APLIKASI MEMBRAN DALAM PEMEKATAN ENZIMGLUKOAMILASE

Syahrll A.*, Nana S.**, L.Z. Udin*, A. Sldik**,dan A. T. Karossl"

* Puslitbang Kimia Terapan - L1PI, Jalan Cisitu, Bandung** FMIPA, Jurusan Kimia-UNPAD, Bandung

INTISARIPembuatan enzim glukoamllase dengan bahan dasar tepung sagu dan bungkil

kedele sudah dilakukan secara [ermentasi curah. Pemekaian enzim dllakukan dengan.menggunakan proses ultrafiltrasi; dimana membran polisulfon digunakan sebagaimedia penyaring. Membran yang digunakan dalam percobaan ini dibuat dari bohanpolisulfon dengan beberapa macam perlakuan; seperti temperatur pengkoagulasiandon komposisi; disamping isu juga diamati pengaruk pelarut serta aditif yangberbeda: Dari hasil pengamatan selama proses [ermentasi dalam pembuasan enzim;ternyata pH larutan berubah - ubah selama berlangsungnya proses [ermentasi mulaihari pertama sampai hari Ice sepuluh, namun secara menyeluruh dapa: dikatakanbahwa pH akan naik dengan bertambahnya waktu [ermentasi. Aiuifaas enzimtertinggi terlihat pada hari [ermentasi Ice 6 yaitu sebesar 2,908 Vlml, don pada hariberikutnya terjadi penurunan, Kadar protein yang didapai berfluktuasi dari htirikehari tetapi harga terbesar diperoleh pada hari Ice 10 yaisu 3,102 mglml. Aksifisasenzim spesifik yang tertinggi terlihat pada hari Ice 6 yaau sebesar 1495,8 U1gprotein. Membran yang terbaik untuk pemekatan enzim secara ultrafiltrasi adalahyang dibuat dengan menggunakan pelarut dimetiJasetamid diu! aditifpolivinilpirrolidon dengan /coeflSienrejeksi diatas 90 % dan harga j/uks sebesar20,5711m2.jam.

ABSTRACTPreparation of glucoamylase enzyme by [ermentation of sago and soy bean

meals had been done. Enzyme concentration was carried out by ultrafiltrationprocess, wherepolysulfone membranes were used as medium [ilter. Membranes usedin this experiment were prepared with several treatments, such as coagulationtemperature and composition and beside that effect of solvent and additive are alsoobserved-From the results of the observation during fermentation process in enzymepreparation, its clear that pH of solution changed in that pH increased wilhincreasing fermentation time. The highest enzyme activity was shown on the sixth dayof fermentation namely 2.908 Vlml with a specific enzyme activity of 1495.8 U1gprotein. There is fluctuation in protein content during [ermenuuion process, but thehighest level was obtained on the tenth day [ermenuuion (3.102 mg/l). The highestspecific enzyme activity was shown on the sixth day fermenuuio» (1495.8 U1gprotein). The best membrane for the enzyme concentration by ultrafiltration processin this experiment are found form the membrane prepared from dimethyl acetamideas solvent and polyvinylpyrrolidane as additive. This membrane gave rejectioncoefficient of more than 90 % andflux as much as 20.571Im2.hour.

PENDAHULUANEnzim merupakan produk hasil olahan fermentasi yang

penggunaannya saat ini sangat bervariasi baik dalam pengolahanmakanan maupun untuk keperluan lainnya. Misalnya dalam peng-olahan makanan dipakai pada pembuatan keju, saus, roti, selainitu enzim juga digunakan dalam industri tekstil, kulit dan detergen(1). Dalam pengolahan bahan makanan enzim dapat digunakansebagai katalis untuk memperoleh makanan yang rendah kalori,lemak, serta kolesterol (2), dan disamping itu enzim juga ber-fungsi untuk memperpanjang masa simpan makanan tertentu (3).Enzim yang baru diperoleh dari hasil fermentasi ini masihmerupakan enzim kasar yang banyak mengandung senyawa-

JKTI VOL-3 No.1 Junl1993

senyawa yang bermolekul rendah yang tidak diperlukan, sepertigaram-garam atau senyawa lain (4,5). Faktor yang mempengaruhibiaya produksi enzim antara lain ditentukan oleh eara yangdigunakan dalam memproses enzim tersebut dan tingkat kemurni-an enzim yang diinginkan (6). Penggunaan membran untukmaksud pemekatan dan pemurnian hasil olahan fermentasi inisudah dimulai sejak tahun 1970 yaitu dengan menggunakansistem ultrafiltrasi (7). Banyak eara untuk pemisahan senyawayang berat molekulnya rendah dengan senyawa yang beratmolekulnya lebih tinggi, tetapi sekarangeara Uftra}iltrasimenem-pati urutan pertama karena tidak merusak senyawa yang adadidalamnya (7). Proses ultrafiltrasi dapat digunakan untuk sterili-sasi ~,9) dan pemekatan polisakarida hasil fermentasi karbohidrat(10).

Menurut .Sullivan (4), enzim mempunyai berat molekul yangberkisar antara 20.000 sampai dengan 200.000 dalton, sedangkanmembran ultrafiltrasi mempunyai ukuran "molecular weight cut-off" (MWCO) antara 10.000 sampai dengan 300.000 dalton danmembran dengan ukuran MWCO 10.000 yakni membran yangmempunyai koefisen rejeksi terhadap senyawa yang bermolekul10.000 sebesar 90 % atau lebih, cocok digunakan dalam peme-katan enzim.

Percobaan ini bertujuan untuk meneari kondisi optimumdalam pembuatan enzim glukoamilase, dan membuat membranyang sesuai untuk proses pemekatannya. Kegiatan dibagi tigatahap yaitu tahap pertama pembuatan enzim, tahap keduapembuatan dan karakterisasi membran dan tahap ke tigapemekatan enzim dengan proses ultrafiltrasi. Parameter yangdiamati pada pembuatan enzim diantaranya yaitu, perubahan pHserta aktifitas enzim selama berlangsungnya proses fermentasi.Dalam percobaan proses ultrafiltrasi dipilih membran yang tepatdalam proses pemekatan enzim tersebut ditinjau dari fluks dankoefisien rejeksinya. Pengujian koefisien rejeksi membran dilaku-kan dengan beberapa macam larutan dekstran yang berbeda beratmolekulnya dan larutan Bovin Serum Albumin (BSA).

BAHAN DAN PERALATANBahan untuk pembuatan enzim

Pati sagu jenis metroxylon dan tepung bungkil kedelediperoleh dari pasar Bandung. K2HP04, MgS04.7H20, Ka,FeS04·7H20 dan aquades. Kapang Rhizopus oryzae yang dita-narnkan dalam potato dekstrose agar digunakan sebagai inokulumpada proses fermentasi.

21

Bahan untuk pembuatan membran

Membran dibuat dengan bahan dasar polimer polisulfon (PS)Udel (Aldrich) dengan berat molekul (BM) 30.000, pelarutdimetilformamid (DMF) (Merck) dan pelarut dimetilasetamid(DMAc). Sebagai aditif digunakan polietilenglikol (PEG) ataupolivinilpirrolidon (PVP). Bahan untuk karakterisasi membranyaitu dekstran dengan BM 38.900, 66.700, 87.000, 162.000 dan266.000 dan disamping itu juga digunakan BSA. Semua bahanyang digunakan adalah murni (p.a.).

Peralatan yang dlgunakan

Enzim dibuat dalam fermentor (LKB) yang berkapasitas 4 Lsecara sistem curah. Untuk pembuatan membran dibutuhkanerlemeyer, neraca analitik, plat kaca, batang stainless steel, danbak koagulasi. Untuk karakterisasi membran diperlukan -peralatankompressor, stirred sel (Ami con) model 8200, spektrophotometerdan alat-alat gelas lainnya.

PERCOBAAN

Pembuatan enzlm

Media fermentasi dalam pembuatan glukoamilase ini terdiridari (g/l) ; tepung sagu 20; tepung bungkil kedele 7,07; maltekstrak 3% 30 (ml); KH2P04 1; MgS04.7HzO 0,5; KG 0,05;FeS04• 7HzO 0,01. pH media diatur sehingga mencapai 4,5.Setelah disterilisasi, media diinokulasi pada suhu 30 ± 1°C, danaerasi 4,5 - 6 l./menit. Agitasi dilakukan dengan Corning HotPlate Stirrer pada skala 6. Percobaan dilakukan pada skalafermentor 4 L. Pengamatan dilakukan terhadap perubahan pHmedia selama fermentasi berlangsung, aktifitas glukoamilase yangdihasilkan, pati tersisa dalam media fermentasi dan biomasa padaakhir fermentasi.

Analisa

Aktifitas glukoamilase di tentukan dengan menggunakanmetoda Ueda (11) yang telah dimodifikasi. Unit aktifitasditentukan setelah membandingkan dengan glukoamilase standar(SIGMA). Kandungan protein enzim ditentukan dengan metodaLowry (12), digunakan untuk mendapatkan aktifitas spesifikenzim. Pati tersisa dalam media ditentukan berdasarkan metodaNelson-Somogy setelah dihidrolisa oleh asam (13). Pengukuranbiomassa dilakukan secara gravimetri setelah pencucian oleh air

dan penyimpanan pada 700C (14).

Pembuatan membran

Membran dibuat dengan cara sebagai berikut :

I, Polimer polisulfon dan aditif poli etilen glikol dilarutkandalarn dimetil formamida dengan komposisi:a. 12 % PS, 88 % DMF·b. 12 % PS, 85 % DMF dan 3,0 % PEG.c. 15 % PS, 80 % DMF dan 4,5 % PEG.

Semua membran dikoagulasikan dalam air pada temperaturkamar ( :!: 26°C).

22

II. Polimer polisulfon dan aditif polivinilpirolidon dilarutkandalam dimetil asetamid dengan komposisi: 16,75 % PS, 81,S% DMAc dan 1,68 % PVP. yang dikoagulasikan dalam airpada temperatur kamar (25°C), temperatur 40°C dan dalamair es ( sekitar 5°C).

Polimer dilarutkan selama semalam sambi! diaduk denganmenggunakan pengaduk magnetik dan dibiarkan semalam sebe-lum dicetak. Pembentukan film dilakukan diatas plat kaca denganbantuan batang stainless steel. Lapisan film yang terbentukdikoagulasikan dalam air sesuai dengan temperatur yang diamati(pada percobaan ini yaitu 5, 2S dan 40°C). Membran yang didapatdirendam dalam air untuk menyempurnakan koagulasi selamalebih kurang 15 jam dan kemudian membran siap untuk ditesdengan larutan dekstran dan albumin.

Pengujlan membran

Membran diuji dengan menggunakan stirred sel (Amicon)dengan luas permukaan efektif membran 28,7 cmz dan volume200 ml, Pengujian dilakukan terhadap larutan dekstran yangberbeda berat molekulnya dan juga terhadap larutan BSA.Parameter yang diamati adalah besarnya fluks air, fluks larutandekstran, fluks larutan BSA dan besarnya koefisien rejeksi darikedua jenis larutan tersebut. Untuk mengetahui besarnya koefisienrejeksi dari membran, maka pada setiap permeat dan retentatdianalisa kandungan protein atau kadar gula dengan alatspektrophotometer. Membran yang dianggap baik, digunakanuntuk pemekatan enzim glukoamilase. Kondisi operasi sepertitemperatur dan tekanan, diatur sesuai dengan percobaan yang akandiamati. Pada percobaan ini temperatur operasi yang diamati yaitu10, 15, 20 dan 2S°C; sedangkan tekanan operasi berkisar dari 1sampai dengan 4 kg/cmz.

Besarnya fluks dihitung berdasarkan jumlah permeat yangdihasilkan persatuan luas membran dalam satuan waktu tertentusetelah tercapainya keadaan mantap (steady state), sedangkankoefisien rejeksi dihitung berdasarkan rumus :

Cr- CpR = --xlOO%

Cr

dimana:

RCpCr

= koefisien rejeksi (%)= konsentrasi zat terlarut dalam permeat

konsentrasi zat terlarut dalam retentat

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada Gambar 1 dan 2 dapat dilihat perubahan yang terjadiselama berlangsungnya proses fermentasi pembuatan enzim mulaihari pertama sampai dengan hari ke 10. Pada kurva ini terlihatadanya perubahan pH selama proses fermentasi, dimana pada saatawal terjadi penurunan sampai hari ke 3, sedangkan pada hariselanjutnya terjadi kenaikan. Ini disebabkan karena pada tahapawal hasil utama dari metabolisme kapang adalah senyawa-

JKTI VOL-3 No.1 Junl1993

8 I.

opH A Protein~

6 EE

ctN

"0 C••• 2 <IIE c:J: ~a.

0L-

2 a.L-

et"00~

°0 02 4 £) 8 10 12

Woktu fermentasi (hari )

Gambar 1. Perubahan pH media dan kadar protein gluko-amilase R. oryzae selama proses fermentasi

4r----------------------------------,4 ~•••oL-a.C'I

E:3

oAkt. enzim bAkt. spesifik enzim

~:::IE

~ 2II>CIIe..-..-~

00~~~--~~--~--~--~~--~o..2 I, 6 8 10 12;:

Wuhttl f~rt'Ml'lt~l t had } <t

Gambar 2. Aktifitas dan aktifitas spesifik glukoamilaseR.oryzae.

senyawa asam, kemudian asam ini digunakan oleh kapang untukpertumbuhan sehingga pH naik kembali. Aktivitas enzim yangdidapat berfluktuasi mulai hari pertama sampai hari ke-lO, dim anaaktivitas enzim tertinggi didapat pada hari ke-6 yaitu sebesar2,908 U/m!. Aktivitas spesifik enzim pada hari ke-6 memper-lihatkan angka yangtertinggi, yaitu sebesar 1,4958 U/mg denganbiomassa sebesar 3,6 gIL (berat kering). Kandungan proteintertinggi diperoleh pada hari ke-lO yaitu sebesar 3,102 mg/ml,

Hasil pengujian membran yang dibuat dengan pelarut DMFdan aditif PEG mempunyai harga koefisien rejeksi yang rendahsekali dan harga fluks yang besar. Ini disebabkan karena membranyang dibuat dengan pelarut ini menghasilkan membran yangberpori lebih besar sehingga tidak cocok digunakan untukpemekatan enzim. Oleh sebab itu untuk pengerjaan selanjutnyadalam pemekatan enzim hanya dilakukan untuk membran yangdibuat dengan pelarut DMAc dan aditif PVP, karena membran inimemberikan koefisien rejeksi yang cukup tinggi terhadap larutanBSA dan dekstran yang dipakai.

Pada Gambar 3 dapat dilihat fluks air dari membran yangdibuat pada temperatur koagulasi yang berbeda. Ternyata semakinrendah suhu air pengkoagulasi, maka akan semakin besar hargafluks yang diperoleh. lni menunjukkanjumlah pori membran yangterbentuk lebih banyak disaat pengkoagulasian pada temperaturrendah dengan ukuran pori yang lebih halus.

JKTI VOL·3 No.1 Junl1993

1150N'

E<,

~100

200,----------------------------.

50

10 20 30 40 50Temperatur koagulasi (DC)

Garnbar 3. .Pengaruh temperatur koagulasi terhadap fluks airmembran, pada tekanan operasi 3 kg/cm2 dantemperatur operasi 250C.

Pada Gambar 4 dan 5 dapat dilihat hubungan antara fluks danrejeksi membran terhadap berbagai ukuran berat molekul larutandekstran. Pengkoagulasian membran pada air yang bersuhu

200,---(.------------------------,

~150Ect.~

o Fluks (5 DC).6. Fluks (25DC)D FIuks (40DC )

°O~------~--------~--------~100000 200000 3000008M Outran

Gambar 4. Pengaruh berat molekul dextran terhadap fluks, pada

tekanan operasi 3 kg/cm2, temperatur operasi 25°C,konsentrasi umpan 1%.

o Rl'jl'ksi (5 DC)

b Rejeksi (25DC)tI Rejeksi (40 DC)

°0~~~~1~00~0~070----~20~0~0700~----~3~~0I3tv1 Dext ran

Gambar 5. Pengaruh berat molekul dextran terhadap rejeksi,pada tekanan operasi 3 kg/cm2, temperatur operasi250C, konsentrasi umpan 1%.

23

80

20

rendah, ternyata memberikan harga fluks .dan rejeksi yang lebihtinggi dibandingkan dengan membran yang dibuat pada airpengkoagulasi yang bersuhu lebih tinggi. Hal ini menunjukkanbahwa pengkoagulasian membran pada suhu rendah dapatmemperkecil ukuran pori membran tersebut, ini terbukti dengansemakin tingginya koefisien rejeksi membran, sedangkan jumlahpori yang terbentuk akan semakin banyak, karena terlihat adanyakenalkan pada harga fluks, Dengan semakin tingginya beratmolekul dekstran yang dipakai sebagai larutan umpan, makasemakin besar koefisien rejeksi yang diperoleh, tetapi sebaliknyaterhadap harga fluks.

Hasil pengujian membran terhadap larutan BSA sebagaiumpan terlihat pada Gambar 6 dan 7. Pada Gambar 6 dapatdilihat bahwa untuk tercapainya keadaan mantap dalam proses

300o Ftuks (5°C)A FIuks (25°C)

250 D Ftuks (400C).-E.S!. 2001..••..

160III~

100::ILL.. 6 .6 A A

50~ -<l C C

00 10 20 30 40 SOWaktu opt'fasi ( menit l

Gambar 6. Pengaruh waktu operasi terhadap fluks dari tarutan

BSA, pada temperatur operasi zs=c, tekanan operasl3 kg/cm2 dan konsentrasi umpan 1%.

ultrafiltrasi dibutuhkan waktu beberapa saat yaitu ditandai denganstabilnya fluks yang dihasilkan. Dalam percobaan ini keadaanmantap tersebut dicapai setelah proses ultrafiltrasi berjalan selamalebih kurang 20 menit. Gambar 7 memperlihatkan bahwa

110..----------------,

100•....~•-1/1 90.xCII.-.,IX

eo o Rejt'ksi (SOC)

A Rej.ksi (25·C)D R.jt'ksi ''0 DC)

700 10 20 30 ~ 60

Waktu op.fasi (m.nlt)

Gambar 7. Pengaruh waktu operasi terhadap rejeksi dari larutanBSA, pada temperatur operasi zs=c, tekanan opera-si 3 kg/cm2 dan konsentrasi umpan 1%.

24

membran yang dibuat pada temperatur koagulasi rendah memberi-kan koefisien rejeksi yang tinggi terhadap larutan albumin yaitumendekati 100 % setelah beroperasi selama 40 menit.

Hasil pemekatan enzim dengan membran (pengkoagulasianpada suhu rendah) dapat dilihat pada Gambar 8 dan 9.

3O~-----------------------.~i- 95;:•...•

LL..

100L---~--~---~----80~-~100~20 40 60Waktu epercsi (mt'nit)

Gambar 8. Fluks dan rejeksi selama operasi pemekatan enzim.

Membran dikoagulasikan dalam air es (S°C), tekan-an operasi 3 kgzcm? dan temperatur operasi io=c

3r-----------------------------~~3 co Akt. enzimA Akt. spesifik enzim

.,-o•..a.2(

::I

E•••c.,'iji.,a.1/1

~~---2~0----~~--~~~---80~--~10~~Waktu operasi (menit )

Gambar 9. Pengaruh waktu operasi terhadap aktifitas enzimdalam pemekatan enzim. Membran dikoagulasikan

dalam air es (S°C), tekanan operasi 3 kg/cm2 dan

temperatur operasi lOoe.

Terlihat adanya sedikit penurunan fluks sampai pengoperasian 90menit, sedangkan kandungan protein dalam retentat meningkat.Aktivitas enzim dan aktivitas enzim spesifik terus bertambahselama berlangsungnya proses ultrafiltrasi. Ini menunjukkanbahwa aktivitas enzim masih dapat ditingkatkan sampaididapatkan kondisi optimum dimana aktivitas enzim tidakbertambah lagi dengan bertambahnya waktu operasi.Pada Tabel 1 terlihat pengaruh temperatur operasi terhadappemekatan enzim. Dengan semakin naiknya temperatur operasimaka akan terjadi penurunan aktivitas enzim dan aktivitas enzimspesifik, sedangkan koefisien rejeksinya akan terus naik. Hal inimenunjukkan bahwa operasi pada temperatur tinggi akan

JKTI VOL-3 No.1 Junl1993

menimbulkan kerusakan pada enzim, sedangkan kenaikankoefisien rejeksi mungkin disebabkan terjadinya perubahan sifatdari protein dalam enzim tersebut setelah enzim mulai rusak,seperti denaturasi atau penggumpalan protein yang dapatmembentuk lapisan pada permukaan membran.Pengaruh tekanan operasi terhadap hasil pemekatan enzim denganproses ultrafiItrasi ini dapat dilihat pada tabel 2.

Tabell. Pengaruh temperatur operas! terhadap pemekatanenzlm secara ultraflltrasl,

Temp. Fluks Koefisien Aktivitas Aktivitas(0C) (1/m2.jam) rejeksi (%) enzim (VIm I) spesifik (V Img)

5 10,74 82,50 3,3796 1,130515 20,14 83,55 3,1185 1,549020 20,14 91,54 1,6731 0,777725 48,07 90,30 1,5000 0,6521

Catatan:Tekanan tetap 1 kglcm2

Aktivitas enzim awal 1,2093 U/mlFaktor pemekatan 10 X

Tabel 2. Pengaruh tekanan operas! terhadap basil pemekatanenzlm.

Tekanan Flukskg/em? (1/m2.jam)

Koefisienrejeksi (%)

Aktivitas Akrivitasenzim (Vlml) spesifik(V/mg)

48,0773,8483,5193,32

6,5136,4106,3045,995

1234

92,390,392,692,8

2,332,271,681,62

Catatan:Faktor pemekatan 10 xAktivitas enzim awal 2,07 U/mlTemperatur operasi = temperatur kamar.

Kenaikan tekanan operasi dalam proses ultrafiItrasi temyata dapatmeningkatkan f1uks sedangkan terhadap koefisien rejeksi tidakbegitu berpengaruh, tetapi aktivitas enzim terlihat menurun padatekanan operasi 4 kg/cm-', setelah memperlihatkan harga konstansampai tekanan 3 kg/cm2. Aktivitas enzim spesifik terlihatmenurun pada tekanan operasi 3 dan 4 kg/cm-. Tekanan yangterlalu tinggi dapat munurunkan aktivitas enzim maupun aktivitasspesifik enzim itu sendiri.

KESIMPULAN

Dari beberapa membran yang dicoba untuk pemekatan enzimtemyata membran yang dibuat dengan komposisi 16,75 % PS,81,57 % DMAc dan 1,68 % PVP memberikan hasil yang terbaikuntuk pemekatan enzim. Temperatur koagulasi yang terbaik yaitu

JKTI VOL-3 No.1 Junl1993

sekitar 5°C. Proses ultrafiltrasi sebaiknya dilakukan padatemperatur serendah mungkin, karena pada temperatur yang tinggiterjadi penurunan aktifitas dari enzim tersebut. Tekanan operasisebesarZ kglcm2 cocok untuk pemekatan enzim dilihat dari hargaf1uks yang cukup besar, begitu juga terhadap harga aktifitas enzimdan koefisien rejeksinya. Pemekatan enzim yang dilakukan dalampercobaan ini merupakan proses ultrafiltrasi secara sistem bacthdan proses ini dapat meningkatkan aktifitas enzim lebih dari 3 kaliaktifitas enzim awal dengan faktor pemekatan 10 kali.

DAFfAR PUSTAKA

1. J.D. Dziezak, Enzymes: Catalysts for Food Processes. FoodTech. pp. 78 " 85 (1991).

2. A Gross, Enzymatic Catalysis in the Production of NovelFood Ingredients, Food Tech. pp. 96 - 99 (1991).

3. H.K. Nielsen, Novel Bacteriolytic Enzymes and CycIodextrinGlycocyl Transferase for the Food Industry. Food Tech. pp.102 - 104 (1991).

4. TJ.O. Sullivan; AC. Epstein; S.R. Korchin and N.C. Beaton.Applications of Ultrafiltration in Biotechnology, CEP., p. 68 -75 (1984).

5. S.L. Neidleman, Enzymes in the Food Industry; A Backwardglance. Food Tech. pp. 88 - 91 (1991)

6. S.c. Penet, New Applications of Industrial Food Enzymo-logy: Economic and Processes. J. Food Tech. Vol 45 (1) p:89-99 (1991).

7. 0.1. Olsen, Membrane Filtration as a Tool in BiotechnicalDown-stream Processing. Desalination, 62, pp. 329-339(1986).

8. G.A Truskey; R. Gabler; A Doleo and T. Manter. The Effectof Membrane Filtration upon Protein Conformation.J. Parenteral Science and Technology, 41(6), pp. 180-183(1987).

9. M. Mulder, Basic Principles of Membrane Technology.K1uer Academic Publishers, London. p. 9 (1991).

10. A Pat; R. Welkins, and R. Gabler, Sterile Filtration underCondition of High Pressure and Bacterial Challenge Levels.J. Parenteral Science and Technology, 41(4), .pp. 117-120(1987).

11. S. Ueda; T. Fukuoda; Mitsue and B.C. Saha. GlucoamylaseProduced by Submerged Culture of A oryzae. Starke. 31(9).pp. 307 - 314 (1979).

12. S.P. Colowick and H.O. Kaplan. Methods in EnzymologyVol. 3 Acad. Press Inc. New York (1957).

13. N. Nelson. A Photometric Adaption of the Somogy Methodfor Determination of Glucose. J. Biol. Chem. 153. pp. 375 -380. (1944) ..

14. AT. Karossi, C. Tjahjadi, R. Dyah and L.Z. Udin,Proceedings Food Conference'88. Food Science andTechnology in Industrial Development. Bangkok, Thailand,24 - 26 October 1988, p. 336 - 398.

25