutmemungkinkan untuk melakukan perubahan konfigurasi alat pada spektrometer SANS secara simultan dan otomatis sehinggametode eksperimen SANS dapat dilakukan dengan efisien. Sistem data akuisisi juga telah dikembangkan sejalan dengan imple-mentasi automatic sample changer yang mampu mengakomodasi 12 sampel (temperatur ruang) dan 6 sampel (variasi temper-atur) sehingga pengambilan data eksperimen dapat dilakukan secara otomatis. Hal tersebut memungkinkan untuk melakukaneksperimen SANS secara in-situ (5∼100 ◦C) dan real time, khususnya untuk percobaan menggunakan sampel biologi, sepertivirus. Optimalisasi metode eksperimen SANS telah dilakukan dan di samping itu sistem stopped-flow cell sedang telah puladidesain dan dikembangkan dalam memahami kinetika atau mekanisme dinamika sampel protein virus dan virus like particlemenggunakan spektrometer SANS BATAN.

Kata Kunci: Nuklir, hamburan neutron, spektrometer, virus, struktur biomakro-molekular

I. PENDAHULUANTeknologi nuklir, di mana salah satunya adalah

teknik hamburan neutron pada sudut kecil (SANS)merupakan metode baru yang mampu memetakan danmemberikan informasi struktur dan dinamika secara3-dimensi bentuk, ukuran, dan orientasi suatu inho-mogenitas dalam skala nanometer, yaitu 1 ∼ 500nm.[1–3] Perkembangan di dunia saat ini, SANS telahdigunakan untuk investigasi struktur dan dinamika bi-ologi makromolekul, seperti protein (struktur tersiermaupun kuarterner), domain protein, DNA, virus danlainnya, di lingkungan yang mendekati kondisi fisi-ologisnya dalam larutan.[4–7] Teknik lain yang se-lama ini digunakan, seperti kristalografi protein dengandifraksi sinar-X (XRD), resonansi magnetik inti (NMR)dan mikroskopi elektron (SEM/TEM) memiliki keter-batasan dalam memberikan detail informasi strukturalami (native structure) biologi makromolekul dan in-teraksinya, khususnya di dalam larutan.

Mengingat fasilitas penelitian BATAN di Puspiptek

Serpong memiliki spektrometer SANS dengan panjangtotal 36 meter yang memanfaatkan berkas neutron ter-mal dari Reaktor Serba Guna G.A. Siwabessy (RSG-GAS), memberikan peluang untuk melakukan karak-terisasi struktur dan dinamika biologi makromolekul.Berdasarkan keunggulan yang dimiliki neutron diban-ding sinar-X atau elektron, SANS BATAN telah di-manfaatkan pula untuk studi konformasi globular pro-tein[8] dalam larutan (diameter ∼5 nm) sebagai bagianpenelitian yang didanai dari the Academy of Sciencefor the Developing World (TWAS)[9] dan virus demamberdarah (diameter ∼60 nm).[10] Kedua kegiatan terse-but dilakukan sebagai langkah awal aplikasi teknologihamburan neutron untuk penelitian biologi molekulardi Indonesia.

Untuk mencapai kegiatan tersebut, serangkaian ke-giatan pendahuluan yang meliputi pengembangan per-forma spektrometer SANS BATAN, serta optimalisas-inya dilakukan secara bertahap. Demikian pula denganpenggunaan virusnya, yang dimulai dengan karakter-

Prosiding InSINas 2012

KO-122 0097: Edy Giri R.P. dkk.

isasi protein virus, virus like particle dan virus dengue.Secara garis besar kegiatan ini dilakukan adalah me-ningkatkan performa spektrometer SANS BATAN un-tuk dapat diaplikasikan dalam menginvestigasi sam-pel biologi makromolekul seperti protein, virus dalamlarutan; Mendapatkan metodologi eksperimen SANSyang efektif dan efisien karena dapat dilakukan secaraotomatis dan simultan serta optimum untuk investigasiultrastruktur virus; Penguasaan teknik dan analisis datasecara maksimal untuk simulasi dan modeling strukturbiologi makromolekul dalam larutan berdasarkan datahamburan neutron (eksperimen SANS).

Tinjauan PustakaPenelitian biologi seperti protein dan virus meng-

gunakan teknik nuklir, khususnya hamburan neutrontidaklah mudah, mengingat kompleksitasnya strukturpada portein dan virus tersebut. Di samping itu, per-forma alat juga sangat menentukan kualitas data yangdihasilkan agar dapat dianalisis lebih lanjut. Untukitu, pengembangan atau peningkatan performa alat danmetodologi percobaan menjadi hal yang sangat pen-ting. Spektrometer SANS BATAN yang ada di Serpongtelah mulai direvitalisasi secara bertahap untuk menca-pai performa yang maksimum dalam beberapa tahunterakhir.

Namun demikian, dengan tidak adanya fasilitassumber neutron dingin (cold neutron source) di RSG-GAS serta daya operasi reguler rata-rata hanya 15 MWsetengah dari daya maksimumnya, maka berdasarkankurva distribusi Maxwellian, intensitas neutron yangmemiliki panjang gelombang besar atau berenergi ren-dah, menjadi sangat rendah hingga beberapa orde.Hal ini sangat tidak menguntungkan untuk melakukanpenelitian bahan, khususnya biologi makromolekul de-ngan teknik SANS yang membutuhkan resolusi datahamburan dan intensitas neutron yang tinggi. Di sam-ping itu metode absolut pengukuran intensitas ham-buran juga harus dilakukan dengan mengembangkansistem data akuisisinya. Hal ini juga akan terkait de-ngan pengembangan sistem kendali utama spektrome-ter SANS agar dapat bekerja secara otomatis dan simul-tan.

Dengan memahami dualisme sifat neutron sebagaipartikel dan gelombang, maka telah dikembangkanfocusing SANS di beberapa fasilitas SANS di duniamenggunakan sistem lensa optik ataupun ekternalmedan magnetik.[11–13] Pengembangan focusing SANSini adalah untuk meningkatkan kualitas atau resolusiSANS konvensional (pinhole system) serta intensitasatau fluks neutron pada vektor hamburan minimumyang dapat dicapai.[4] Desain dari sistem focusingSANS sangat spesifik untuk setiap fasilitas spektrom-eter SANS, serta performa yang ingin dicapai. Untukitu, perlu dilakukan penelitian untuk pengembangkan

instrumen atau spektrometer SANS BATAN denganmendesain dan mengiplementasikan sistem devais fo-cusing.

Peningkatan performa spektrometer SANS BATANyang meliputi peningkatan intensitas neutron, opti-malisasi konfigurasi peralatan, resolusi data hambu-ran, metodologi eksperimen, serta reduksi dan analisisdata SANS merupakan faktor penting dalam penelitiantahun pertama ini, sebelum digunakan untuk investi-gasi ultrastruktur dan mekanisme self-assembly virus.

II. METODOLOGIOptimalisasi konfigurasi peralatan SANS serta

metodologi eksperimen dilakukan dengan menggantisistem pengendali/kontrol utama spektrometer yangdapat bekerja secara simultan dan otomatis berbasisprogrammable motor controller PCI (Peripheral Com-ponent Interconnect) serta akuisisi data berdasarkanjumlah neutron datang (preset count). Kegiatan inimeliputi desain, pembuatan, implementasi dan pengu-jian sistem antar-muka baru berbasis programmablemotor controller PCI untuk mengendalikan 18 motorpenggerak pada spektrometer SANS, sehingga dapatdilakukan secara otomatis dan simultan.

Optimalisasi percobaan secara in-situ dan real-timeyang dapat dilakukan secara otomatis dan simultan de-ngan automatic sample changer sehingga eksperimendapat dilakukan secara efisien dan efektif. Kegiatan inimeliputi implementasi, pengujian serta optimalisasi au-tomatic sample changer untuk eksperimen yang dila-kukan secara otomatis dan simultan pada kondisi ling-kungan yang berbeda, yaitu 12 buah sampel (temper-atur ruang) atau 6 buah sampel (variasi temperatur).

Karakterisasi ultrastruktur virus DBD denganmetode variasi kontras yang didahului dengan ke-giatan produksi, uji aktivitas, dan pemurnian virusserta elektroforesis. Kegiatan karakterisasi ini dimu-lai dengan karakterisasi protein virus tunggal yangidentik dengan virus DBD, kemudian dilanjutkandengan protein-ion metal untuk menguji metodevariasi kontras. Karakterisasi dilanjutkan pada viruslike particle (VLP) sebelum menggunakan virus DBDyang sebenarnya pada temperatur rendah, sekitar 5 ◦C.Dengan demikian, sebelum dilakukan karakterisasivirus DBD, metode eksperimen untuk karakterisasivirus telah optimal.

Analisis data serta pendalaman simulasi moleku-lar dinamik dan data analisis ab initio refinement un-tuk menghasilkan fungsi distribusi pasangan (pair dis-tribution function) dalam mengkonstruksi struktur 3-dimensi protein dalam larutan.

III. HASIL DAN PEMBAHASANPerangkat keras dan lunak untuk sistem automatic

sample changer telah diimplementasikan dan diopti-

Prosiding InSINas 2012

0097: Edy Giri R.P. dkk. KO-123

malisasi, sehingga eksperimen SANS dapat dilakukansecara otomatis dengan mode in-situ dan real-time padabeberapa variasi temperatur. Pengembangan ini meru-pakan kelanjutan dari program pengembangan spek-trometer SANS BATAN sebelumnya dengan menggantisistem kendali utama dan juga sistem data akuisisi.

Perangkat keras (hardware) dan lunak (software) un-tuk sistem automatic sample changer ditunjukkan padaGAMBAR 1 dan GAMBAR 2. Pada saat ini spektrome-ter SANS mampu untuk melakukan eksperimen secaraotomatis menggunakan 12 sampel untuk kondisi tem-peratur ruang dan 6 sampel untuk eksperimen sebagaifungsi temperatur.

GAMBAR 1: Implementasi dan optimalisasi perangkat keras(hardware) automatic sample changer untuk 6 buah sampel de-ngan variasi temperatur (5∼100 ◦C) yang diintegrasikan denganheating/cooling-circulated oil system

Untuk pengujian implementasi sistem samplechanger dengan variasi temperatur, telah dilakukaneksperimen menggunakan sampel sistem koloidyang ditunjukkan pada GAMBAR 3. Dari GAMBAR 3dapat ditunjukkan perubahan nanostruktur sertainteraksinya larutan misel CTAB (Cetyltrimethylam-monium bromide) dengan konsentrasi 0,1 M sebagaifungsi temperatur.

Protein virus dengan struktur sama dengan virusDBD, dengan ukuran diameter lebih kecil dari virusDBD digunakan sebagai karakterisasi awal. Proteinini memiliki 2 buah struktur, yaitu core-shell struc-ture and hollow-sphere structure yang akan dikarakter-isasi dengan menerapkan metode variasi kontras seba-gai fungsi dari kondisi larutan, pH. Virus like particle(VLP) dari HPV, akan dicobakan dengan menerapkanmetode variasi kontras untuk memetakan secara detailbagian demi bagian yang ada pada virus tersebut. Se-mua eksperimen dilakukan pada temperatur rendah,sekitar 5 ◦C untuk menjaga struktur protein atau virus

GAMBAR 2: Pengembangan perangkat lunak (software) data akui-sisi pada sepektrometer SANS yang diintegrasikan dengan auto-matic sample changer untuk 6 buah sampel dengan variasi temper-atur (5∼100 ◦C)

tetap stabil.

GAMBAR 3: Hasil eksperimen SANS pada sampel koloid denganvariasi temperatur, dari di bawah temperatur ruang (15 ◦C), temper-atur ruang (25 ◦C) dan di atas temperatur ruang (40 dan 60 ◦C).

Eksperimen SANS dilakukan pada 3 posisi detektor,yaitu 1,5 m; 4 m dan 10 m sehingga memungkinkanuntuk mendapatkan rentang daerah momentum yangcukup besar dalam memperoleh informasi mengenaiultrastruktur dari virus like particle dengue ini, GAM-BAR 4.

Protein virus ini memiliki buah struktur, yaitu core-shell structure yang dikarakterisasi dengan mener-apkan metode variasi kontras sebagai fungsi untukmemetakan secara detail bagian demi bagian yang adapada virus tersebut. Semua eksperimen dilakukan padatemperatur rendah, sekitar 5 ◦C untuk menjaga struktur

Prosiding InSINas 2012

KO-124 0097: Edy Giri R.P. dkk.

(a1) (b1) (c1)

(a2) (b2) (c2)

(a3) (b3) (c3)GAMBAR 4: Data hamburan SANS pada sampel larutan 5% protein virus dalam (a1-a3) 100% D2O (b1-b3) 50% D2O dan (c1-c3) 0%D2O pada posisi detektor (a1-c1) 1,5m; (b2-c2) 4m; dan (a3-c3) 10m. Lama pengukuran sampel masing-masing antara 4 ∼ 8 jam.

protein atau virus tetap stabil. Analisis data akan dila-kukan sebagai tahap terakhir dari penelitian ini. Hasilpengambilan data hamburan neutron sudut kecil ditun-jukkan dalam GAMBAR 4.

Dalam eksperimen SANS menggunakan 3 buah sam-pel dengan komposisi pelarut D2O yang berbeda. Halini bertujuan untuk memetakan bagian demi bagiandari komponen makromolekul penyusun virus terse-but, yaitu protein membran (shell), material genetik(core). Salah satu hasil yang diberikan adalah hasil ana-lisis sampel 5% dalam pelarut murni D2O seperti yangditunjukkan pada GAMBAR 5.

Hasil fitting memberikan informasi bahwa struktur”core-shell” dari virus like particle tersebut memilikidiameter inti (core) sebagai bagian komponen mate-rial genetik ∼70A, dengan ketebalan protein membran(shell) ∼28A.

IV. KESIMPULANEksperimen SANS sudah dapat dilakukan secara

otomatis dan simultan menggunakan programmablemotor controller PCI dan automatic sample changer.

Eksperimen SANS sudah dapat dilakukan denganvariasi temperatur (5 ∼ 100 ◦C) karena sampel changertelah terintegerasi dengan sistem heating/ cooling-circulated oil system.

Sistem ”stopped-flow cell” masih dalam pengem-bangan dan akan diimplementasikan untuk mempela-jari kinetika/mekanisme ”self-assembly” protein virus.

Eksperimen SANS terhadap virus like particle (VLP)dengan konsentrasi 5% dalam 100% D2O, 50% D2O dan0% D2O telah dilakukan menggunakan spektrometerSANS BATAN dan data analisis telah dilakukan untukmemahami struktur virus like particle dengan ukuransekitar 130A.

Prosiding InSINas 2012

0097: Edy Giri R.P. dkk. KO-125

GAMBAR 5: Data hamburan 1-dimensi SANS pada sampel larutan5% protein virus dalam 100% D2O yang difitting dengan modelcore-shell yang dikombinasikan dengan model struktur fraktal.

SARANPengujian sistem kendali simultan dan automatis

yang baru ini harus terus menerus dilakukan untukmelihat kehandalan sistem tersebut. Eksperimen awalmenggunakan sampel virus perlu dilakukan untukmenguji seluruh sistem yang telah dikembangkan dandiimplementasikan pada spektrometer SANS BATANjuga perlu dilakukan lebih lama untuk mendapat statis-tik cacahan yang lebih baik.

DAFTAR PUSTAKA[1] S.S. Hasnain, S. Wakatsuki, Biophysical Meth-

ods: Structure, Function and Dynamics Studiesof Macromolecular Assemblies using Electrons,Lasers, Neutrons and X-rays, Curr. Opinion. Struc.Biol. 18, 2008, 577-580.

[2] C. Neylon, Small Angle Neutron and X-Ray Scat-tering in Structural Biology: Recent Examples fromthe Literature, Eur. Biophys. 37, 2008, 531-541.

[3] T.A. Harroun, G.D. Wignall, J. Katsaras, NeutronScattering for Biology, in Biological and Medi-cal Physics, Biomedical Engineering, J. Fitter, T.Gutberlet, J. Katsaras (Eds.), Springer, Heidelberg,2006, 1-18.

[4] J.K. Krueger, G.D. Wignall, Small-Angle NeutronScattering from Biological Molecules, in Biologi-cal and Medical Physics, Biomedical Engineering,J. Fitter, T. Gutberlet, J. Katsaras (Eds.), Springer,Heidelberg, 2006, 127-160.

[5] S. Krueger, U.A. Perez-Salas, S.K. Gregurick, D.Kuzmanovic, Small Angle Neutron Scatteringfrom Proteins, Nucleic Acids, and Viruses, in Bi-ological and Medical Physics, Biomedical Engi-neering, J. Fitter, T. Gutberlet, J. Katsaras (Eds.),

Springer, Heidelberg, 2006, 161-185.[6] D.M. Engelman, P.B. Moore, Determination of

Quaternary Structure by Small Angle NeutronScattering, Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 4, 1975,219-241.

[7] D.A. Jacques, J. Trewhella, Small-Angle Scatter-ing for Structural Biology: Expanding the FrontierWhile Avoiding the Pitfalls, Protein Sci. 2010, 642-657.

[8] A. Patriati, E.G.R Putra, Y.A. Mulyana, StructuralChanges of Bovine Serum Albumin in Solution: ASmall-Angle Neutron Scattering Study, presentasiPoster di the 3rd Gruber-Soedigdo Lectures, ITB,Bandung, 27 Agustus 2010.

[9] Edy Giri Rachman Putra (Principle Investigator),Small-angle Neutron Scattering (SANS) Studies onBiological Macromolecules. Research Grant No. 08-140 RG/PHYS/AS, disponsori oleh the Academyof Science for the Developing World (TWAS), Tri-este, Itali, 2009.

[10] A.B. Witarto, A. Patriati, E.G.R. Putra, Suwarti, B.Wispriyono, Biophysical Study of Dengue Virus,presentasi Poster di the 2nd AONSA NeutronSchool, ANSTO, Sydney, 24-28 Agustus 2009.

[11] S.-M. Choi, J. G. Barker, C. J. Glinka, Y. T. Chengand P. L. Gammel, ”Focusing cold neutrons withmultiple biconcave lenses for small-angle neutronscattering”, J. Appl. Cryst. 33 (2000), 793 E796.

[12] T. Okua, J. Suzuki, H. Sasao, S. Yamada, M. Fu-rusaka, T. Adachi, T. Shinohara, K. Ikeda, H.M.Shimizu, ”A demonstration study of focusing ge-ometry SANS using a magnetic lens”, Physica B356 (2005), 126 E130.

[13] T. Oku, S. Yamada., H. Sasao, J. Suzuki, T. Shino-hara, K. Hirota, K. Ikeda, T. Tsuzaki, Y. Kiyanagi,M. Furusaka, H. M. Shimizu, ”A magnetic neutronlens based on an extended Halbach-type perma-nent sextupole magnet”, Physica B 385E86 (2006),1225 E1228.

Prosiding InSINas 2012