Analisis Kualitatif Terhadap Asam Nukleat

7/21/2019 Analisis Kualitatif Terhadap Asam Nukleat

1/10

METODE ANALISIS KUALITATIF & KUANTITATIF TERHADAP ASAM NUKLEAT

(Elisabeth, 1303!103", H#$% F't)sa*

AbstrakSel memiliki bagian inti yang terdiri dari asam nukleat. Asam nukleat dapat dianalisis secarakualitatif maupun kuantitatif. Analisis dilakukan guna pendeteksian asam nukleat di dalam sel.Analisis secara kualitatif, berhubungan dengan keberadaan, panjang rantai, urutan serta jumlahkodon DNA. Metode yang dapat digunakan untuk analisis ini, antara lain Nucleic AcidHybridization, olymerase !hain "eaction, serta Nucleic Acid Se#uencing. Sedangkan, analisiskuantitatif pada asam nukleat dilakukan dengan melihat jumlah gen yang terdapat pada sampel.Analisis ini dapat dilakukan menggunakan metode spektroskopi $%&%is.

S'b +ahasa 1 - Nucleic Acid Hybridization


2/10


3/10

Hibridisasi DNA merupakan teknik yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA daripatogen dan juga untuk meletakan gen spesifik dalam sel.

Hibridisasi DNA menggunakan prinsip kemampuan asam nukleat untuk membentuk doublestrands yang stabil pada kondisi tertentu.

ada pengujian hibridisasi DNA, DNA dari suatu 'iris atau sel didenaturasi menggunakanalkali untuk memisahkan strands. Double strands menjadi single strand. Single strand ini akan

dilekatkan dengan nitrocelluloseatau nylon membran. $ntuk mengidentifikasi DNA target, sebuah probe yang telah dilabeli dengan radioaktif

(reporter group) ditambahkan. robe akan bereaksi dengan DNA target. robe yang tidak bereaksi akan dihilangkan dalam

larutan buffer. robe dan DNA target akan membentuk hibridisasi yang stabil. *ika tidak ada reporter group yang terdeteksi, maka diasumsikan bah+a molekul target tidak

memiliki urutan DNA yang cocok dengan probe, dengan demikian maka segmen DNA yangdicari tidak ada dalam sample.

Dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk melihat keberadaan asam nukleat dalammolekul target.

S'b +ahasa . - Polymerase Chain Reaction (PCR)

"eaksi polimerasi rantai adalah suatu metode yang memanfaatkan enzim polimerase dalammensintesis DNA yang ingin digandakan.

Alat yang digunakan adalah Thermal cycler yang berfungsi untuk mengatur perubahan suhuselama proses !" berlangsung.

ahan yang dibutuhkan dalam proses ini adalah sampel DNA yang mau dilipatgandakan,enzim DNA polimerase, deoksinukleosida (dN-) dan oligonukleotida (disebut juga primer).

nzim yang digunakan adalah enzim Taq polymeraseyang berasal dari bakteri yang tahanterhadap suhu tinggi (termofil). Hal ini dilakukan supaya enzim bisa terus melakukan replikasipada berbagai macam ukuran suhu.

/ligonukleotida yang digunakan harus dipertimbangkan dari beberapa aspek yaitu 01. anjang

anjang primer menunjukkan tingkat kompleksitas dari DNA cetakan. Semakin panjangprimernya, maka semakin rumit DNA yang harus direplikasi

2. -ingkat ketidakcocokan-ingkat ketidakcocokan menunjukkan bah+a belum tentu seluruh rantai hasil replikasiakan komplemen terhadap sampel DNA. Akan tetapi, asam nukleat pada ujung 34 dariprimer harus sesuai dengan ujung 54 pada sampel DNA.

5. -itik leleh6esamaan titik leleh antara DNA sampel dengan kedua primer yang digunakan akanmenunjukkan kesesuaian dari komposisi asam nukleat

7. Struktur internal sekunder

Struktur ini harus dihindari supaya tidak terjadi annealing dengan diri sendiri pada primeryang digunakan. Akibatnya primer tersebut akan berlipat dan tidak bisa berikatan dengansampel.

3. Annealing antara sesama primerAnnealing antara kedua primer yang digunakan juga harus dihindari karena akanmengakibatkan terbentuknya primer yang dimer.

!" terjadi sekitar 58&38 siklus dimana 1 siklus menunjukkan replikasi oleh 5 tahap(denaturasi, annealing dan elongasi).

-ahapan dalam melakukan !" adalah 01. Denaturasi

Denaturasi terjadi ketika ikatan DNA yang double&heli9 terputus sehingga membentuk 2rantai panjang yang saling komplemen. roses ini terjadi pada suhu tinggi (:7;!) dengan

bantuan enzim polimerase.2. Annealing


4/10

Annealing adalah proses yang dia+ali dengan penempelan primer sebagai a+al dari suaturantai komplemen baru. roses ini terjadi pada suhu sekitar


5/10

"e'erse -ranscriptase&!" juga sering dikenal sengan kinetic polymerase chain reaction."-&!" merupakan modifikasi dari !", dimana metode ini digunakan untukmengamplifikasi "NA, berbeda dengan !" biasa yang mengamplifikasi DNA. roses "-&!" dibantu oleh enzim "e'erse -ranscriptase, karena hanya enzim jenis ini yang dapatmensintesis DNA dengan cetakan "NA, sedangkan polimerase DNA hanya dapatmensintesis dengan menggunakan cetakan DNA. "-&!" penting digunakan sebagai alatdiagnostik untuk mendeteksi dan menentukan serotipe 'irus, sebagai informasi untuk studi

epidemiologi.5. Nested !"

Nested !" adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakanbantuan enzim DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer untukmengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested !", jika ada fragmen yang salahdiamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya olehprimer yang kedua. Dengan demikian, nested !" adalah !" yang sangat spesifikdalam melakukan amplifikasi. ?aktu yang diperlukan dalam reaksi nested !" lebih lamadaripada !" biasa karena pada nested !" dilakukan 2 kali reaksi !", sedangkanpada !" biasa hanya 1 kali reaksi !".

7. Multiple9 !"Multiple9 !" merupakan modifikasi dari !" yang digunakan untuk mendeteksi adanyadelesi atau duplikasi secara cepat pada gen besar. roses ini mengamplifikasi sampel DNAgenomik menggunakan banyak primer dan DNA polimerase pada thermal cycler.

3. -ouchdo+n !"Sebuah modifikasi dari !" yang mencegah amplifikasi sekuens nonspesifik denganmempermainkan suhu annealing.

Masih banyak jenis modifikasi dari !" ini, sepertiAllele-specific PCR,AssemblyPCR,Assymetric PCR, Dial-out PCR, Hot start PCR, dan lain&lain.

!" banyak digunakan untuk 01. DNA Se#uencing

!" mampu membuat terjadinya DNA se#uencing hanya dengan suatu cetakan DNAyang kecil, ketika berada bersama dengan ddNA- dalam proses terminasi.

2. DiagnosisDalam pendeteksian sel anemia bulan sabit, hal yang dideteksi adalah keberadaan bagianrestriksi dari gen beta globin. 6etika !" tidak dapat mendeteksi bagian tersebut, dapatdiasumsikan bah+a sampel mengandung sel bulan sabit.

5. @orensikada forensik, DNA yang digunakan adalah DNA polimorfik (berbeda untuk setiapindi'idu). /leh karena itu dengan memanfaatkan !", bagian polimorfik dari DNA yangsangat pendek akan digandakan. 6emudian akan disesuaikan dengan DNA dari orang tuadonor sampel.

7. opulasi genetis

Dalam hal ini, peneliti umumnya melihat tingkat frekuensi kesamaan allel antara beberapagen sampel untuk melihat tingkat kekeluargaan DNA nya. $mumnya proses yangdigunakan yaitu 0& Random Amplification of Polymorphic DNA analysis("AD)

Dalam teknik ini, digunakan suatu primer yang pendek tetapi dapat melakukanannealing terhadap banyak bagian dari gen yang diteliti. Selain itu produk hasilannealing juga beragam.

& Amplified ragment !ength Polymorphism (A@)Dalam teknik ini, hanya fragmen&fragmen restriksi DNA yang digandakan sehinggaukuran panjang dari masing&masing replikasi dapat dibandingkan.

3. Arkeologi dan e'olusi

Dalam arkeologi, !" digunakan untuk mengambil sampel DNA yang polimorfik kemudiandibandingkan dengan sampel DNA dari he+an yang sekarang dapat diamati. Hal iniditujukan untuk mengetahui asal dari suatu populasi spesies tertentu.


6/10

S'b +ahasa 3 - Nucleic Acid Sequencing

Metode ini memanfaatkan pemisahan secara denaturasi oleh gel poliakrilamide. Metode ini membutuhkan alat berupa film 9&"ay serta komputer untuk menginterpretasikan

hasil corak pada film. Alat yang dibutuhkan adalah DNA sampel serta gel poliakrilamide. Denaturasi oleh gel

tersebut bersifat khusus karena mampu membedakan panjang dari potongan&potongan DNAyang dihasilkan berdasarkan jenis basanya. Secara umum, proses se#uencing ini terjadi dalam beberapa tahap yaitu 0

1. lektroforesislektroforesis adalah tahap pemisahan kedua rantai DNA dengan memanfaatkanperbedaan muatan listrik dari setiap makromolekul dalam DNA. Dalam se#uencing,elektroforesis dilakukan dengan memanfaatkan kemampuan denaturasi oleh gelpoliakrilamida. Bel ini mengandung urea yang memicu terjadinya proses pemisahan rantaiDNA.

2. abellingroses pemberian label dilakukan dengan menempelkan beberapa radioisotop yaitu 52,55, dan 53S. Setelah diberikan radioisotop tersebut, gel yang berisi potongan DNA akan

dikeringkan dan diletakkan di dekat film C&"ay.3. %isualisasi gambar

Bel kering tersebut akan memancarkan sinar akibat terjadinya emisi partikel. Sinartersebut akan di tangkap oleh film 9&"ay dan akan ditampilkan dalam suatu bentuk coraktertentu pada film. @ilm bercorak tersebut disebut juga autoradiograph dan akanmenggambarkan kopian dari letak basa pada DNA sampel.

Metode ini dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu metode Ma9am&Bilbert dan metode Sangera. Metode Ma9am&Bilbert

Metode ini memanfaatkan 2 jenis senya+a kimia yaitu piperdin, dimetil sulfat dan hidrazin.6edua senya+a tersebut berperan dalam pemutusan ikatan glikosida antara basa dangula ribosanya. emutusan rantai menjadi beberapa potongan dengan panjang yang

berbeda, dapat terjadi melalui proses 01. emutusan ikatan glikosidaemutusan ikatan glikosida dilakukan oleh 2 senya+a kimia. Dimetil sulfat akanmemutus ikatan pada basa purin sedangkan hidrazin pada basa pirimidin. Akibatnyaterjadi pemisahan membentuk basa dan gula ribosa

2. emutusan ikatan fosfodiesterada tahap ini, piperdin akan muncul dan menguraikan ikatan fosfodiester yang dimilikioleh gula ribosa tersebut. Akibatnya, gula akan lepas dari rantai panjang DNA sampeldan menghasilkan 2 potong rantai DNA yang memiliki panjang yang berbeda&beda.


7/10

b. Metode SangerMetode ini memanfaatkan enzim DNA polimerase untuk membentuk rantai yangkomplemen terhadap cetakan DNA sampel. Dalam metode ini, proses elektroforesis akandilanjutkan dengan proses replikasi oleh suatu primer, DNA polimerase, deoksinukleotida(deoksiN-) dan 7 jenis dideoksinukleotida (ddA,ddB,dd!,dan dd-) yang diletakkandalam 7 tabung yang berbeda&beda. Dideoksinukleotida merupakan suatu basa yang tidakmemiliki gugus /H pada ujung 54, melainkan gugus H. Dideoksinukleotida akanmenghentikan proses polimerisasi oleh DNA polimerase ketika ia juga ikut terikat.erbedaan panjang rantai pada metode ini terjadi dalam beberapa proses yaitu 01. nisiasi oleh primer

roses replikasi DNA dari cetakan dimulai dengan pengikatan primer dengan ujung 54pada cetakan.

2. longasi oleh deoksiN-6emudian DNA polimerase akan melanjutkan replikasi dengan cara menyusundeoksiN- yang tersebar bebas dalam tabung sesuai dengan urutan pada sampel.

5. -erminasi oleh dideoksinukleotidaada akhirnya, akan ada saat dimana dideoksinukleotida ikut menempel pada rantaihasil replikasi. Akibatnya, proses polimerisasi akan terhenti.


8/10


9/10


10/10

cahaya $% ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi2

Analisis Kualitatif Terhadap Asam Nukleat

Documents

Transcript of Analisis Kualitatif Terhadap Asam Nukleat