APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT … · Tbk dan PT Haes Brother. Ungkapan terima kasih...
31
APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT UNTUK KUANTIFIKASI EUGENOL, MENTOL, DAN METIL SALISILAT DALAM OBAT NYERI OTOT NURTIYAS LUTHFIANI DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Transcript of APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT … · Tbk dan PT Haes Brother. Ungkapan terima kasih...
APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT
UNTUK KUANTIFIKASI EUGENOL, MENTOL, DAN METIL
SALISILAT DALAM OBAT NYERI OTOT
NURTIYAS LUTHFIANI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
NURTIYAS LUTHFIANI. Aplikasi Spektrofotometri Inframerah Dekat untuk
Kuantifikasi Eugenol, Mentol, dan Metil Salisilat dalam Obat Nyeri Otot.
Dibimbing oleh SRI MULIJANI dan RUDI HERYANTO.
Campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat dapat dianalisis menggunakan
spektrofometri inframerah dekat (NIRS) dan dibandingkan dengan analisis
kromatografi gas. Tahapan penentuan NIRS sebagai alat analisis suatu zat ialah
uji kesesuaian alat, pembuatan model kalibrasi, uji prediksi, dan uji validasi. Uji
kesesuaian alat menghasilkan gangguan yang rendah untuk alat NIRS FOSS
Rapid Content Analyzer. Pembuatan model kalibrasi menggunakan teknik
kalibrasi multivariat (kuadrat terkecil parsial) pada kurva turunan kedua. Uji
prediksi menghasilkan nilai galat baku prediksi (SEP) untuk eugenol, mentol, dan
metil salisilat berturut-turut sebesar 0.019, 0.09, dan 0.145. Uji validasi campuran
eugenol, mentol, dan metil salisilat berturut-turut menghasilkan linearitas sebesar
0.858, 0.973, dan 0.891. Nilai kisaran (%) sebesar 67–119 untuk eugenol, 60–110
untuk mentol, dan 69–120 untuk metil salisilat. Nilai akurasi, keterulangan, presisi
intermediet, dan spesifisitas untuk ketiga zat aktif berturut-turut sebesar SEP > 1.4
× SEL, RSD < 2%, tidak berbeda nyata, dan > 0.900. Berdasarkan hasil uji
prediksi dan validasi, NIRS dapat digunakan untuk pengukuran campuran
eugenol, mentol, dan metil salisilat.
ABSTRACT
NURTIYAS LUTHFIANI. Aplication of Near Infrared Spectrophotometry for
Quantification of Eugenol, Menthol, and Methyl Salycilate in Analgesic Balm.
Supervised by SRI MULIJANI and RUDI HERYANTO.
The mixture of eugenol, menthol, and methyl salicylate can be analyzed by
near infrared spectrophotometry (NIRS) and compared with the chromatography
gas analysis. The steps to validate NIRS as the analytical tool included feasibility
test, calibration model building, prediction test, and validation test. The feasibility
test produced low perturbation for NIRS FOSS Rapid Content Analyzer tool. The
calibration model building used multivariate calibration (partial least square), with
2nd
derivative curve. Prediction test gave the standard error prediction (SEP) for
eugenol, menthol, and methyl salicylate of 0.019, 0.09, and 0.0145, respectively.
Validity test for the mixture of eugenol, menthol, and methyl salicylate gave
linearity of 0.858, 0.973, and 0.891, respectively. The range of value (%) were
67–119 for eugenol, 60–110 for mentol, and 69–120 for methyl salicylate. The
value of accuracy, repeatability, intermediate precision, and specificity for the
mixture were SEP > 1.4 × SEL, RSD < 2%, no significant difference, and > 0.900,
respectively. Based on the results of prediction and validation test, NIRS is
applicable for measurement of the mixture of eugenol, menthol, and methyl
salicylate.
APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT
UNTUK KUANTIFIKASI EUGENOL, MENTOL, DAN METIL
SALISILAT DALAM OBAT NYERI OTOT
NURTIYAS LUTHFIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Aplikasi Spektrofotometri Inframerah Dekat untuk
Kuantifikasi Eugenol, Mentol, dan Matil Salisilat dalam Obat
Nyeri Otot
Nama : Nurtiyas Luthfiani
NIM : G44096004
Disetujui
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr Sri Mulijani, MS Rudi Heryanto, MSi
NIP 196304011991032001 NIP 19760428 2005011002
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 195012271976032002
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya yang
berlimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini
dilaksanakan dari bulan Februari sampai Agustus 2011 bertempat di Laboratorium
PT Taisho Pharmaceutical Indonesia, Tbk Depok.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada yang terhormat Ibu Dr Sri
Mulijani, MS selaku pembimbing pertama dan Bapak Rudi Heryanto, MSi selaku
pembimbing kedua atas petunjuk dan bimbingan yang telah diberikan kepada
penulis selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih kepada
seluruh staf Departemen Quality Operation PT Taisho Pharmaceutical Indonesia,
Tbk dan PT Haes Brother.
Ungkapan terima kasih kepada seluruh keluarga atas dukungan dan kasih
sayangnya. Ucapan terima kasih kepada mahasiswa Ekstensi Kimia IPB yang
telah memberikan semangat, motivasi, dan dorongan dalam menyusun karya
ilmiah ini.
Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun bagi pembaca.
Bogor, Februari 2012
Nurtiyas Luthfiani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tegal pada tanggal 9 Agustus 1986 dari Ayah Ahmad
Subekhi dan Ibu Nurjanah. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMAN 1 Slawi dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis
memilih Program Studi D3 Analisis Kimia, Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Tahun 2009 penulis kembali lulus
seleksi masuk IPB untuk Program Ekstensi Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif dalam Ikatan
Mahasiswa Kimia (Imasika) IPB pada tahun 2005/2006. Selain itu, penulis
bekerja di PT Taisho Pharmaceutical Indonesia, Tbk sebagai Quality Control
Compliance dari tahun 2008 sampai sekarang.
vi
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................................... vii
PENDAHULUAN....................................................................................................................... 1
METODE
Bahan dan Alat .................................................................................................................. 2
Lingkup Kerja ................................................................................................................... 2
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Kesesuaian Alat ......................................................................................................... 3
Pembuatan Model Kalibrasi Eugenol, Mentol, dan Metil Salisilat ................... 4
Uji Prediksi ........................................................................................................................ 6
Penentuan Standar Galat Laboratorium ..................................................................... 7
Uji Validasi ........................................................................................................................ 7
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ............................................................................................................................. 8
Saran .................................................................................................................................... 9
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................ 9
LAMPIRAN ................................................................................................................................ 10
vii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Data kalibrasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat ............................. 5
2 Uji prediksi terhadap model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat ........ 7
3 Nilai SEL dan spesifikasinya .............................................................................. 7
4 Uji parameter validasi ......................................................................................... 8
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Spektrum (a) dan gangguan (b) yang dihasilkan pada uji kesesuaian alat
menggunakan NIRS FOSS Smart Probe ............................................................ 4
2 Spektrum (a) dan turunan kedua spektrum (b) yang dihasilkan pada uji
kesesuaian alat menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer ................ 4
3 Persamaan matematika pada PLS ....................................................................... 5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelititan ....................................................................................... 11
2 Data komposisi matriks campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat .......... 12
3 Data penentuan model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat .............. 13
4 Data dan grafik nilai PRESS eugenol, mentol, dan metil salisilat ................... 15
5 Data prediksi eugenol, mentol, dan metil salisilat ........................................... 18
6 Data SEL eugenol, mentol, dan metil salisilat ................................................. 21
7 Kriteria nilai SEP dan R2 .................................................................................. 21
8 Data akurasi ...................................................................................................... 21
9 Data uji presisi.................................................................................................. 22
PENDAHULUAN
Proses analisis pengawasan mutu pada
industri farmasi mencakup analisis bahan
baku dan produk akhir. Teknik analisis
kromatografi umumnya digunakan, yaitu
kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan
kromatografi gas (GC). Teknik analisis
menggunakan HPLC dan GC tergolong
mahal, waktu analisisnya lama, dan
menghasilkan limbah bahan kimia yang
berbahaya bagi lingkungan (Blanco & Alcala
2006). Hal ini menyebabkan perlunya
pengembangan suatu teknik analisis
pengawasan mutu yang cepat, murah,
meminimumkan tingkat galat manusia dan
limbah bahan kimia, dengan ketepatan dan
ketelitian analisis yang tinggi (Blanco et al.
2000). Spektroskopi inframerah dekat/near
infrared spectroscopy (NIRS) merupakan
alternatif teknik analisis yang dapat digunakan
untuk pengawasan mutu suatu zat atau
campuran pada industri farmasi dengan
proses analisis yang cepat, sederhana, mudah,
tanpa preparasi sampel, tanpa bahan kimia,
menghasilkan sedikit limbah, dan
takdestruktif (USP Convention 2011).
Fenomena interaksi materi dengan
gelombang elektromagnetik bersifat spesifik,
baik absorpsi maupun emisi. Interaksi tersebut
menghasilkan sinyal yang disadap sebagai alat
analisis kualitatif dan kuantitatif. Panjang
gelombang NIRS terdiri atas 2 wilayah, yaitu
panjang gelombang pendek di sekitar 780–
1100 nm dan panjang gelombang panjang di
sekitar 1100–2500 nm. Absorpsi yang
menonjol terjadi pada wilayah inframerah
tengah yang berhubungan dengan efek
overtone molekul dan vibrasi kombinasi
gugus fungsi -CH, -NH, dan -OH (Luypaert et
al. 2007). Sebagian besar senyawa kimia dan
biokimia menunjukkan pita serapan yang khas
pada wilayah spektrum inframerah dekat
sehingga dapat digunakan untuk pengukuran
kualitatif dan kuantitatif pada senyawa
tersebut (USP Convention 2011).
Adanya tumpang-tindih spektrum dan
sensitivitas yang rendah pada NIRS
menyebabkan NIRS tidak dapat digunakan
untuk pengukuran secara langsung dan
diperlukan teknik regresi multivariat untuk
mencapai pengukuran yang selektif. Teknik-
teknik kalibrasi statistis multivariat yang dapat
digunakan untuk pengukuran antara lain
regresi linear ganda (MLR), analisis
komponen utama (PCA), dan kuadrat terkecil
parsial (PLS) (Rajalahti & Kvalheim 2011).
Salah satu analisis spektrum yang penting
adalah membentuk model kalibrasi melalui
metode pengenalan pola untuk
mengidentifikasi kemiripan dan pola utama
data. Metode ini menghitung persamaan
regresi berdasarkan data spektrofotometri dan
informasi analit yang diketahui. Selanjutnya,
model ini dapat digunakan untuk
memprediksikan konsentrasi sampel yang
tidak diketahui. Selisih antara konsentrasi
yang dibuat dan konsentrasi dugaan dari
model dipakai sebagai parameter kebaikan
model (Saragih 2007). Parameter kebaikan
model kalibrasi tersebut meliputi R2
(koefisien
determinasi), prediksi jumlah-kuadrat galat
sisa (PRESS), galat baku kalibrasi (SEC),
galat baku prediksi (SEP), dan simpangan
nisbah kinerja (RPD).
Koefisien determinasi/R2 adalah nilai
kelinearan antara prediktor dan respons. Nilai
R2 yang sangat baik adalah 0.9975 sampai
1.000. Nilai PRESS adalah ukuran kebaikan
model dalam mencocokkan konsentrasi yang
diperoleh dari model dengan konsentrasi yang
dibuat. Nilai SEC dihasilkan dari rataan
kuadrat selisih konsentrasi dugaan himpunan
kalibrasi, sedangkan SEP dihasilkan dari
rataan kuadrat selisih konsentrasi dugaan
himpunan prediksi. Nilai PRESS, SEC, dan
SEP yang semakin mendekati nol
menunjukkan model yang semakin baik.
Kisaran/SEP merupakan nilai kisaran
konsentrasi dibandingkan dengan nilai SEP.
Nilai yang baik adalah lebih dari 5. RPD
adalah nisbah standar deviasi metode
pembanding terhadap nilai SEP. Nilai RPD
yang baik adalah lebih dari 10 (EMEA 2009).
Aplikasi NIRS dalam industri farmasi
ialah untuk identifikasi bahan aktif dan bahan
tambahan pada obat, mengukur kadar air,
mengukur kadar bahan aktif dan bahan
tambahan, serta mengukur keseragaman
kandungan suatu zat pada obat (Luypaert et
al. 2007). Campuran mentol, eugenol, dan
metil salisilat yang terkandung pada obat
nyeri otot yang diteliti pada penelitian ini
merupakan senyawa organik yang dapat
dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif
menggunakan NIRS.
Penelitian ini bertujuan menentukan model
kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat
dalam obat nyeri otot berdasarkan NIRS. Uji
prediksi dan validasi selanjutnya dilakukan
untuk membuktikan kebaikan dari model
kalibrasi yang diperoleh. Hasil pengukuran
NIRS juga dibandingkan dengan hasil
pengukuran metode pembandingnya, yaitu GC
METODE
Bahan dan Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan
adalah NIRS FOSS Rapid Content Analyzer,
NIRS FOSS Smart Probe, wadah sampel yang
berupa reflectance sample vessel, reflektor
yang terbuat dari emas (gold reflector), GC
Shimadzu 2010, neraca analitik, pipet
volumetrik 1 mL, pipet volumetrik 20 mL,
labu ukur 50 mL, labu ukur 100 mL, dan
corong pemisah.
Bahan-bahan yang digunakan dalam
percobaan adalah matriks campuran mentol,
eugenol, dan metil salisilat sebanyak 27
matriks, standar pembanding mentol, eugenol,
dan metil salisilat USP, o-
metoksimetilbenzoat, kloroform, natrium
sulfat, dan asam sulfat.
Lingkup Kerja
Penelitian terdiri atas beberapa tahap
(Lampiran 1). Tahap pertama adalah
pembuatan campuran eugenol, mentol, dan
metil salisilat sebanyak 27 sampel. Tahap
kedua adalah uji kesesuaian alat dengan
menggunakan NIRS FOSS Rapid Content
Analyzer dan NIRS FOSS Smart Probe.
Tahap ketiga adalah analisis 27 matriks
dengan NIRS dan GC. Tahap keempat adalah
pembuatan model kalibrasi dengan metode
PLS, tahap kelima adalah prediksi terhadap
model kalibrasi dengan menggunakan sampel
produksi sebanyak 100, tahap keenam adalah
menentukan standar galat laboratorium (SEL),
dan tahap ketujuh adalah uji parameter
validasi sesuai dengan parameter validasi
untuk pengukuran kandungan senyawa pada
obat berdasarkan USP Convention (2011).
Pembuatan Matriks Campuran Mentol,
Eugenol, dan Metil Salisilat
Campuran eugenol, mentol, dan metil
salisilat yang digunakan untuk pembuatan
model kalibrasi dibuat di laboratorium dengan
kisaran sebesar 70–120% dari kadar mentol,
eugenol, dan metil salisilat dalam campuran
(USP Convention 2011). Komposisi untuk
masing-masing zat tersaji pada Lampiran 2.
Uji Kesesuaian Alat (FOSS 2009) Matriks nomor 2 dan 3 yang telah dibuat
diukur dengan menggunakan NIRS FOSS
Rapid Content Analyzer dengan cara sampel
dimasukkan ke dalam wadah sampel yang
berupa reflectance sample vessel, dipadatkan,
kemudian ditekan dengan gold reflector
sampai tidak ada gelembung, dan diukur.
Selain itu, matriks untuk nomor 1–5 diukur
dengan menggunakan NIRS FOSS Smart
Probe dengan cara probe dimasukkan ke
dalam sampel, kemudian sampel diukur.
Spektrum yang dihasilkan oleh masing-
masing alat dibandingkan.
Pengukuran Matriks dan Sampel Produksi
dengan NIRS untuk Pembuatan Model
Kalibrasi
Sebanyak 27 matriks dan sampel produksi
dianalisis dengan menggunakan NIRS FOSS
Rapid Content Analyzer. Matriks diukur
seperti dijelaskan pada Uji Kesesuaian Alat.
Pengukuran Matriks dan Sampel Produksi
dengan Metode Pembanding (GC) untuk
Pembuatan Model Kalibrasi
Standar internal disiapkan dengan cara
melarutkan sebanyak 1 mL o-
metoksimetilbenzoat dengan kloroform ke
dalam labu ukur 50 mL. Larutan kemudian
ditera dengan kloroform dan dikocok hingga
larut sempurna.
Larutan standar disiapkan dengan cara
melarutkan sebanyak 33.5 mg eugenol dan
135 mg mentol dengan sekitar 20 mL
kloroform, lalu larutan dimasukkan ke dalam
labu ukur 50 mL. Larutan kemudian ditera
dengan kloroform dan dikocok hingga larut
sempurna.
Larutan standar kerja disiapkan dengan
cara sebanyak 100 mg metil salisilat
dilarutkan dengan 20 mL kloroform, lalu
dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL. Ke
dalamnya ditambahkan 20 mL larutan standar
dan 1 mL standar internal, kemudian ditera
dengan kloroform dan dikocok hingga larut
sempurna.
Matriks dan sampel produksi ditimbang
sebanyak 0.9–1.10 g, dimasukkan ke dalam
corong pisah 125 mL, lalu ditambahkan 15
mL larutan natrium sulfat jenuh dan 5 mL
asam sulfat. Larutan kemudian diekstraksi
dengan 20 mL kloroform sebanyak 3 kali.
Hasil ekstraksi dikumpulkan pada labu ukur
100 mL, ditambahkan 1 mL standar internal,
lalu ditera dengan kloroform dan dikocok
hingga larut sempurna. Larutan matriks dan
sampel produksi serta larutan standar disaring
dengan filter 0.45 µm. Hasil saringan
ditampung pada vial GC untuk diinjeksikan.
Pembuatan Model Kalibrasi (FOSS 2009)
Model kalibrasi dibuat menggunakan
matriks campuran dan sampel produksi
dengan himpunan kalibrasi tersaji pada
Lampiran 3. Model kalibrasi ditentukan
menggunakan perangkat lunak Vission
dengan teknik PLS menggunakan kurva
turunan kedua.
Prediksi Hasil Analisis NIRS (FOSS 2009)
Untuk memprediksi model kalibrasi,
sampel dianalisis menggunakan NIRS dan
metode pembandingnya. Analisis
menggunakan NIRS dilakukan terhadap 100
sampel produksi yang tidak termasuk dalam
himpunan kalibrasi, dengan prosedur seperti
dijelaskan pada Uji Kesesuaian Alat. Prediksi
dengan metode pembanding GC dilakukan
terhadap 100 sampel produksi yang telah
dianalisis dengan NIRS tersebut. Penyiapan
standar internal, larutan standar, dan larutan
standar kerja, serta pengukuran GC dilakukan
seperti telah dijelaskan di atas.
Penentuan Galat Baku Prediksi
Prediksi sampel produksi dengan NIRS
dan GC digunakan untuk menentukan nilai
SEP dengan rumus sebagai berikut:
n
n
i V,iYv,iy
1
2
SEP
Keterangan:
SEP = Galat baku prediksi
yv = Nilai analisis NIRS
YV = Nilai analisis GC
n = Jumlah sampel
Penentuan Linearitas, Akurasi, Presisi,
Spesifisitas, dan Kisaran (Mark et al. 2002)
Linearitas, akurasi, dan kisaran ditentukan
menggunakan perangkat lunak Vission pada
saat pembuatan model kalibrasi. Spesifisitas
dilakukan dengan cara mengukur sampel yang
komposisinya mirip dengan campuran mentol,
eugenol dan metil salisilat, kemudian
spesifisitas ditentukan dengan perangkat
lunak. Presisi terdiri dari atas 2 macam, yaitu
keterulangan dan presisi intermediet.
Keterulangan dilakukan dengan cara
mengukur sampel konsentrasi 100% sebanyak
13 kali. Presisi intermediet juga dilakukan
dengan cara mengukur sampel pada
konsentrasi 100% sebanyak 13 kali, tetapi
pengukuran dilakukan pada hari yang berbeda
dengan analis yang berbeda.
Analisis dengan Metode Pembanding (BMS
1997)
Untuk memperoleh nilai SEL, matriks
nomor 1, 2, 6, 15, 20, 27 (Lampiran 2)
dianalisis oleh 2 analis dengan menggunakan
instrumen GC yang sama. Penyiapan standar
internal, larutan standar, dan larutan standar
kerja, serta pengukuran GC dilakukan seperti
telah dijelaskan diatas. Hasil yang diperoleh
dari pengukuran dengan GC digunakan untuk
menghitung nilai SEL dengan rumus sebagai
berikut:
n
n
i ,iy,iy
1 21
2
SEL
Keterangan:
SEL = Galat baku laboratorium
y1/2 = Nilai pengukuran metode
pembanding pada kondisi yang
berbeda
n = Jumlah sampel
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Kesesuaian Alat
Tahapan penggunaan NIRS sebagai alat
analisis ialah uji kesesuaian alat/feasibility
study, pembuatan model kalibrasi, uji
prediksi, dan uji validasi (FOSS 2009). Uji
kesesuaian alat pada NIRS mencakup
pengecekan gangguan secara visual pada
spektrum yang dihasilkan (EMEA 2009). Uji
ini dilakukan dengan cara menganalisis
matriks campuran eugenol, mentol, dan metil
salisilat pada 2 model alat NIRS, yaitu NIRS
FOSS Smart Probe dan NIRS FOSS Rapid
Content Analyzer, kemudian melihat
gangguan yang dihasilkan pada 2 model alat
tersebut (FOSS 2009).
Analisis dengan NIRS FOSS Smart Probe
dilakukan dengan cara memasukkan probe ke
dalam sampel dan menghasilkan spektrum
pada Gambar 1. Spektrum ini merupakan hasil
pengukuran untuk matriks nomor 1 sampai
dengan 5. Gambar 1(a) menunjukkan adanya
gangguan pada spektrum yang dihasilkan
(ditunjukkan dalam kotak). Gangguan tersebut
menyebabkan alat ini tidak dapat digunakan
untuk menganalisis campuran eugenol,
mentol, dan metil salisilat pada obat
penghilang nyeri otot. Gambar 1(b)
memperlihatkan gangguan yang sangat jelas
pada spektrum setelah dilakukan perbesaran.
4
5
sedangkan sisanya adalah sampel produksi
(Blanco & Alcala 2006). Model kalibrasi
dibuat dengan perangkat lunak Vission
menggunakan teknik kalibrasi multivariat PLS
(Broad et al. 2002; Luypaert et al. 2007).
Pembuatan kalibrasi ini diawali dengan
pemrosesan awal spektrum untuk
menghilangkan pengaruh kuat dari hamburan
spektrum dan untuk meminimumkan baseline
offsets. Spektrum yang digunakan adalah
turunan kedua/2nd
derivative (Broad et al.
2002; Blanco & Alcala 2006).
PLS dapat memprediksikan serangkaian
peubah takbebas dari peubah bebas yang
jumlahnya sangat banyak, memiliki struktur
sistematik linear dan nonlinear dengan atau
tanpa data yang hilang, serta memiliki
kolinearitas yang tinggi. PLS dapat
memprediksi sampel yang tidak diketahui
dengan ketepatan lebih baik dibandingkan
dengan teknik kalibrasi multivariat lainnya
(Hopke 2003).
Gambar 3 menunjukkan persamaan yang
digunakan dalam PLS. A menunjukkan data
spektrum, S dan U menunjukkan skor, Fa dan
Fc menunjukkan nilai loading, Ea dan Ec
merupakan galat, sedangkan C menunjukkan
konsentrasi data (FOSS 2009). Hasil kali Fa
dan S mendekati data spektrum, sedangkan
hasil kali U dan Fc mendekati konsentrasi
sebenarnya. Tujuan algoritma PLS adalah
meminimumkan galat dengan terus menjaga
korelasi A dan C dalam hubungan dalam, U =
S B (Brereton 2000).
A= S.Fa + Ea
U= S.B
C= U.Fc + Ea
C= S.B.U +E
Gambar 3 Persamaan matematika pada PLS.
Tabel 1 menunjukkan data kalibrasi
campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat.
Sampel produksi untuk kalibrasi eugenol lebih
banyak daripada sampel untuk kalibrasi
mentol dan metil salisilat karena kadar
eugenol dalam campuran lebih rendah
dibandingkan dengan kadar mentol dan metil
salisilat yaitu 1.370%, sedangkan kadar
mentol dan metil salisilat berturut-turut 5.430
dan 10.200% (FOSS 2009).
Tabel 1 Data kalibrasi campuran eugenol,
mentol, dan metil salisilat Parameter kalibrasi
Eugenol Mentol Metil
salisilat
Pemrosesan
awal pektrum
Turunan
kedua
Turunan
kedua
Turunan
kedua Panjang
gelombang
(nm)
400–300,
1500–
800, 2000 –
2200
400–500 400–
2500
Jumlah faktor PLS
9 9 5
Jumlah Sampel
laboratorium
27 27 27
Jumlah sampel
produksi
40 33 33
Rerata (%) 1.386 5.191 9.562
SDa 0.174 0.699 1.223
SECb 0.065 0.116 0.389
SECVc 0.075 0.154 0.426 asimpangan baku, bgalat baku kalibrasi, cgalat baku
validasi silang
Panjang gelombang yang digunakan pada
penentuan model kalibrasi eugenol adalah
400–1300, 1500–1800, dan 2000–2200 nm
dengan menggunakan faktor 9. Penentuan
nilai faktor merupakan hal yang sangat krusial
agar diperoleh model kalibrasi yang tepat.
Nilai faktor ini ditentukan berdasarkan nilai
minimum dari PRESS yang menunjukkan
prediksi jumlah kuadrat galat sisa yang
terkecil (FOSS 2009; Septaningsih 2008).
Nilai PRESS terkecil pada model kalibrasi
eugenol diperoleh pada faktor 9, yaitu sebesar
0.8584 (Lampiran 4). Semakin besar nilai
faktor, nilai R2
akan semakin tinggi, tetapi
menurut FOSS (2009) nilai maksimum faktor
yang boleh digunakan pada proses kalibrasi
menggunakan perangkat lunak Vission adalah
10. Nilai faktor yang terlalu besar akan
menyebabkan overfits pada model kalibrasi,
sedangkan nilai yang terlalu kecil akan
menyebabkan underfits (EMEA 2009).
Parameter kalibrasi lainnya seperti SEC
menunjukkan nilai yang baik karena
mendekati nol, yaitu sebesar 0.065. Nilai SEC
sebesar 0.065 maknanya ialah selisih antara
nilai analisis NIRS dan nilai metode
pembandingnya pada eugenol saat penentuan
model kalibrasi sebesar 0.065. SEC diperoleh
menggunakan rumus sebagai berikut:
pn
n
i C,iYC,iy
1
2
SEC
Keterangan:
YC = Nilai analisis NIRS pada set kalibrasi
yC = Nilai analisis GC pada set kalibrasi
n = jumlah sampel
p = faktor kalibrasi
Hubungan
luar
Hubungan
dalam
Hubungan
luar
Hubungan
dalam
Hubungan
luar
6
Nilai SECV yang diperoleh untuk eugenol
sebesar 0.075. SECV adalah galat baku yang
terjadi pada saat validasi silang (USP
Convention 2011). Nilai ini juga sangat baik
karena mendekati nol. Nilai SECV diperoleh
dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
pn
n
i CV,iYCV,iy
1
2
SECV
Keterangan:
YCV = Nilai analisis NIRS
yCV = Nilai analisis GC
n = Jumlah sampel
Rerata yang diperoleh pada kalibrasi eugenol
sebesar 1.386%, dengan simpangan baku (SD)
sebesar 0.174.
Berbeda dengan eugenol, panjang
gelombang yang digunakan mentol adalah
400–2500 nm. Jumlah faktor yang digunakan
ialah 9 karena nilai minimum log PRESS
sebesar 1.8709 menunjukkan faktor 9.
Himpunan sampel yang digunakan pada
kalibrasi mentol menggunakan 27 matriks
laboratorium dan 33 sampel produksi. Nilai
rerata yang diperoleh sebesar 5.191% dengan
SD sebesar 0.699. Nilai SEC juga baik karena
nilainya yang mendekati nol, yaitu sebesar
0.116, tetapi belum sebaik nilai SEC eugenol.
Sama halnya dengan nilai SEC, nilai SECV
mentol yang diperoleh sebesar 0.154, kurang
baik jika dibandingkan dengan nilai SECV
eugenol. Hal ini disebabkan pengukuran
mentol menggunakan seluruh panjang
gelombang dari 400 sampai 2500 nm,
sehingga terdapat lebih banyak matriks
pengganggu dalam pembuatan model
kalibrasi.
Panjang gelombang yang digunakan untuk
pembuatan model kalibrasi metil salisilat
sama dengan mentol, yaitu 400– 2500 nm
(FOSS 2009). Jumlah faktor yang digunakan
ialah 5 karena nilai minimum log PRESS
sebesar 13.597 menunjukkan faktor 5.
Himpunan sampel yang digunakan ialah 27
matriks laboratorium dan 33 sampel produksi.
Nilai rerata yang diperoleh sebesar 9.562%
dengan SD sebesar 1.233. Nilai SEC yang
diperoleh 0.389, sedangkan nilai SECV 0.426.
Nilai parameter uji yang diperoleh pada model
kalibrasi metil salisilat ini kurang baik
dibandingkan dengan eugenol dan mentol
karena pada metil salisilat, selain terdapat
matriks pengganggu, digunakan semua
kisaran panjang gelombang dari 400 sampai
2500 nm, faktor yang dipakai juga terlalu
kecil, yaitu 5, sehingga kemungkinan terjadi
underfits pada spektrum yang digunakan
untuk pembuatan model kalibrasi.
Uji Prediksi
Model kalibrasi yang telah diperoleh perlu
diuji prediksi untuk membuktikan
kebaikannya. Menurut Blanco & Alcala
(2006), uji prediksi dilakukan menggunakan 2
himpunan sampel, yaitu sampel produksi dan
laboratorium, yang tidak digunakan untuk
proses kalibrasi. Uji prediksi pada penelitian
ini dilakukan hanya dengan menggunakan
sampel produksi sebanyak 100 batch karena
model kalibrasi akan digunakan untuk analisis
sampel produksi saja. Proses prediksi akan
menghasilkan nilai SEP, yang merupakan
ukuran ketepatan dari suatu model kalibrasi
yang dibuat (USP Convention 2011). Nilai
SEP semakin baik jika semakin mendekati nol
(Septaningsih 2008). Selain nilai SEP, pada
proses prediksi dapat diketahui nilai rerata
galat pengukuran analisis NIRS dan GC yang
disebut bias (EMEA 2009). Nilai bias dapat
ditentukan dengan rumus sebagai berikut:
n
ni )
iY
i(y
1
Bias
Keterangan:
Y = Nilai analisis NIRS
y = Nilai analisis GC
n = Jumlah sampel
Terlihat pada Tabel 2, prediksi yang
dilakukan terhadap model kalibrasi eugenol
menghasilkan rerata kadar sebesar 1.425%
dengan nilai SD 0.018 dan nilai RSD 1.263%.
Nilai rerata yang diperoleh sesuai dengan
spesifikasi kadar eugenol, yaitu 1.230–1.580%
(BMS 1997). Nilai SD tergolong baik karena
nilainya mendekati nol. Begitu juga dengan
nilai RSD yang menunjukkan nilai kurang
dari 2% (TPI 2010). Nilai SEP yang diperoleh
0.019 (Lampiran 5). Menurut Septaningsih
(2008), nilai ini sangat baik karena mendekati
nol, tetapi karena nilai SEL-nya 0.012
(Lampiran 6), nilai SEP ini lebih dari 1.4 ×
SEL. Menurut spesifikasi EMEA (2009), nilai
SEP yang baik adalah kurang dari 1.4 × SEL.
Menurut Cuadrado et al, (2004), nilai SEP
eugenol yang diperoleh menunjukkan presisi
yang baik karena nilai SEP yang dihasilkan
1.6 × nilai SEL nya (Lampiran 7).
7
Tabel 2 Uji prediksi terhadap model kalibrasi
eugenol, mentol, dan metil salisilat Parameter kalibrasi
Eugenol Mentol Metil
salisilat
Jumlah sampel
laboratorium
- - -
Jumlah sampel
produksi
100 100 100
Rerata (%) 1.425 5.384 10.085 SDa 0.018 0.085 0.137
RSD (%)b 1.263 1.579 1.358
Bias 0.001 0.034 0.035 SEP 0.019 0.090 0.145 asimpangan baku, bsimpangan baku relatif
Prediksi yang dilakukan terhadap model
kalibrasi mentol menghasilkan rerata kadar
sebesar 5.384% dengan nilai SD 0.085 dan
nilai RSD 1.579%. Nilai rerata yang diperoleh
sesuai dengan spesifikasi kadar mentol, yaitu
4.89–6.24% (BMS 1997). Nilai SD lebih
besar dibandingkan dengan eugenol, begitu
juga dengan nilai RSD. Meskipun nilai RSD
eugenol lebih baik dibandingkan dengan
mentol, nilai ini masih sesuai dengan
spesifikasi karena kurang dari 2% (TPI 2010).
Nilai SEP yang diperoleh 0.090 (Lampiran 5).
Menurut Septaningsih (2008), nilai ini juga
sangat baik karena mendekati nol, tetapi
karena nilai SEL-nya 0.069 (Lampiran 6),
nilai SEP ini lebih dari 1.4×SEL. Menurut
spesifikasi EMEA (2009), nilai SEP yang baik
adalah kurang dari 1.4×SEL. Menurut
Cuadrado et al. (2004), nilai SEP yang
diperoleh menunjukkan presisi yang baik
karena besarnya 3 × nilai SEL-nya (Lampiran
7). Secara keseluruhan, hasil uji parameter
prediksi pada mentol kurang baik
dibandingkan dengan uji prediksi eugenol.
Hal ini disebabkan penggunaan semua kisaran
panjang gelombang dari 400 sampai 2500 nm,
sehingga terdapat lebih banyak matriks
pengganggu.
Prediksi yang dilakukan terhadap model
kalibrasi metil salisilat menghasilkan rerata
kadar sebesar 10.085% dengan nilai SD 0.137
dan nilai RSD 1.358%. Nilai rerata yang
diperoleh sesuai dengan spesifikasi kadar
metil salisilat, yaitu 9.18–11.7% (BMS 1997).
Nilai SD tergolong baik karena mendekati nol.
Begitu juga dengan nilai RSD yang kurang
dari 2% (TPI 2010). Nilai SD yang dihasilkan
pada uji prediksi metil salisilat ini lebih besar
dibandingkan pada uji prediksi eugenol dan
mentol. Demikian pula dengan nilai SEP yang
diperoleh, yaitu 0.145 (Lampiran 5). Menurut
Septaningsih (2008), nilai SEP ini sangat baik
karena mendekati nol, tetapi karena nilai SEL-
nya 0.030 (Lampiran 6), nilai SEP ini belum
memenuhi spesifikasi EMEA (2009), yakni
harus kurang dari 1.4×SEL. Menurut
Cuadrado et al. (2004), nilai SEP yang
diperoleh menunjukkan presisi menengah
karena besarnya 2.1 × nilai SEL (Lampiran 7).
Secara keseluruhan, uji parameter prediksi
pada metil salisilat menunjukkan nilai yang
kurang baik dibandingkan dengan nilai uji
prediksi eugenol dan mentol, kecuali untuk
nilai RSD. Nilai RSD metil salisilat lebih
kecil daripada nilai RSD mentol.
Nilai SEP dari suatu model kalibrasi yang
mendekati nol dapat diartikan sebagai
kedekatan antara hasil analisis NIRS dan
analisis GC. Berdasarkan nilai SEP yang
diperoleh untuk eugenol, mentol, dan metil
salisilat, nilai analisis NIRS sangat dekat
dengan nilai analisis GC.
Penentuan Standar Galat Laboratorium
Kebaikan nilai SEP ditentukan dengan
membandingkannya dengan nilai SEL. SEL
ditentukan dengan menganalisis sampel dalam
2 variasi pengukuran yang berbeda (Cuadrado
et al. 2004). Variasi pengukuran dapat
menggunakan analis yang berbeda, instrumen
analisis yang berbeda, dan waktu analisis yang
berbeda (FOSS 2009). Pengukuran SEL pada
campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat
dalam penelitian ini menggunakan variasi
analis.
Tabel 3 menunjukkan nilai SEL untuk
masing-masing zat aktif beserta spesifikasi-
nya menurut EMEA (2009), yaitu 1.4 kali
nilai SEL zat aktif tersebut. Terlihat bahwa
nilai SEL eugenol paling kecil dibandingkan
dengan lainnya. Hal ini menunjukkan tingkat
galat laboratorium untuk eugenol sangat
rendah.
Tabel 3 Nilai SEL dan spesifikasi-nya Zat aktif SEL Spesifikasi
Eugenol 0.012 0.017
Mentol 0.069 0.097 Metil salisilat 0.030 0.042
Sumber: EMEA (2009)
Uji Validasi
Uji validasi adalah konfirmasi melalui
pengujian dan pengadaan bukti yang objektif
bahwa persyaratan tertentu untuk suatu
maksud tertentu terpenuhi. Selain uji prediksi,
uji validasi juga dilakukan untuk
membuktikan kebaikan dari model kalibrasi
Hasil uji validasi eugenol, mentol, dan metil
salisilat tertera pada Tabel 4.
Tabel 4 Uji parameter validasi
Parameter Eugenol Mentol Metil
salisilat
Linearitas dan kisaran R2 0.858 0.973 0.891
Kisaran (%) 67-119 60-110 69-120
Akurasi
SEP 0.019 0.090 0.145
SEL 0.012 0.030 0.069 1.4×SEL 0.017 0.042 0.097
Kisaran/SEP 39.421 30.222 36.386
RPD 9.157 7.768 8.435
Presisi
Keterulangan Rerata 1.412 5.444 10.233
SD 0.008 0.037 0.030
RSD 0.567 0.680 0.293
Presisi Intermediet
F hitung 0.979 0.686 0.497
F tabel 2.687 2.687 2.687
Spesifisitas
Sampel 1 0.696 0.696 0.696
Sampel 2 0.700 0.700 0.700 Sampel 3 0.732 0.732 0.732
Sampel 4 0.669 0.669 0.669
Sampel 5 0.691 0.691 0.691 Sampel 6 0.999 0.999 0.999
Sampel 7 0.998 0.998 0.998
Sampel 8 0.998 0.998 0.998 Sampel 9 0.998 0.998 0.998
Sampel 10 0.998 0.998 0.998
Tabel 4 menunjukkan nilai regresi untuk
eugenol, mentol, dan metil salisilat berturut-
turut sebesar 0.858, 0.973, dan 0.891. Nilai
regresi mentol paling baik karena paling
mendekati satu, sehingga paling menunjukkan
kedekatan antara nilai analisis NIRS dan GC.
Nilai kisaran untuk ketiga zat aktif
menunjukkan, hanya kisaran metil salisilat
memenuhi spesifikasi 70–120%; ±2% (BMS
1997). Mentol dan eugenol tidak memenuhi
spesifikasi untuk kisaran, diduga karena pada
saat proses pengukuran sebagian zat atsiri
tersebut menguap (USP Convention 2011).
Uji akurasi ditunjukkan dengan nilai SEP dan
merupakan kedekatan nilai analisis yang
diperoleh dengan nilai sebenarnya (ICH 1996;
USP Convention 2011). Menurut EMEA
(2009), kriteria penerimaan nilai SEP sebesar
1.4×SEL. Nilai SEP yang diperoleh tidak
masuk dalam kriteria tersebut, tetapi dapat
dijustifikasi dengan nilai nisbah kisaran
terhadap SEP serta nilai RPD (Lampiran 8).
Nisbah kisaran terhadap SEP harus lebih besar
dari 10 (EMEA 2009), dan hasil penelitian
untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat
seluruhnya memenuhi kriteria. RPD
merupakan nisbah SD metode pembanding
terhadap nilai SEP. Menurut EMEA (2009),
kriteria penerimaan nilai RPD harus lebih
besar dari 5. Nilai RPD untuk eugenol,
mentol, dan metil salisilat juga memenuhi
kriteria tersebut.
Uji presisi terdiri atas uji keterulangan dan
presisi intermediet. Uji keterulangan adalah
presisi yang dihasilkan pada kondisi
pengoperasian yang sama pada waktu yang
pendek. Sampel dianalisis minimum 6 kali
ulangan pada konsentrasi 100%. Uji
keterulangan pada penelitian ini dilakukan
dengan analisis sampel konsentrasi 100%
sebanyak 13 kali ulangan (ICH 1996; USP
Convention 2011). Nilai RSD yang diperoleh
berturut-turut untuk eugenol, mentol, dan
metil salisilat sebesar 0.567, 0.680, dan
0.293%. Nilai ini memenuhi kriteria
penerimaan RSD menurut TPI (2010).
Uji presisi intermediet dilakukan dengan
cara melakukan analisis NIRS untuk sampel
yang sama dengan menggunakan 2 analis
yang berbeda (ICH 1996). Terhadap hasil
analisis yang diperoleh dilakukan uji
statistika, yaitu uji F, dan dilihat perbedaan di
antara kedua pengukuran tersebut.
Berdasarkan uji statistika yang dilakukan,
nilai F hitung lebih kecil daripada F tabel
sehingga tidak ada perbedaan yang nyata di
antara 2 pengukuran yang dilakukan oleh 2
analis (Lampiran 9).
Spesifisitas adalah kemampuan suatu
metode analitik untuk mengukur analit tanpa
adanya gangguan dari komponen lainnya
(ICH 1996; USP Convention 2011). Uji
spesifisitas dilakukan dengan pengukuran
sampel yang komposisinya mirip, tetapi
berbeda zat aktifnya, yaitu sampel nomor 1–5
dan 6–10 (Lampiran 2). Spesifikasi untuk
sampel yang diuji menunjukkan nilai
identifikasi (ID) lebih dari 0.900, sedangkan
untuk sampel yang komposisinya sama, tetapi
berbeda zat aktifnya menunjukkan ID kurang
dari 0.900 (FOSS 2009). Uji spesifisitas yang
dilakukan pada penelitian telah menunjukkan
komponen pada matriks adalah eugenol,
mentol, dan metil salisilat, dengan
ditunjukkan nilai ID lebih dari 0.900.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Pengukuran kandungan eugenol, mentol,
dan metil salisilat dalam obat nyeri otot dapat
dilakukan menggunakan NIRS FOSS Rapid
Content Analyzer dengan teknik kalibrasi
multivariat PLS menggunakan kurva turunan
kedua. Nilai SEP yang diperoleh untuk
eugenol, mentol, dan metil salisilat berturut-
turut sebesar 0.019 (1.6×SEL), 0.09 (3×SEL),
dan 0.145 (2.1×SEL). Nilai SEP yang lebih
besar dari 1.4×SEL untuk eugenol, mentol,
dan metil salisilat menunjukkan bahwa nilai
analisis NIRS sangat dekat dengan nilai
analisis GC. Uji validasi campuran eugenol,
mentol, dan metil salisilat menghasilkan
linearitas masing-masing sebesar 0.858,
0.973, dan 0.891. Nilai kisaran (%)
menunjukkan nilai sebesar 67–119 untuk
eugenol, 60–110 untuk mentol, 69–120 untuk
metil salisilat. Uji keterulangan untuk ketiga
zat aktif menghasilkan nilai RSD kurang dari
2%, yaitu 0.567% untuk eugenol, 0.680%
untuk mentol, dan 0.293% untuk metil
salisilat. Uji presisi intermediet dengan uji F
menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata,
dan uji spesifisitas menunjukkan nilai ID lebih
besar dari 0.900.
Saran
Penelitian lebih lanjut dibutuhkan untuk
menyempurnakan model kalibrasi, proses
prediksi NIRS, dan proses pembandingan
dengan metode pembandingnya agar
diperoleh nilai linearitas yang sangat baik,
yaitu antara 0.9975 dan 1.0000, nilai bias
yang mendekati nol, dan nilai SEP sekitar 1–
1.5 kali nilai SEL.
DAFTAR PUSTAKA
Blanco M, Alcala M. 2006. Simultaneous
quantitation of five active principles in a
pharmaceutical preparation: Development
and validation of a near infrared
spectroscopic method. Eur J Pharmaceut
Sci 27: 280-286.
Blanco M, Eustaquio A, Gonzales JM,
Serrano D. 2000. Identification and
quantitation assays for intact tablets of two
related pharmaceutical preparations by
reflectance near-infrared spectroscopy:
Validation of the procedure. J Pharm
Biomed Anal 22:13-48.
BMS [Bristol Myers Squibb]. 1997. Assay for
Methyl Salicylate, Eugenol, dan Menthol
(GC). 1997. Jakarta: BMS.
Brereton RG. 2000. Introducing to
multivariate calibration in analytical
chemistry. Analyst 126:2125-2154.
Broad NW, Jee RD, Moffat AC, Smith MR.
2001. Application of transmission near-
infrared spectroscopy to uniformity of
content testing of intact steroid tablets.
Analyst 126: 2207-2211.
Buchi. 2011. How NIR Can Help GMP?
Jakarta: Buchi Indonesia.
Cuadrado MU, Luque de Castro MD, Perez-
Juan PM, Garcia-Olmo J, Gomez-Nieto
MA. 2004. Near infrared reflectance
spectroscopy and multivariate analysis in
enology, determination or screening of
fifteen parameters in different types of
wines. Anal Chim Acta 527:81-88.
[EMEA] European Medicines Agency. 2009.
Guideline on The Use of Near Infrared
Spectroscopy by The Pharmaceutical
Industry and The Data Requirements for
New Submissions and Variations. London:
EMEA.
FOSS. 2009. A Guide to Near-infrared
Spectroscopic Analysis of Industrial
Manufacturing Processes. Jakarta: FOSS
Indonesia.
Hopke Pk. 2003. The evolution of
chemometrics. Anal Chim Acta 500:365-
377.
[ICH] International Conference on
Harmonisation. 1996. Validation of
Analytical Procedures: Text and
Methodology Q2 (R1). Jenewa: ICH.
Luypaert J, Massart DL, Heyden YV. Near-
infrared spectroscopy applications in
pharmaceutical analysis. Talanta 72:865-
883.
Mark H, Ritchie GE, Roller RW, Ciurczak
EW, Tso C, MacDonald SA. 2002.
Validation of a near-infrared transmission
spectroscopic procedure, part A:
Validation protocols. J Pharm Biomed
Anal 28:251-260.
Rajalahti T, Kvalheim OM. 2011.
Multivariate data analysis in
pharmaceutics: A tutorial review. Int J
Pharm 417:280-90.
Reich G. 2005. Near-infrared spectroscopy
and imaging: Basic principles and
pharmaceutical applications. Adv Drug
Delivery Rev 57:1109-1143.
Saragih MA. 2007. Metode analisis simultan
natrium benzoat dan kalium sorbat
menggunakan kombinasi spektrofotometri
dan kalibrasi multivariat [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Septaningsih DA. 2008. Penentuan simultan
natrium benzoat dan kalium sorbat dengan
pendekatan kalibrasi multivariat secara
spektrofotometri UV [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
TPI [Taisho Pharmaceutical Indonesia]. 2010.
Validasi Metode Analisa. Jakarta: TPI.
[USP Convention] United States
Pharmacopeia Convention. 2011. United
States Pharmacopeia 34-National
Formulary 29. Rockville: USP.
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Bagan alir penelititan
Preparasi matriks
dan sampel produksi Analisis GC Analisis NIRS
Sampel Produksi
Pembuatan model
kalibrasi
Prediksi model
kalibrasi
Uji parameter
validasi USP
12
Lampiran 2 Data komposisi matriks campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat
Nomor Sampel Mentol (%) Eugenol (%) Metil salisilat (%)
1 70 70 70
2 70 90 110
3 70 110 120
4 80 100 100
5 80 100 120
6 80 110 70
7 80 110 90
8 80 110 100
9 90 70 120
10 90 100 80
11 90 120 100
12 100 80 100
13 100 80 120
14 100 100 80
15 100 100 100
16 100 100 120
17 100 120 80
18 100 120 100
19 100 120 110
20 110 80 90
21 110 90 70
22 110 90 100
23 120 70 90
24 120 70 100
25 120 80 110
26 120 100 100
27 120 120 120
Keterangan:
Kadar mentol : 5435 mg/100g
Kadar eugenol : 1365 mg/100g
Kadar metil salisilat : 10200 mg/100g
13
Lampiran 3 Data penentuan model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat
Nomor Peubah bebas (Spektrum NIRS) Peubah takbebas (Respons)
Sampel λ1 λ2 λ3 ….. λn Eugenol Mentol
Metil
salisilat
1 ……. ……. ……. ……. ……. 0.9700 3.7720 6.9160
2 ……. ……. ……. ……. ……. 1.2840 3.8470 10.6090
3 ……. ……. ……. ……. ……. 1.5730 3.8900 11.5590
4 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4150 4.3570 9.7590
5 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4420 4.3700 11.6100
6 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4630 4.0510 6.3630
7 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4930 4.1190 8.0750
8 ……. ……. ……. ……. ……. 1.5030 4.1040 8.8590
9 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3220 4.2440 6.7700
10 ……. ……. ……. ……. ……. 0.9800 4.4440 9.6360
11 ……. ……. ……. ……. ……. 1.6220 4.4300 8.4470
12 ……. ……. ……. ……. ……. 1.1240 5.0180 8.6780
13 ……. ……. ……. ……. ……. 1.0880 4.7760 9.8180
14 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3810 4.9940 7.0870
15 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3450 4.8210 8.4450
16 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3730 5.0820 10.6460
17 ……. ……. ……. ……. ……. 1.6530 5.3050 7.7780
18 ……. ……. ……. ……. ……. 1.6960 5.3740 9.7810
19 ……. ……. ……. ……. ……. 1.6910 5.4370 10.8210
20 ……. ……. ……. ……. ……. 1.1610 5.9100 8.9360
21 ……. ……. ……. ……. ……. 1.2710 5.9030 7.1610
22 ……. ……. ……. ……. ……. 1.2760 5.8770 9.7020
23 ……. ……. ……. ……. ……. 1.0360 6.3610 8.8140
24 ……. ……. ……. ……. ……. 1.0280 6.4140 9.5780
25 ……. ……. ……. ……. ……. 1.1540 6.4570 10.7370
26 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4160 6.4070 9.7080
27 ……. ……. ……. ……. ……. 1.7150 6.4670 11.6010
1A1561 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3300 9.9100
1A0761 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4500 5.4700 10.0500
1A1801 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3100 9.9600
1A0201 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3600 10.1800
1A0511 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4700 5.4600 10.1800
1A0811 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4000 10.2800
1A1811 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.3700 10.1300
1A0031 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4500 5.3700 10.0800
1A0641 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4700 5.4900 10.2600
1A0741 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3900 5.2700 9.9800
1A0771 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.4700 10.0300
1A0011 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3500 10.0300
1A0681 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.3500 10.1400
1A0691 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3200 9.9300
1A1631 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3500 10.0000
1A0331 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3600 10.0500
1A0661 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3000 9.9900
1A0711 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3900 5.2900 10.0800
1A0721 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.4200 9.9400
1A0751 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.3300 9.7400
1C3471 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3400 9.9200
1C3831 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4400 10.0600
1C3811 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.4000 10.1300
14
lanjutan Lampiran 3
Nomor Peubah bebas (Spektrum NIRS) Peubah takbebas (Respons)
Sampel λ1 λ2 λ3 ….. λn Eugenol Mentol
Metil
salisilat
1C3801 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.4500 10.2300
1C4261 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.4800 10.0800
1C4111 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3100 10.0000
1C4121 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3300 10.0400
1C3791 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4400 10.2300
1C3781 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3400 10.0700
1C4031 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.4100 10.0700
1C3761 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.4000 10.0100
1C3881 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3200 10.0400
1C3841 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.4500 10.1400
0J9721 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4800 5.3600 9.9100
1A1551 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.4400 10.2100
1A0781 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4800 10.0300
1A1121 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.3700 10.2200
1A1771 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4200 10.1700
1A1581 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3200 9.9000
1A1201 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.3700 10.0400
1A1571 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.3900 10.1300
15
Lampiran 4 Data dan grafik nilai PRESS eugenol, mentol, dan metil salisilat
1. Data nilai PRESS eugenol
Faktor R2 SEC PRESS SECV
Faktor 1 0.143 0.1516 2.2058 0.1602
Faktor 2 0.3219 0.1357 2.0542 0.1546
Faktor 3 0.4702 0.1206 1.4236 0.1287
Faktor 4 0.6157 0.1034 1.1414 0.1152
Faktor 5 0.6842 0.0943 1.0944 0.1128
Faktor 6 0.7841 0.0785 0.746 0.0931
Faktor 7 0.8358 0.0689 0.5803 0.0821
Faktor 8 0.8512 0.066 0.4895 0.0754
Faktor 9 0.8584 0.0648 0.4822 0.0749
Faktor 10 0.8651 0.0636 0.5273 0.0783
Faktor 11 0.8821 0.0599 0.6074 0.084
Faktor 12 0.8912 0.058 0.6218 0.085
Faktor 13 0.908 0.0537 0.6728 0.0884
Faktor 14 0.9191 0.0507 0.6642 0.0879
Faktor 15 0.9301 0.0474 0.7255 0.0919
Faktor 16 0.9408 0.044 0.7645 0.0943
2. Grafik nilai PRESS eugenol
16
lanjutan Lampiran 4
3. Data nilai PRESS mentol
Faktor R2 SEC PRESS SECV
Faktor 1 0.5388 0.456 18.901 0.4891
Faktor 2 0.6154 0.4192 16.9265 0.4629
Faktor 3 0.8839 0.2319 6.2581 0.2815
Faktor 4 0.9137 0.2012 4.6088 0.2415
Faktor 5 0.9355 0.1751 4.1203 0.2284
Faktor 6 0.9559 0.1458 2.9195 0.1922
Faktor 7 0.9606 0.1388 2.2737 0.1697
Faktor 8 0.9659 0.13 2.1832 0.1662
Faktor 9 0.9732 0.1161 1.8709 0.1539
Faktor 10 0.9787 0.1044 2.0147 0.1597
Faktor 11 0.9808 0.0997 2.0327 0.1604
Faktor 12 0.985 0.0888 2.3638 0.173
Faktor 13 0.9868 0.084 2.49 0.1775
Faktor 14 0.9893 0.0763 2.6741 0.184
Faktor 15 0.9906 0.072 2.878 0.1909
Faktor 16 0.9919 0.0672 3.055 0.1966
4. Grafik nilai PRESS mentol
17
lanjutan Lampiran 4
5. Data nilai PRESS metil salisilat
Faktor R2 SEC PRESS SECV
Faktor 1 0.6014 0.7247 40.7506 0.7371
Faktor 2 0.831 0.4751 19.3365 0.5078
Faktor 3 0.8738 0.4134 15.8261 0.4594
Faktor 4 0.8796 0.4067 13.8619 0.4299
Faktor 5 0.8913 0.3893 13.5974 0.4258
Faktor 6 0.9005 0.3751 13.854 0.4298
Faktor 7 0.9098 0.3599 16.3679 0.4672
Faktor 8 0.92 0.3414 16.5219 0.4694
Faktor 9 0.9322 0.3167 18.1416 0.4918
Faktor 10 0.9394 0.3017 18.8636 0.5015
Faktor 11 0.9484 0.2807 19.6363 0.5117
Faktor 12 0.9582 0.2545 21.1569 0.5311
Faktor 13 0.9638 0.2387 22.4458 0.5471
Faktor 14 0.9682 0.2257 21.444 0.5347
Faktor 15 0.972 0.2136 21.9123 0.5405
Faktor 16 0.9746 0.2052 24.1636 0.5676
6. Grafik nilai PRESS metil salisilat
18
Lampiran 5 Data prediksi eugenol, mentol, dan metil salisilat
Nomor Eugenol Eugenol Mentol Metil salisilat
NIRS GC NIRS GC NIRS GC
1 1A1541-1 1.427 1.440 5.366 5.410 9.819 10.020
2 1A0501-1 1.410 1.490 5.397 5.460 9.929 10.200
3 1A1181-1 1.452 1.430 5.460 5.400 10.119 10.080
4 1A0791-1 1.426 1.430 5.394 5.490 10.122 10.040
5 1A0651-1 1.430 1.470 5.423 5.460 10.230 10.220
6 1A1151-1 1.425 1.420 5.459 5.390 10.168 10.080
7 1A1101-1 1.431 1.430 5.473 5.360 10.214 10.200
8 1A1171-1 1.433 1.410 5.472 5.380 10.166 10.060
9 1A1161-1 1.452 1.420 5.414 5.440 10.124 10.160
10 1A0671-1 1.401 1.430 5.348 5.390 10.112 10.200
11 1A1141-1 1.423 1.430 5.423 5.390 10.158 10.260
12 1A1131-1 1.445 1.430 5.447 5.360 10.196 10.210
13 1A1211-1 1.442 1.440 5.439 5.400 10.039 10.280
14 1A0801-1 1.453 1.430 5.408 5.470 10.144 10.020
15 1A1111-1 1.433 1.440 5.461 5.380 10.058 10.250
16 1A1191-1 1.445 1.420 5.466 5.410 10.085 10.080
17 1A1231-1 1.439 1.410 5.383 5.360 10.031 10.030
18 1A1531-1 1.434 1.420 5.514 5.400 10.160 10.080
19 1A0021-1 1.412 1.460 5.282 5.340 9.855 10.140
20 1A1241-1 1.442 1.420 5.403 5.310 9.944 10.060
21 1B2361 1.423 1.440 5.440 5.460 9.684 10.200
22 1B2331 1.430 1.420 5.475 5.450 10.194 10.180
23 1B2351 1.445 1.430 5.317 5.380 10.308 10.060
24 1B2601 1.455 1.410 5.418 5.420 10.165 10.140
25 1B2341 1.438 1.420 5.421 5.400 10.049 10.060
26 1B1961 1.434 1.420 5.416 5.300 9.989 10.090
27 1B2151 1.419 1.410 5.205 5.210 10.203 10.070
28 1B1951 1.435 1.410 5.439 5.320 10.162 10.130
29 1B2281 1.430 1.420 5.471 5.360 10.229 10.080
30 1B2161 1.428 1.420 5.518 5.410 10.160 10.000
31 1A1821 1.407 1.400 5.333 5.250 9.924 9.960
32 1B1881 1.397 1.430 5.346 5.350 10.042 10.140
33 1B1891 1.408 1.410 5.402 5.300 10.155 10.040
34 1B2291 1.422 1.420 5.481 5.410 10.232 10.090
35 1B2131 1.420 1.430 5.453 5.390 10.214 10.110
36 1B2621 1.435 1.420 5.575 5.400 10.228 10.070
37 1B2631 1.423 1.420 5.286 5.450 9.975 10.140
19
lanjutan Lampiran 5
Nomor Eugenol Eugenol Mentol Metil salisilat
NIRS GC NIRS GC NIRS GC
38 1B2371 1.426 1.420 5.508 5.410 10.201 10.130
39 1B2611 1.414 1.410 5.441 5.410 10.099 10.120
40 1B2591 1.395 1.420 5.442 5.340 10.036 9.890
41 1B2621 1.404 1.420 5.424 5.400 9.911 10.070
42 1B2321 1.388 1.410 5.313 5.340 10.179 10.030
43 1B2141 1.435 1.420 5.539 5.390 10.281 10.130
44 1B2381 1.425 1.410 5.394 5.330 10.215 10.020
45 1B2811 1.408 1.430 5.403 5.370 9.894 10.120
46 1B2641 1.427 1.430 5.537 5.570 10.403 10.220
47 1B2841 1.435 1.440 5.549 5.420 10.279 10.270
48 1B2651 1.436 1.420 5.504 5.460 10.179 10.050
49 1B2781 1.412 1.440 5.429 5.320 9.981 10.080
50 1B2771 1.417 1.440 5.369 5.410 10.095 10.130
51 1B2801 1.429 1.420 5.351 5.390 10.036 10.080
52 1B2791 1.460 1.440 5.388 5.380 10.220 10.210
53 1B2761 1.426 1.410 5.479 5.470 10.304 10.140
54 1B3121 1.436 1.420 5.425 5.350 10.067 10.080
55 1B2831 1.425 1.440 5.367 5.390 10.149 10.220
56 1B2821 1.440 1.430 5.346 5.430 10.283 10.250
57 1B3111 1.434 1.430 5.305 5.350 10.117 10.070
58 1C3351 1.434 1.400 5.484 5.370 10.283 10.040
59 1C3231 1.426 1.410 5.373 5.300 10.116 9.920
60 1C3391 1.429 1.440 5.340 5.350 10.090 10.130
61 1C3381 1.408 1.430 5.304 5.350 9.998 10.130
62 1C3211 1.447 1.440 5.559 5.330 10.320 10.120
63 1C3241 1.431 1.410 5.417 5.340 10.056 10.060
64 1C3221 1.440 1.420 5.468 5.320 10.231 10.060
65 1C3361 1.444 1.420 5.384 5.310 10.112 10.020
66 1C3881 1.420 1.420 5.360 5.320 10.161 10.040
67 1C3841 1.407 1.410 5.415 5.450 10.152 10.140
68 1C4141 1.408 1.420 5.276 5.360 10.040 10.030
69 1C3871 1.399 1.400 5.360 5.320 10.079 9.920
70 1C3371 1.431 1.440 5.349 5.410 9.913 10.090
71 1C3771 1.413 1.430 5.456 5.330 10.169 10.090
72 1C3821 1.407 1.420 5.315 5.440 10.086 10.210
73 1C4271 1.433 1.430 5.413 5.410 10.285 10.040
74 1C4181 1.408 1.430 5.510 5.400 10.137 10.060
20
lanjutan Lampiran 5
Nomor Eugenol Eugenol Mentol Metil salisilat
NIRS GC NIRS GC NIRS GC
75 1C4171 1.450 1.440 5.600 5.450 10.322 10.140
76 1C4161 1.414 1.440 5.390 5.410 10.157 10.070
77 1C4151 1.438 1.450 5.306 5.410 10.040 10.030
78 1C4281 1.425 1.420 5.431 5.360 10.196 10.010
79 1C4291 1.443 1.430 5.536 5.380 10.187 10.040
80 1C4301 1.407 1.420 5.384 5.360 9.982 10.000
81 1D4601 1.422 1.450 5.405 5.370 10.185 9.990
82 1D4611 1.411 1.410 5.413 5.310 10.153 9.960
83 1D4631 1.403 1.430 5.350 5.460 10.240 10.030
84 1C3811 1.418 1.410 5.487 5.400 10.108 10.130
85 1C3781 1.441 1.420 5.554 5.340 10.280 10.070
86 1A1221 1.410 1.420 5.462 5.350 10.222 10.040
87 1D4621 1.393 1.430 5.332 5.480 10.081 10.070
88 1C4121 1.454 1.430 5.616 5.350 10.096 10.040
89 1D4691 1.402 1.430 5.509 5.390 10.266 9.920
90 1D4701 1.408 1.470 5.341 5.340 10.168 9.980
91 1D4731 1.402 1.420 5.367 5.360 10.078 10.040
92 1C3761 1.451 1.420 5.279 5.400 10.158 10.010
93 1C3831 1.432 1.430 5.483 5.440 10.142 10.060
94 1C4261 1.382 1.440 5.458 5.480 9.974 10.080
95 1D5101 1.409 1.420 5.355 5.480 10.164 10.020
96 1C3471 1.426 1.420 5.388 5.340 10.150 9.920
97 1C4111 1.429 1.420 5.458 5.310 10.059 10.000
98 1C4131 1.411 1.430 5.533 5.380 10.094 10.060
99 1C3801 1.419 1.410 5.425 5.450 10.078 10.230
100 1C3791 1.423 1.430 5.386 5.440 9.948 10.230
Contoh perhitungan:
√( ) ( ) ( )
√( ) ( ) ( )
21
Lampiran 6 Data SEL eugenol, mentol, dan metil salisilat
Sampel Eugenol Mentol Metil salisilat
Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 1 Ulangan 2
1 1.6545 1.6680 6.3465 6.4030 11.3570 11.4525
2 1.1615 1.1745 5.7750 5.8010 8.9840 9.0315
3 1.4035 1.3860 5.3155 5.3250 9.7420 9.6380
4 1.4340 1.4280 4.2655 4.2330 7.3155 7.2435
5 1.2970 1.3000 3.8865 3.8820 10.3805 10.3995
6 0.9670 0.9775 3.7245 3.7425 6.9295 6.9525
Contoh Perhitungan:
√( ) ( ) ( )
= 0.012
Lampiran 7 Kriteria nilai SEP dan R2
1. Kriteria nilai SEP
SEP Kriteria
1–1 .5 SEL Presisi sangat baik
2–3 SEL Presisi baik
4 SEL Presisi menengah
5 SEL Presisi rendah
Sumber: Cuadrado et al. 2004
2. Kriteria nilai R2
R2 Kriteria
≥ 0.90 Presisi sangat baik
0.70–0.89 Presisi baik
0.59–0.69 Pemisahan yang baik di antara nilai rendah, tengah, dan tinggi
0.30–0.49 Pemisahan yang baik di antara nilai rendah dan tinggi
0.05–0.29 Lebih baik daripada tidak menganalisis
Sumber: Cuadrado et al. (2004)
Lampiran 8 Data akurasi
Zat aktif Konsentrasi
Minimum
Konsentrasi
Maksimum
Kisaran SEP SD Kisaran
/SEP
RPD
Eugenol 0.970 1.719 0.749 0.019 0.174 39.421 9.157
Mentol 3.765 6.485 2.720 0.090 0.699 30.222 7.768
Metil salisilat 6.3570 11.633 5.276 0.145 1.223 36.386 8.435
Contoh perhitungan:
22
Lampiran 9 Data uji presisi
1. Data uji keterulangan
Sampel Eugenol (%) Mentol (%) Metil salisilat (%)
P1 1.4052 5.5024 10.2601
P2 1.4014 5.3961 10.1891
P3 1.4131 5.4479 10.2268
P4 1.4158 5.4181 10.2479
P5 1.4139 5.4836 10.2537
P6 1.4056 5.3790 10.1624
P7 1.3996 5.5020 10.2176
P8 1.4132 5.4516 10.1923
P9 1.4163 5.4379 10.2118
P10 1.4117 5.4505 10.2437
P11 1.4141 5.4451 10.2461
P12 1.4209 5.4393 10.2488
P13 1.4270 5.4231 10.2035
23
lanjutan Lampiran 9
2. Data uji presisi intermediet
No Eugenol Mentol Metil salisilat
Analis A Analis B Analis A Analis B Analis A Analis B
1 1.4052 1.4172 5.5024 5.3549 10.2601 10.2546
2 1.4014 1.4157 5.3961 5.3858 10.1891 10.2717
3 1.4131 1.4230 5.4479 5.3224 10.2268 10.2088
4 1.4158 1.4141 5.4181 5.3642 10.2479 10.1920
5 1.4139 1.4250 5.4836 5.4246 10.2537 10.2267
6 1.4056 1.4293 5.3790 5.3833 10.1624 10.2313
7 1.3996 1.4221 5.5020 5.3302 10.2176 10.1864
8 1.4132 1.4042 5.4516 5.3781 10.1923 10.2185
9 1.4163 1.4103 5.4379 5.3856 10.2118 10.1737
10 1.4117 1.4129 5.4505 5.3509 10.2437 10.1609
11 1.4141 1.4124 5.4451 5.3339 10.2461 10.1380
12 1.4209 1.4044 5.4393 5.4083 10.2488 10.2137
13 1.4270 1.4194 5.4231 5.4124 10.2035 10.2021
3. Data uji statistika presisi intermediet
Zat Aktif Uji F
Kesimpulan F Hitung F Tabel
Eugenol 0.9787 2.6870 Tidak berbeda nyata
Mentol 0.6862 2.6870 Tidak berbeda nyata
Metil salisilat 0.4965 2.6870 Tidak berbeda nyata
