Analisis Senyawa Nitrogen

download Analisis Senyawa Nitrogen

of 80

description

er

Transcript of Analisis Senyawa Nitrogen

  • ANALISIS SENYAWA NITROGEN

    Asam aminoAmina

    AlkaloidGlikosida sianogenik

    IndolPurin pirimidin dan Sitokinin

    Klorofil

  • Senyawa Nitrogen

    Bobot kering tumbuhan : 40% karbon

    2% nitrogen

    Mula2 tdp dalam bentuk amonia Penambatan N pd akar

    Reduksi enzimatis nitrat yg diserap pucuk daun

  • Sifat Umum

    1. Umumnya bersifat basa membentuk garam dgn asam mineral

    2. Dpt diekstraksi oleh pelarut non polar akan terendapkan dengan penambahan amonia

    3. Banyak yang mempunyai muatan (spt asam amino, amina dan bbrp alkaloid) elektroforesis

    4. Senyawa nitrogen dapat dideteksi dengan : Pereaksi semprot ninhidrin (asam amino dan amina lain)

    Pereaksi dragendorf (alkaloid)

  • ASAM AMINO

  • Sifat Asam Amino

    1. Merupakan senyawa ion tan warna

    2. Larut dalam air (derajat kelarutan berbeda-beda) zwitter ion

    3. Ttk leleh tinggi

    4. Asam amino aromatik (Fenilalanin dan tirosin) kurang larut dalam air

    5. Bersifat basa +HCl p membentuk senyawa hidroklorida, dan krn juga bersifat asam dapat diesterkan

    Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa

  • Asam amino

  • Macam asam amino berdasarkan sifat keasaman dan kebasaannya:

    1. Asam amino netral ggs amino seimbang dengan ggs asam (spt glisin dan fenilalanin)

    2. Asam amino basa mempunyai satu ggs amino bebas (spt lisin)

    3. Asam amino asammempunyai satu ggs asam bebas (spt asam glutamat)

  • Karena adanya perbedaan muatan maka:

    Fraksi netral Campuran asam amino Fraksi basa Elektroforesis/KPI Fraksi asam

  • Klasifikasi asam amino:

    Asam amino Protein

    Asam amino bukan protein

  • Asam amino protein (1)

    Jmlnya beragam tgt kebutuhan metabolisme protein tumbuhan Jml banyak asam glutamat, asam aspartat serta amida asamnya yaitu

    glutamin dan asparagin

    Jml sangat sedikit histidin, triptofan, sistein dan metionin

  • Asam amino protein

  • Asam amino non-protein (2)

    Yang ada dalam setiap tumbuhan asam amino butirat

    Jenis yang tl diketahui + 200 macam

    Perannya dlm tbh tdk begitu nyata ( mungkin tpt menyimpan nitrogen pd proses pengecambahan)

    Kebanyakan strukturnya analog dg salah satu asam amino proteinContoh: analog prolin Asam pipekolat punya satu ggs metilen lebih banyak dari prolin (pd biji

    kacang-kacangan tertentu)

    Asam Azetidin 2-karboksilat kurang satu ggs metilen dari prolin (khas pd suhu Liliaceae)

  • Asam amino non-protein

    asam amino butirat

    Asam pipekolat

  • Pemisahan dan identifikasi:

    1. Kromatografi Lapis Tipis dan Kromatografi Kertas (dilakukan baik satu arah maupun dua arah)

    KKt Bisa langsung dilakukan thd ekstrak EtOH-Air

    KLT Peka thd garam dan gula yg tdp dlm ekstrak kasar, shg :

    Pemurnian dgn damar penukar ion ada kemungkinan sebagian bahan hilang

    Pengunahan asam amino mjd turunan

    dinitrofenilnya (DNP) asam amino + 2,4-

    dinitrofluorobenzen dlm aseton-air kuning Fasa diam : Selulosa, Si-gel atau campuran keduanya Fasa gerak : 1. BAA dan fenol-air KKt dan KLT-Si-gel

    2. CHCl3:MeOH;NH4OH (2:2:1) KLT selulosa mikrokristal

    Deteksi : Pereaksi Ninhidrin Kuantitatif : Spektrofotometer UV-Vis (dari hasil KKt dg pewarnaan

    dan KLT dari DNP)

  • Pemisahan dan identifikasi:

    2. Elektroforesis Tegangan Tinggi dan KLT Cara ini terbaik untuk memisahkan asam amino umum scr tajam

    a. Ekstrak kasar dan pembanding (tionon) ditutulkan pd masing2 ujung pelat yg dilapisi selulosa MN 300, kmd dikeringkan pd suhu kamar

    b. Pelat disemprot dg asam format-dapar asetat pH 2,0 c. Dg sumbu dan pipa dialisis dan kertas Whatman 3MM (dijepit oleh

    potongan gelas), pelat dikembangkan dlam dapar yg sama pd 1000 V

    (10-20 mA) dilakukan dlm bejana Shandon selama 25-35 menit d. Pelat dikeringkan dg ditiup. e. Pita yg telah memisah diperkecil mjd bercak dg mencelupkan pelat, stl

    diputar 90o, dalam air suling. Dikembangkan 2,5 cm. Lalu dikeringkan kembali.

    f. Pelat dikembangkan lagi (pd arah ke 2) dgn pengembang:

    o Metiletilketon-piridina-air-HAc (70:15:15:2) 1,5 jam

    o n-propanol- air-n-propilasetat-HAc-piridina (120:60:20:4:1) 4 jam o Pelat disemprot dg pereaksi ninhidrin-kadmium

  • Pemisahan dan identifikasi:

    3. Kromatografi Gas Cair Asam amino dibuat senyawa turunannya:

    Asam amino + amil Alkohol dan HBr kering + anhidrida as asetat ester N-asetil-n-amil

    Kolom : Chromosorb W (60-80 mesh) bersalut PEG 1%

    (Carbowax 1546 atau 6000) Suhu : 125-155oC Laju aliran : 60-240 ml/menit

    4. KCKT Asam amino dibuat turunannya sbg senyawa feniltiohidantoin mudah dideteksi krn serapan UV-nya kuat

    Sistem : Fase balik Kolom : -Bondapak C18 Eluen : Natrium asetat-metanol

  • Pemisahan dan identifikasi:1. Ekstraksi

    Asam amino non protein banyak tdp dlm biji Leguminosae, cara ekstraksinya adalah sbb:

    Serbuk Biji (1 g)

    Ekst. Etanol

    Endapan Filtrat

    Pekatkan

    K.Kolom (12x0,8 cm) Zeokarb 225

    1. EtOH 2. EtOH-air yg

    mgd NH4OH 2M

    Eluat Pekat

    Eluat

    Pusingkan

    Kocok dg 25 ml EtOH 75% 1 hari

    KKt

  • Asam amino non-protein (2)Pemisahan dan identifikasi:

    2. Kromatografi Kertas Paling banyak dilakukan KKt 2 arah

    Fasa gerak : 1. Fenol 75%-Air (uap amonia)

    2. N-BuOH-HAc-Air (90:10:29) 1. EtOAc-Piridina-Air (2:1:2) 2. n-BuOH-NH4OH 3M (lap atas)

  • Asam amino non-protein (2)Pemisahan dan identifikasi:

    3. Elektroforesis Untuk menjaring asam amino yang bersifat asam dlm jaringan tumbuhan

    elektroforesis kertas Dapar : As format-HAc-Air (33:148:19), pH 1,9

    HAc-Piridina-Air (5:0,5:95), pH 3,6 HAc-Piridina-Air (0,2:5:95), pH 6,5 Na2CO3 0,1 M pH 11,6

    Metode : Untuk dapar asam Elektroforesis pd kertas Whatman no.1, 60V/cm, 30 menit Untuk dapar basa (pH 11,6) Cara pita gantung, 5 V/cm, 17 jam

    Deteksi : Dilihat apakah asam amino tdk bergerak, bermuatan positif atau negatif

  • Asam amino non-protein (2)Pemisahan dan identifikasi:

    4. Deteksi Reaksi warna dg ninhdrin:

    Asam amino protein lembayung

    Asam amino non protein hijau, coklat, merah tua

    Pereaksi Sakaguchi (8-hidroksikuinolin 0,1% dlm aseton + brom 0,2% dlm NaOH 0,5M) arginin dan turunannya

    Pereaksi PCAF Fearon

    (Natrium pentasianoamoniumferat 1% dlm air suling bebas tembaga + dapar fosfat pH 7) senyawa guanidin yi kanavanin dan deaminokanavanin

  • AMINA

  • Definisi:

    Hasil dekarboksilasi asam amino yang terbentuk dengan reaksi:

    RCH(NH2)CO2H RCH2NH2 + CO2

  • Klasifikasi

    1. Monoamina alifatik Mulai dari metilamina (CH3NH2) sampai n-heksilamina (CH3(CH2)5NH2)

    2. Poliamina alifatik

    Putresin (NH2(CH2)4NH2), agmatina (NH2(CH2)4NHC(=NH)NH2) 3. Amina aromatik

    Meskalin Serotonin

    CH2CH2NH2 MeO

    MeO

    MeO

  • Sifat:

    1. Monoamina mudah menguap

    2. Diamina dan poliamina kurang atsiri

    3. Berbau tidak enak (spt bau ikan) bila dalam konsentrasi tinggi

  • Fungsi:

    Poliaminamerangsang pertumbuhan

    Meskalin (seny aktif dari ujung berbunga kaktus Lophophora wiliamsii) senyawa halusinogen kuat

    Noradrenalin, histamin dan serotoninmetabolisme otak (pd hewan)

  • Pembagian berdasarkan posisi N dlm senyawa:

    1. Amina primer (RNH2)

    2. Amina sekunder R2NH) dimetilamina

    3. Amina tersier (R3N) hordenina N-dimetiltiramina (alkaloid utama gandum untuk membuat bir)

  • Pemisahan dan IdentifikasiAmina Alifatik

    1. Kromatografi Kertas Mrp cara paling sederhana untuk mendeteksi amina atsiri dl tumbuhan Pengembang : N-BuOH-HAc-Air (4:1:5) Deteksi : Amina Primer : Ninhidrin

    2-asetoasetilfenol 1% dlm etanil

    merah-ungu

    fluoresensi kuning-hijau

    Amina Sekunder : Nitroprusida biru Amina Tersier : Dragendorf jingga

  • Pemisahan dan IdentifikasiAmina Alifatik

    2. Kromatografi Gas- Cair Merupakan cara yang baik untuk senyawa amina krn sifatnya

    mudah menguap

    Cara pilihan untuk memisahkan dan mengidentifikasi komponen campuran amina yg rumit

  • Pemisahan dan IdentifikasiAmina Alifatik

    3. Kromatografi Lapis Tipis Sbg turunan DNP: Fasa diam : Si-gel HF 254 Fasa gerak : 1. Pentana-Ester isoamil asam asetat-Amonia

    (70:29;1) 2. Benzena-EtOAc-EMB (97:2:1) 3. Pentana-Benzena-Trietilamina (9:9:2)

    Deteksi : UV 254 nm

    KLT-elektroforesis (Smith, 1970) Untuk memisahkan dan mendeteksi poliamina tumbuhan Fasa diam : Selulosa MN 300 Fasa gerak : n-BuOH-MeCOEt-NH4OH-Air (5:3:1:!)

    Metil selosolve-Asam Propionat-Air (70:15:15) n-BuOH-HOAc-Air (4:1:1)

    Elektroforesis : Pd dapar sitrat 0,5 M (pH 3,5), 20 menit, 25 V/cm pd pelat yang didinginkan dg EMB

  • Pemisahan dan IdentifikasiAmina Aromatik

    KKt dan KLT KKt memisahkan amina aromatik yg aktif fisiologi (sifat spt fenol)

    Kromatografi Kertas (Fellows dan Bell, 1970) Fasa diam : Kertas Whatman No 1

    Fasa gerak : 1. BAW (12:3:5)

    2. Isopropanol-NH4OH 1M-Air (20:1:2) 3. n-BuOH-Piridin-Air (1:1:1) 4. n-Propanol- NH4OH 1M (15:1)

    Deteksi : 1. Prx Erlich-HCl 10 M (9:1) 2. Ninhidrin 3. Folin Ciocalteau

    Kromatografi Lapis Tipis (Booth dan Boyland, 1964) Fasa diam : Si-gel Fasa gerak : EMB-Aseton (7:3)

    CHCl3-EtOAc-HAc (6:3:1)

  • ALKALOID

  • Definisi:

    Senyawa yang mempunyai satu atau lebih atom N (biasanya dalam cincin heterosiklik) dan umumnya mempunyai aktivitas fisiologis baik terhadap manusia maupun hewan.

  • Sifat

    Bentuk Kebanyakan berbentuk kristal, sebagian lagi berbentuk amorph Alkaloid yang berbentuk cair koniin, nikotin dan spartein

    Warna 1. Kebanyakan tidak berwarna 2. Berwarna kuning (berberin), berwarna merah (betanin)

    Rasa : umumnya pahit

    Kelarutan 1. Alkaloid btk bebas tidak larut dlm air, larut dlm pelarut organik

    2. Alkaloid btk garam mudah larut dalam air

    Kebasaan 1. Umumnya bersifat basa (kebasaan tgt pd ggs fungsi dekat atom N):

    Ggs penari elektron C=O, NO2) kebasaan berkurang

    Ggs pendorong elektron lebih basa 2. Mudah dioksida menjadi N-oksida 3. Pembentukan garam mencegah dekomposisi shg scr komersial,

    alkaloid banyak tdp dlm btk garam

  • Sejarah Isolasi:

    1803 Desrone alkaloid setengah murni narkotin 1805 Seturner morfin 1817-1820 Pelletier-Caventou strikhnin, emetin, bausin, piperin,

    kofein, kinin, sinkonin, kolkhisin 1826 Pelletier-Caventou koniin 1870 Sintesis dikarakterisasi 1884 25 alkaloid diperoleh dari kulit kina 1886 Koniin disintesis 1939 300 alkaloid diperoleh dari kulit kina 1946 Robinson menentukan strikhnin, 140 th stl diisolasi 1950 1000 alkaloid dicatat (Menske) 1973 4959 alkaloid diisolasi dan 3293 diketahui strukturnya 1978 4000 alkaloid diketahui strukturnya

  • Klasifikasi Struktur

    1. Alkaloid sekunder (contoh: koniin)

    2. Akaloid Tersier (contoh: strikhnin)

    3. alkaloid kuarterner (contoh: trigonelin) larut dalam air

  • Struktur beberapa alkaloid tumbuhan:

    Atropina Strikhnina Kuinina

    Morfina Kodeina Solanidin

  • Deteksi pendahuluan

    Penapisan fitokimia dg menggunakan pereaksi kiimia

    Prinsip:

    Alkaloid akan memberikan endapan dg garam-garam logam berat tertentu, berdasarkan pembentukkan senyawa kompleks yang tidak larut

    Alkaloid + Pereaksi Mayer endapan putih

    Alkaloid + Pereaksi Dragendorff endapan jingga

    Alkaloid + Pereaksi Bouchardat endapan jingga

  • Kromatografi

    Alkaloid tdk dapat dideteksi hanya dengan kromatografi tunggal scr kimia alkaloid sangat beragam

    Alkaloid dideteksi dg penampak bercak spt: Dragendorff

  • Ekstraksi

    Metode : Maserasi, perokolasi, ekstraksi dgn alat Soxhlet

    Pelarut : MeOH (alkaloid garam), kloroform, DCM (alkaloid basa)

    Teknik : Ekstraksi gradien pH

    Ekstraksi gradien polaritas

  • Pemisahan :

    Simplisia

    Ampas

    Ampas Ekstrak

    Fraksi air-asam

    Fraksi air (mengandung

    amoniumkuarterner)

    Fraksi Etil asetat(mengandung

    banyak alkaloid)

    Fraksi etil asetat

    Ekstrak(mengandung lilindan alkana daun)

    Ekstraksi dengan eter atau n-heksana

    Ekstraksi dengan etanol atau metanol

    Tambahkan asam tartrat/asam sitrat, lalu kocok dengan etil asetat

    Tambahkan NH3 atau Na2CO3, lalu kocok dengan etil asetat

  • Pemisahan :

    Ekstraksi Gradien pH Contoh:

    Lap. CHCl3

    Bahan

    Ekst. CHCl3 Residu

    Lap. Air

    Lap. Air Lap. CHCl3

    Alkaloid

    + NH4OH ad pH 10 Ekst dg CHCl3

    +HCl ad pH 1,2 dikocok

    + NH4OH ad pH 10 Ekst dg CHCl3

  • Pemisahan :

    Ekstraksi Gradien Polaritas Contoh:

    Bahan

    Ampas Filtrat

    Lap Air-Asam Filtrat Ampas

    Terpenoid/

    Fenolat Ekst. CHCl3-MeOH Lap Air-Basa

    Ekst. Netral Ekst.

    Semipolar Polisakarida

    Lap. CHCl3

    Ekst. Basa

    Alkaloid sekunder Alkaloid tersier

    Ekst polar

    Alkaloid kuarterner

    + MeOH-Air (4:1), saring

    Ekst dg EtOH, saring

    Uapkan

    Uapkan, +H2SO4 Ekst dg CHCl3

    Uapkan dan keringkan Ekst dg MeOH

    keringkan +NH4OH ad pH 10 Ekst dg MeOH-CHCl3 (1:3) dan CHCl3

  • Pemisahan dan identifikasi:

    3. Pemisahan dan Pemurnian Kromatografi kertas

    Fasa diam : Kertas Whatman-Dapar sitrat Fasa gerak : n-BuOH-Lar as sitrat dlm air Deteksi : UV 366 nm (Fluoresensi)

    Dragendorff Marquis Iodoplatinat

    Kromatografi lapis tipis Fasa diam : Si-gel G Fasa gerak : MeOH- NH4OH p (200:3) Deteksi : UV 366 nm (Fluoresensi)

    Dragendorff Marquis Iodoplatinat

  • A B

  • Keterangan gambar:

    1 = ekstrak opium

    T1 = morphin

    T2 = codein

    T3 = papaverin

    T4 = noskapin

    A = UV 254 nm

    B = Dragendorff

    C = UV 385 nm

    D = Marquis

  • Pemisahan dan Pemurnian

    Kromatografi gas Kolom : PEG Carbowax

    Chromosorb Teknik : Isotermal

    Suhu terprogram

    KCKT/HPLC Kolom : Si-gel

    Li Chrosorb Fasa gerak : Bervariasi Deteksi : Spekt. UV pd panjang gelombang tertentu Teknik : Elusi isokratik dan gradien

  • Identifikasi:

    4. Analisis strukturSyarat : senyawa harus murni Spekt. UV ggs kromofor

    Spekt. IM ggs fungsional

    MS fragmentasi dan BM (GC-MS atau LC-MS) NMR rangka struktur

    5. Analisis Kuantitatif KLT Densitometri

    HPLC GC

  • GLIKOSIDA SIANOGENIK

  • Definisi

    Senyawa glikosida yang apabila dihidrolisis (enzim atau non enzim) akan menghasilkan hidrogen sianida atau asam prusat (HCN)

  • Sifat:

    Beracun

    Bau amandel pahit

  • Reaksi pembebasan HCN dari glikosida sianogenik:

    Tahap 1 : Biasanya dgn enzim hidrosilase khas Tahap 2 : Pembebasan HCN dan keton tersulih dari hasil

    antara sianohidrin tak mantap

    R1

    R2

    C=O + HCN

    R1

    R2

    C

    OH

    CN

    R1

    R2

    C

    O-glukosa

    CN

    hidrolisis

  • Penyebaran

    Terdapat pd + 1000 jenis tumbuhan dan 100 suku serta 500 marga

    Glikosida sianogenik paling umum linamarin dan lotaustralin (Linum usitatissinum, Trifolium repens dan Lotus corniculatus)

    Linamarin Lotaustralin

    CH3

    C2H5

    C

    O-glukosa

    CN

    CH3

    CH3

    C

    O-glukosa

    CN

  • Pemisahan dan Identifikasi

    1. Deteksi HCN

    Reaksi ini tdk sepenuhnya khas untuk sianogen positif thd isotiosianat atsiri (positif palsu)

    Penggunaan kertas pikrat biasanya disertai dg Kertas Feigl-Anger Kertas saring dicelupkan ke dalam: 4,4-tetrametildiamina difenilamina 1% (b/v) dlm kloroform Tembaga etilasetoasetat 1% (b/v) dlm kloroform Hasil positif: h-b lemah biru terang

    Kertas saring

    Kertas as pikrat

    keringkan

    Lar as pikrat jenuh (0,05 M) Dijenuhkan dulu dg Na2CO3

    saring

    Inkubasi

    40oC, 2 jam

    Positif

    K C

    Jar tbh + 1-2 tts toluen

    dilumatkan

    Negatif KC (non enzim)

    Kertas as pikrat, dibasahkan

    Inkubasi

    40oC, 24 jam

    (1:1)

  • Pemisahan dan Identifikasi

    2. Kromatografi Glikosida Sianogenik

    Untuk memisahkan linamarin dan lotaustralin

    Kromatografi Kertas Fasa diam : Kertas Whatman No. 4 Fasa gerak : Butanon-Aseton-Air (15:5:3) Deteksi : AgNO3-Amonia

    Kromatografi Lapis Tipis Fasa diam : Si-gel G Fasa gerak : CHCl3-MeOH (5:1) Deteksi : -naftol 2% dlm EtOH

    H2SO4 p kmd dipanaskan

    Kromatografi Gas-Cair Fasa diam : 10-20% SE pd Chromosorb W tersilahkan Suhu : 210oC

  • Pemisahan dan Identifikasi

    Untuk memisahkan glikosida sianogenik aromatik Kromatografi Kertas

    Fasa diam : Kertas Whatman No. 4 Fasa gerak : n-BuOH-EtOH-Air (40:11:14)

    n-BuOH-HAc-Air (12:3:5) Deteksi : Sinar UV 254 nm

  • Pemisahan dan Identifikasi

    3. Analisis Kuantitatif Dasar: a. Hidrolisis glikosida sianogenik oleh enzim endogen

    dlm sistem tertutup b. HCN disuling uapkan dan HCN yang dibebaskan di

    ruang tertutup ditangkap (dg NaOH) c. Kadar ditentukan scr kolorimetri

    4. Isolasi Linamarin dan Lotaustralin dapat diisolasi sbg campuran glikosida murni dari Trifolium repens dengan kromatografi kolom

    Fasa diam : Selulosa Fasa gerak : n-BuOH-Air (9:1)

  • SENYAWA INDOL

  • Definisi

    Senyawa yg berkerangka sistem cincin indol.

    N

    H

  • Bbrp contoh:

    1. Asam Indol 3-Asetat (IAA) dan turunannya indol tumbuhan terpenting (pengatur tumbuh) auksin

    2. Asam 4-kloroindol-3-Asetat dan ester turunannya pd Pisum sativum dan Vica sp.

    3. Triptamin dan 5-hidroksitriptamin dan serotonin

  • Struktur kimia beberapa senyawa indol

    R = CH2CO2H Asam indol 3-asetat (IAA)

    CH2CHO Indol 3-asetaldehida CH2CN Indol 3-asetonitril CH2CHOHCO2H Asam indol 3-laktat OGlk Indikan CH2C(SGlk):NOSO3H Glukobraisin

    N

    H

    R

  • Kendala dalam pemisahan dan identifikasi IAA

    1. Auksin tumbuhan terdapat dalam jumlah yang sangat sedikit

    2. IAA tdp dlm bentuk kesetimbangan dengan bentuk terikatnya

    3. IAA tidak mantap, baik secara: In vivo mengalami oksidasi mjd tik aktif oleh enzim oksidase

    IAA

    In vitro dalam keadaan basa, rusak secara perlahan-lahan

  • Pemisahan dan Identifikasi

    1. Ekstraksi

    Jar tbh segar

    Ekstrak

    Ekstrak pekat

    Fraksi asam (pH 3) (IAA)

    Maserasi MeOH 4oC, 24 jam

    Saring, pekatkan 45oC,

    Saring dg celite

    Ekstraksi dg eter bbgi pH

    pekatkan

    Analisis (kromatografi, spektrum, telaah biologi)

    Fraksi netral (pH 7) (Indol 3-asetaldehida)

    Fraksi basa (pH 10) (Triptamina)

  • Pemisahan dan Identifikasi

    2. Kromatografi Lapis Tipis Fasa diam : Silika Gel Fasa gerak : 1. Iso PrOH-NH4OH-Air (8:1:1) utk IAA

    2. BAA (12:3:5) 3. NaCl 8% dlm air

    4. CHCl3-EtOAc-As format (5:4:1) CEF Deteksi : DMAC (0,1 g p-dietilamino- sinamaldehida dlm 10 ml

    HCl p diencerkan ad 200 ml aseton) Identifikasi : Dibandingkan dengan baku

    3. Identifikasi

    Spektrum UV dlm MeOH

    Spektrum UV dlm H2SO4 p pd pd 30oC dan 70oC membedakan

    indol dg penyulih yg berlainan

    Spektrum IM (dg pelat KBr)

    Fluorometri IAA mempunyai spektrum fluorensi yg bermacam-

    macam sesuai pH larutan yg diukur

  • Pemisahan dan Identifikasi

    4. Uji Biologi Coleoptil kecambah yg tumbuh dg cahaya merah cuci

    dg (medium dasar) sukrosa 2% dlm dapar KH2PO4 0,01 M pH 4,5

    Simpan dl med dasar yg mgd IAA hsl isolasi dg berbagai kekuatan, 10 jam

    Pertambahan panjang sayatan dibandingkan dengan kontrol

    Bandingkan dg kurva baku yang dibuat dg auksin baku

    5. KuantitatifGC MS dilakukan thd auksin tunggal hsl pemurnian

  • SENYAWA PURIN, PIRIMIDIN DAN SITOKININ

  • Klasifikasi

    1. Basa dari asam nukleat (Purin A,G; Pirimidin S, U dan T)

    2. Basa tak umum dlm tumbuhan berstruktur mirip basa asam nukleat

    3. Purin termetilasi kafein dan teobromin

    4. Purin tersulih pd enam tempat sitokinin

  • Beberapa contoh:

    Adenina Timina Urasil Guanina Sitosina

    Kafeina Teobromina

  • Sifat

    1. Kristal tak berwarna nisbi mantap

    2. Sedikit larut dalam air, larut lebih baik dalam lar asam lemah atau basa lemah

    3. Dpt dideteksi berdasarkan spektrum UV yg khas (mengalami geser sesuai pH dpt berada lebih dari satu tautomer)

    Dlm basa ggs hidroksil terionkan Dlm asam ggs amino terionkan shg tbt tautomer keto yg

    mantap

  • Pemisahan dan Identifikasi

    1. Kromatografi Kertas Untuk memisahkan purin dan pirimidin asam nukleat

    Fasa diam : Kertas Whatman No.1 Fasa gerak : 1. Air dan NH4OH 1 M pH 10

    2. BuOH jenuh air Deteksi : UV 253 nm bercak dipotong, dilar dlm HCl 0,1 M Identifikasi : Spetrofotometri UV (245-265 nm)

    Untuk memisahkan kafein dan teobromin Fasa diam : Kertas Whatman No.1 Fasa gerak : n-BuOH-HCl p (9:1) Deteksi : UV 253 nm

  • Pemisahan dan Identifikasi

    2. Kromatografi Lapis Tipis Fasa diam : Selulosa MN 300 Fasa gerak : 1. MeOH-HCl p- Air (7:2:1)

    2. N-BuOH-MeOH-Air-NH4OH p (60:20:20:1)

    Deteksi : UV 253 nm

    3. KCKT Mrp cara anlisis yg cukup penting krn dapat dgn mudah mendeteksi purin dan pirimidin dengan konsentrasi rendah

    Fasa diam : Kolom Penukar Ion (Zipax SCX) Fasa gerak : HNO3 0,01 M dan NH4OH 0,05 M Laju aliran : 1,5 cm/menit

    4. Identifikasi Purin dan pirimidin diidentifikasi dg mengukur dg spek UV pd pH berlainan

  • KLOROFIL

  • Definisi

    Katalisator fotosintesis yg penting dan tdp sbg pigmen hijau dlm semua jaringan tumbuhan berfotosintesis.

  • Sifat

    1. Terdapat dalam kloroplas dalam jumlah banyak

    2. Sering terikat longgar dengan protein

    3. Larut dalam aseton dan eter (non polar)

  • Kimia

    1. Mengandung satu inti porfirin (tetrapirol) dengan satu Mgterikat scr kelat di tengah

    2. Mempunyai satu rantai samping hidrokarbon panjang (fitil tergabung mll ggs asam karboksilat)

  • Jenis

    Tdp + 5 jenis klorofil dg struktur yang hampir sama sifatnya berbeda tergantung dari rantai samping alifatik pada inti porfirin

    Klorofil a dan b tdp pd tumbuhan tinggi, paku2an dan lumut

    Klorofil c,d,e tdp pd bakteri tertentu

  • Structure of chlorophyll a (C55H72O5N4Mg)

  • Kendala dalam pemisahan dan identifikasi klorofil

    Klorofil mrp senyawa yg tdk mantap

    Dapat berubah mjd pigmen jadian selama isolasi/pemurnian ada enzim klorofilase yg mengkatalisis reaksi penghilangan rantai fitol membentuk klorofida

    Etanol + klorofil fitol+ etil klorofida

    Mg dapat hilang dg mudah dari klorofil saat ekstraksi awal dg lar bersifat asam tbt proto klorofil harus di(+) basa lemah (MgCO3 1% atau dimetilanilin)

  • Pemisahan dan Identifikasi

    1. Ekstraksi dan Pemisahan

    Spet UV utk ekstrak aseton 80% pd 663 nm dan 646 nm, konsentrasi klorofilnya dihitung dg rumus sbb:

    Klorofil total = 17,3 A646 + 7,148 A663 mg/ml Klorofil a = 12,21 A663 2,81 A646 mg/ml Klorofil b = 20,13 A646 5,03 A663 mg/ml

    Cara lain untuk memisahkan dan menghitung klorofil a dan b:

    1. KLT kromatogram dielusi dan diukur spektrumnya 2. KCKT

    Digiling dlm lumpang/maserator dgn MeOH/Aseton ad jar tdk berwarna

    + CaCO3 Saring dg Buhner

    Cuci dg pelarut baru

    Ekstrak aseton/MeOH

    Gab ekstrak Tambahkan plrt ad vol ttt Simpan di lemari es

    Filtrat

    Jar tbh segar

    Sisa jaringan

  • Pemisahan dan Identifikasi

    2. Kromatografi Lapis Tipis Fasa diam : Selulosa MN 300 Fasa gerak : EMB-Aseton-n-PropOH (90:10:0,45), 30 menit Deteksi : Cahaya biasa hijau

    UV 366 nm fluoresensi merah

    Selama kromatografi, pigmen akan terurai setiap pigmen memberikan 3 seny jadian (8 bercak)

    3. Identifikasi Spektrum Puncak utama sekitar 400 nm Sejumlah puncak kecil 500-600 nm Satu puncak utama lagi di atas 625 nm (klorofil a 630 nm;

    klorofil b 688 nm)

  • -SELESAI-Terima kasih