Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
-
Upload
diananurallatief -
Category
Documents
-
view
236 -
download
0
Transcript of Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
1/31
LAPORAN TERBAIK
PRAKTIKUM BIOKIMIA
AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM -AMILASE
Disusun Oleh :
1 Istiana Sulisminawati 24030110120011
2 Zasrie Putri Oktaviani 24030110141009
3 Nor Sri Inayati 24030110141020
4 alih Pur!o "tomo 2403011014102#
$ %itria &usumawati 24030110141034
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
2013
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
2/31
'(S)*'&
)elah +ilakukan ,er-o!aan .'ktivitas S,esi/ik nim 'milase
yan5 !ertu6uan untuk menentukan aktivitas s,esi/ik enim amilase hasil
isolasi +an ,emurnian awal7 Prinsi, ,er-o!aan ini a+alah kemam,uan enim
amilase untuk mem!entuk 1 m5 5lukosa8satuan waktu inku!asi ,a+a
kon+isi tem,eratur +an , tertentu +an ,enentuan aktivitas s,esi/ik enim
amilase yan5 !er+asarkan ,a+a unit aktivitas enim amilase8m5 ,rotein7
;eto+e yan5 +i5unakan +alam ,er-o!aan ini a+alah nelsonsoumo5yilowry +an s,ektro/otometri7 asil yan5 +i,eroleh a+alah asil yan5
+i,eroleh a+alah enim yan5 le!ih murni7 &a+ar 5lukosa ,a+a sam,el
a+alah #032unit ,a+a ekstrak kasar 012$
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
3/31
P*?O(''N @
'&)IAI)'S SPSI%I& NZI; ';I>'S
I7 )"B"'N P*?O(''N
;enentukan aktivitas s,esi/ik enim amilase hasil isolasi +an ,emurnian
awal
II7 )INB'"'N P"S)'&'
271 nim
nim meru,akan ,rotein yan5 !er/un5si se!a5ai !iokatalis +alam
sel hi+u,7 nim telah !anyak +i5unakan +alam !i+an5 in+ustri ,an5an
/armasi +an in+ustri kimia lainnya7 Dalam !i+an5 ,an5an misalnya
amilase 5lukosaisomerase ,a,ain +an !romelin se+an5kan +alam
!i+an5 kesehatan -ontohnya amilase li,ase +an ,rotease7 nim +a,at
+iisolasi +ari hewan tum!uhan +an mikroor5anisme7 &ele!ihan enim
+i!an+in5kan katalis !iasa a+alah : +a,at menin5katkan ,ro+uk !eri!u kali
le!ih tin55iC !eker6a ,a+a , yan5 relati/ netral +an suhu yan5 relati/
ren+ahC +an !ersi/at s,esi/ik +an selekti/ terha+a, su!trat tertentu7
&1&2
&30nim D su!strat &om,leks 0nim D Pro+uk
&esetim!an5an untuk ,em!entuk a+alah :
&m E
Den5an s a+alah kom,leks enim su!strat a+alah enim S
a+alah su!strat +an &m a+alah teta,an kesetim!an5an7
F'mi 200#G
272 &om,onen nim su!strat
nim meru,akan senyawa or5anik !eru,a ,rotein yan5 !er/un5si
se!a5ai katalis +alam meta!olisme tu!uh sehin55a +ise!ut 6u5a
!iokatalisator7
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
4/31
&om,onen ,enyusun enim ter+iri +ari :
17 ',oenim yaitu !a5ian enim akti/ yan5 tersusun atas ,rotein yan5
!ersi/at la!il Fmu+ah !eru!ahG terha+a, /aktor lin5kun5an +an
27 &o/aktoryaitu kom,onen non ,rotein yan5 !eru,a :
a7 Ionion anor5anik FaktivatorG
(eru,a lo5am yan5 !erikatan lemah +en5an enim %e ?a ;n Zn
& ?o7 Ion klori+a ion kalsium meru,akan -ontoh ion anor5anik
yan5 mem!antu enim amilase men-erna kar!ohi+rat FamilumG
!7 u5us ,rostetik
(eru,a senyawa or5anik yan5 !erikatan kuat +en5an enim %'D
F%lavin '+enin Dinu-leoti+eG !iotin +an heme meru,akan 5u5us
,rostetik yan5 men5an+un5 at !esi !er,eran mem!eri kekuatan
ekstra ,a+a enim terutama katalase ,eroksi+ae sitokrom oksi+ase7
-7 &oenim
(eru,a molekul or5anik non ,rotein kom,leks se,erti N'D
FNi-otineami+e '+enine Dinu-leoti+eG koenim' ')P +an
vitamin yan5 !er,eran +alam memin+ahkan 5u5us kimia atom atau
elektron +ari satu enim ke enim lain7
Ferliyana 200=G
273 Si/atsi/at nim
17 nim a+alah Protein
Se!a5ai ,rotein enim memiliki si/at se,erti ,rotein yaitu san5at
+i,en5aruhi oleh kon+isi lin5kun5an se,erti suhu , konsentrasi
su!stratG7 Bika lin5kun5annya ti+ak sesuai maka enim akan rusak
atau ti+ak +a,at !eker6a +en5an !aik7
27 (eker6a se-ara khusus8s,esi/ik
Setia, enim memiliki sisi akti/ yan5 sesuai hanya +en5an satu
6enis su!strat artinya setia, enim hanya +a,at !eker6a ,a+a satu
su!strat yan5 -o-ok +en5an sisi akti/nya7
37 (er/un5si se!a5ai katalis
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
5/31
;enin5katkan ke-e,atan reaksi kimia tan,a meru!ah ,ro+uk yan5
+ihara,kan tan,a ikut !ereaksi +en5an su!stratnya +en5an
+emikian ener5i yan5 +i!utuhkan untuk men5uraikan suatu su!strat
men6a+i le!ih se+ikit7
47 Di,erlukan +alam 6umlah se+ikit
*eaksi enimatis +alam meta!olisme hanya mem!utuhkan se+ikit
sekali enim untuk setia, kali reaksi7
$7 (eker6a !olak!alik
nim ti+ak mem,en5aruhi arah reaksi sehin55a +a,at !eker6a +ua
arah F!olak!alikG7 'rtinya enim +a,at men5uraikan su!strat
men6a+i senyawa se+erhana +an se!aliknya enim 6u5a +a,at
menyusun senyawasenyawa men6a+i senyawa tertentu7
#7 nim !ersi/at khusus terha+a, suatu su!strat tertentu yan5 +a,at
+iikat +an 6enis reaksinya7
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
6/31
'milsse meru,akan enim yan5 !er/un5si meme-ah ,ati atau
5liko5en7 Senyawa ini !anyak ter+a,at +alam hasil tanaman +an hewan7
'milase +a,at +ikelom,okkan men6a+i ti5a 5olon5an enim yaitu :
a7 amilase yan5 meme-ah ,ati se-ara a-ak +ari ten5ah atau +ari
!a5ian +alam molekul +an karenanya +ise!ut en+oamilase7
!7 Hamilase yan5 men5hi+rolisis unitunit 5ula +ari u6un5 molekul
,ati karenanya +ise!ut eksoamilase7
-7 amilase yan5 +a,at memisahkan 5lukosa +ari terminal 5ula non
,ere+uksi su!strat ,ati7
FDeswita 200#G
27$ nim amilase
nim al/a amilase meru,akan salah satu 6enis enim yan5 !er,eran
atau !er/un5si men5hi+rolisis atau meme-ah molekulmolekul ,ati
men6a+i molekulmolekul lain yan5 le!ih se+erhana se,erti +ekstrin
maltosa +an 5lukosa7 ;ekanisme ker6a +ari enim al/a amilase a+alah
+en5an -ara meme-ah ikatan 14 5likosi+ik rantai 5lukan ,ati7 nim
enim al/a amilase !eker6a o,timum ,a+a , sekitar # +an ,a+a suhu
#0o?7 Bika suhu +itin5katkan , o,timum 6u5a menin5kat sam,ai sekitar
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
7/31
(ila !erat molekul enim +iketahui maka aktivitasnya +a,at
+inyatakan +alam !entuk aktivitas molekular a+alah 6umlah satuan su!strat
,ermikromol enim7 'tau +a,at ,ula +iartikan se!a5ai 6umlah molekul
su!strat +i u!ah setia, menit oleh setia, molekul enim7 'ktivitas
molekuler meru,akan si/at enim in+ivi+u 6a+i +a,at +5unakan untuk
menentukan kemurnian enim se,erti halnya aktivitas enim7
F'mi 200#G
27< 'ktivitas amilase
'ktivitasnya +iukur +en5an men5ukur hasil +e5ra+asi ,ati !iasanya
+ari ,enurunan ka+ar ,ati yan5 larut atau +ari ka+ar +ekstrinnya +en5an
men55unakan su!strat 6enuh7 ilan5nya su!strat +a,at +iukur +en5an
,en5ukuran +era6at ,ewarnaan io+ium terha+a, su!strat7 Se,erti telah
+iketahui ,ati yan5 men5an+un5 amilosa !ereaksi +en5an io+ium
men5hasilkan warna !iru se+an5kan +ekstrin !ila !ereaksi +en5an io+ium
akan !erwarna -oklat7 Disam,in5 itu keakti/an amilase +a,at 6u5a
+inyatakan +alam !er!a5ai -ara misalnya +en5an ,e5ukuran viskositas
+an 6umlah ,ere+uksi yan5 ter!entuk7
&inetika reaksi amilase meman5 a5ak sulit se!a! si/at
hi+rolisisnya !eranekara5am terha+a, !er!a5ai su!strat a,ala5i !ila hasil
hi+rolisis ,ertama ternyata men6a+i su!strat !aru la5i enim yan5 sama
sam,ai men5hasilkan maltose +an triosa7 >a6u hi+rolisis akan menin5kat
!ila tin5kat ,olimerisasi menurun +an la6u hi+rolisis akan le!ih -e,at ,a+a
rantai lurus7 i+olisa amilosa akan le!ih -e,at +ari ,a+a hi+rolisis rantai
yan5 !er-a!an57 Se,erti amilo,ektin atau 5liko5en7
F(aha5iawati 200$G
27= Penentuan 'ktivitas nim amilase
;eto+e yan5 +i5unakan +alam men5ukur aktivitas enim amilase
yaitu meto+e s,ektrometri7 Prose+urnya !eru,a ,enentuan ,ro+uk
F5lukosaG +en5an !antuan sinar sesuai hukum lam!ert(eer :
>o5 ) E ' E 7 ! 7 -
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
8/31
Dimana : ) E transmitansi
' E a!sor!ansi
E koe/isien ekstin5si molar
! E te!al kuve
- E konsentrasi
"ntuk menentukan !anyaknya ,ro+uk 5lukosa yan5 ter!entuk +ari
reaksi enimatis maka +i5unakan kurva stan+ar 5lukosa7 Pro+uk
+inyatakan +alam satuan unit aktivitas yan5 +i+e/inisikan !anyaknya mol
5lukosa +an reaksi enimatis ,a+a kon+isi o,timum7
F*o-hima 200$G
279 &lasi/ikasi +an struktur ,rotein
Se-ara umum ,rotein +a,at +ikate5orikan menurut ti,e tu5as yan5
+ilaksanakan yaitu :
17 Protein struktural : )er+iri atas molekul ,an6an5 liat +an ti+ak larut
27 Protein 5lo!ular : (entuknya !ulat +an larut +alam air7
37 Protein kon/i5urasi : ;eru,akan ,rotein yan5 !ersenyawa +en5an
at lain>
Protein mem,unyai struktur se!a5ai !erikut:
aG Struktur ,rimer : Struktur keran5ka kovalen +an +eret resi+u asam
amino7
!G Struktur sekun+er : Struktur kon/ormasi resi+u asam amino +ekat
,oli,e,ti+a7
-G Struktur tersier : Struktur ,rotein yan5 rantai keeseluruhannya 3
+imensi
+G Struktur kuertener : Struktur antaraksi antara su! unit ,rotein
F(io5en200=G
2710 S,ektro/otometer "AAIS
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
9/31
Se-ara umum semua molekul +a,at menyera, ra+iasi +alam +aerah
"AAIS karena mereka men5an+un5 elektron yan5 +a,at tereksitasi ke
tin5kat ener5inya yan5 le!ih tin55i7 Pan6an5 5elom!an5 yan5 ter6a+i
ter5antun5 ,a+a !e!era,a kuat elektron ini terikat ,a+a molekul7
'!sor!ansi larutan !ertam!ah +en5an ,en5uraian kekuatan sinar !ila
konsentrasi materi yan5 +ilewati -ahaya !ertam!ah maka -ahaya le!ih
!anyak +isera,7 Ba+i a!sor!ansi !er!an+in5 lurus +en5an kete!alan ! +an
+en5an konsenttrasi -7
FSari200#G
2711 )ekhnik Sentri/u5asi
)ekhnik sentri/u5asi a+alah suatu tekhnik ,emisahan !er+asarkan
si/at ,artikel +alam me+an 5aya sentri/u5al7 Partikel yan5 !er!e+a !erat
6enis ukuran +an !entuknya men5en+a, searah +en5an 5aya sentri/u5al
+en5an ke-e,atan !er!e+a7 Partikel yan5 akan +i,isahkan !iasanya
+isus,ensi +alam me+ium -air yan5 +imasukan +alam ta!un5 sentri/u5al
yan5 +a,at +item,atkan +alam rotasi yan5 !er,utar rotor terletak ,a+a
,usat sum!u simetri7
F(aha5iawati 200$G
2712 ;eto+e NelsonSoumo5yi
Penentuan aktivitas enim amilase +ilakukan +en5an meto+e
s,ektro/otometri +i mana +ilakukan ,enentuan terha+a,,ro+uk enimnya
yaitu 5lukosa +en5an meto+eNelsonSouma5yi yan5 ,rinsi,nya a+alah
,emanasan 5ula +en5an larutan alkali +ari tem!a5a tartrat +an ter!entuk
-u,ri oksi+a7
F'mi 200#G
2713 ;eto+e >owry
Protein +en5an asam /os/otun5stien/os/omoli!+at ,a+a suasana
alkali akan mem!eri warna !iruyan5 intensitasnya ter5antun5 ,a+a
konsentrasi ,rotein7 >arutan ' ter+iri atas /os/otun5stein /os/omoli!+at7
>arutan ( F2M Na2?O3 +alam N4O 01 N ?uSO4+an Na& tartrat 2MG7
?ara ,enentuannya a+alah se!a5ai !erikut 1 ml larutan ,rotein +itam!ah
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
10/31
0$ ml lowry ( +i5o6o5 +an !iarkan 20 menit7 Selan6utnya +iamati OD
nya ,a+a yan5 ter,ilih7 ?ara lowry 20 kali le!ih sensiti/ ,a+a -ara "A
atau !uret7
F'mi 200#G
;eto+e >owry meru,akan ,en5em!an5an +ari meto+e (iuret7
Dalam meto+e ini terli!at 2 reaksi7 'walnya kom,leks ?uFIIG,rotein
akan ter!entuk se!a5aimana meto+e !iuret yan5 +alam suasana alkalis
?uFIIG akan tere+uksi men6a+i ?uFIG7 Ion ?ukemu+ian akan mere+uksi
rea5en %olin?io-alteu kom,leks ,hos,homoli!+at,hos,hotun5stat
F,hos,homoly!+otun5stateG men5hasilkan hetero,olymoly!+enum !lue
aki!at reaksi oksi+asi 5u5us aromatik Frantai sam,in5 asam aminoG
terkatalis ?u yan5 mem!erikan warna !iru intensi/ yan5 +a,at +i+eteksi
se-ara kolorimetri7 &ekuatan warna !iru terutama !er5antun5 ,a+a
kan+un5an resi+u try,to,han +an tyrosinenya7 &euntun5an meto+e
>owry a+alah le!ih sensiti/ F100 kaliG +ari,a+a meto+e (iuret sehin55a
memerlukan sam,el ,rotein yan5 le!ih se+ikit7 (atas +eteksinya !erkisar
,a+a konsentrasi 0701 m58m>7 Namun meto+e >owry le!ih !anyak
inter/erensinya aki!at kesensiti/annya7
F'rie S 2009G
2714 Penentuan &a+ar Protein
Pen5ukuran konsentrasi ,rotein se-ara akurat men6a+i san5at
,entin5 ,eranannya men5in5at hasil ,eneta,an ini +i5unakan +alam
,erhitun5an lain se,erti ,enentuan aktivitas enim7 &esalahan +alam
,eneta,an ka+ar ,rotein akan !er!untut ,a+a kesalahankesalahan +i
,erhitun5an selan6utnya7 (er!a5ai meto+e analisis kuantitati/ telah
+itawarkan +en5an kele!ihan mau,un kelemahan masin5masin57 Se-ara
umum meto+e analisis kuantitati/ ,rotein +i5olon5kan +alam:
S,ektro/otometri:
S,ektro/otometri"A
&olorimetri
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
11/31
Aolumetri:
;eto+e &6el+ahl F+i+asarkan ,a+a analisis Nitro5enG )itrasi /ormol
&uanti/ikasi ,rotein se-ara kolorimetrik ,a+a +asarnya ter!a5i +alam
2 5olon5an yaitu !er+asarkan ,en5ikatan +en5an at warna Fdye-bindingG
+an ,em!entukan kom,leks +en5an tem!a5a Fcopper-chelatingG7
;eto+emeto+e !er+asarkan ,en5ikatan +en5an at warna meli,uti:
;eto+e (ra+/or+ F?oomassie (lueG
;eto+e Ninhy+rin
;eto+e (romo-resol reen
;eto+e rythrosin(
;eto+e 33Q$$Qtetra!romo,henol,htalein ethyl ester F)(PG
;eto+e Roo+war+s *ea5ent &
;eto+emeto+e !er+asarkan ,em!entukan kom,leks +en5an tem!a5a
meli,uti:
;eto+e (iuret
;eto+e >owry F%olin?io-alteuG
;eto+e (i-in-honini- '-i+ F(?'G
;eto+e %e?l3
F'rie S 2009G
271$ Stan+ar Protein
Pemilihan stan+ar+ ,rotein meru,akan ,enentu ke!erhasilan
analisis kuantitati/7 (ovine Serum 'l!umin F(S'G a+alah ,rotein yan5
umum +i5unakan se!a5ai stan+ar+ +alam ,eneta,an ka+ar ,rotein7 (S'
!anyak +i,ilih karena tin5kat kemurniannya yan5 tin55i +an har5anya
relati/ murah7 Stan+ar+ ,rotein lain yan5 !isa +i5unakan a+alah (ovine
amma lo!ulin F(?G terutama untuk ke,erluan kuanti/ikasi
anti!o+i karena (? men5hasilkan warna yan5 san5at miri, +en5an
immuno5lo!ulin FI5G7
http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?p=25http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?p=29http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?p=27http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?p=27http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?p=29http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?p=27http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?p=25 -
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
12/31
>arutan in+uk FstokG stan+ar+ ,rotein !iasanya +i!uat +alam
konsentrasi 1 $ m58m> namun ti+ak menutu, kemun5kinan +i!uat
larutan stok +en5an konsentrasi yan5 le!ih !esar7 ;isalkan larutan stok
stan+ar+ ,rotein yan5 in5in +i!uat a+alah 1 m58m> se!anyak 100 m>
maka +itim!an5 100 m5 (S' kemu+ian +ilarutkan +alam 100 m>
akua+es Fse!aiknya !e!as ?O2G7 Perlu +i-atat ketika larutan stok
+i!uat 6an5an +iko-ok karena akan !eraki!at +enaturasi ,rotein
Fteramati se!a5ai !uih +i ,ermukaan larutanG7 "ntuk mem!antu
,elarutan ,rotein -uku, +ia+uk ,erlahan7 Sim,an larutan stok ini F!ila
!elum +i5unakanG +alam /reeer Fatau le!ih !aik ,a+a suhu 20o?G7
F'rie S 2009G
271# Suhu o,timum nim amylse
'ktivitas enim al/aamilase +ari isolat Bacillus s,7 ;II10
memerlukan , o,timum
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
13/31
FPoe+6ia+i 1994G
271=72 lukosa
(; :#01# larut +alam larutan /ehlin5 tollens +an eter sulit
larut +alam alkohol memiliki +ua 6enis yaitu D5lukosa +an >
5lukosa7
FDaintith 1994G
271=73 ZnSO4
Senyawa kristalis larut air !erwarna ,utih +i!uat lewat
,emanasan !i6ih ink sul/i+a +iu+ara +an melarutkan +an
men5kristalisasi sul/atnya7
FDaintith 1994G
271=74 (aFOG2
Pa+atan ,utih se-+ikit larut +alam air !entuk yan5 umum
a+alah oktahi+rat monoklinik titik leleh arutan asam ,hos,o/un5ati-,hos,omoly!+i-7
*ea5en lowry (
100 ml 2M Na2?O3 +alam larutan NaO 01 N +en5an 1 ml
?uSO47 $2O1M +an 1 ml natriumkalium tartat 2M7
FDaintith 1994G
271=7< (u//er Phos/at
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
14/31
>arutan ' E 02 ; larutan NaPhos,at mono!asis F2arutan ( E 02 ; larutan Na,hos,hat +i!asis F$2#$ 5G
FDaintith 1994G
271=7= *ea5en NelsonSomou5yi
*ea5en '
12 5 &7Na tartat : 1# 5 Na!ikar!onat 144 5 Nasul/at anhi+rat
24 5 Nakar!onat anhi+rat +ilarutkan +en5an akua+es7
*ea5en (
2 5 ?uSO47$2O +itam!ah 1= 5 Na2SO4 anhi+rat +ilarutkan
sam,ai 100 ml F*ea5en Nelson Soumo5yi : 1 !a5ian Nelson '
1 !a5ian Nelson 'G
FDaintith 1994G
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
15/31
III7 ;)OD P*?O(''N
371 'lat +an (ahan
37171 'lat
17 )a!un5 reaksi $7 elas ukur
27 Sentri/u5e #7 elas !ekker
37 Inku!ator
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
16/31
37272 Penentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi +en5an meto+e NelsonSomou5yi
Penam!ahan akua+es 1$ ml
Penam!ahan 02 ml larutan (aFOG2001;
Penam!ahan larutan ZnSO402 ml 001 ;
Pen55o6o5an +an sentri/u5asi
Penam!ahan 1 ml rea5en NelsonSomou5yi
Pemanasan selama 1$ menit
Pen+in5inan
Penam!ahan 1 ml rea5en arsenomoli!+at
Pen5en-eran +en5an air hin55a
volumemen6a+i 10 ml
Penentuan konsentrasi +en5an
s,ektro/otometer "AAIS ,a+a E $20 nm
Pen5ulan5an terha+a, larutan stan+ar
5lukosa
01 ml larutan inku!asi
)a!un5 reaksi
1 ml su,ernatan
)a!un reaksi
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
17/31
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
18/31
3
-7 /raksi II
Penam!ahan 1 ml larutan moli!+at ,en5en-eran
a7 ekstrak kasar
!7 /raksi I
-7 /raksi II
Penentuan konsensentrasi +en5an s,ektra "A
a7 ekstrak kasar
!7 /raksi I
-7 /raksi II
Penentuan ka+ar Protein meto+e >owry
Penam!ahan larutan sam,el +en5an 1 ml rea5en ?
ko-ok
7
a7 ekstrak kasar
!7 /raksi I
-7 /raksi II
Penam!ahan 01 ml rea5en D ko-ok
a7 ekstrak kasar
!7 /raksi I
-7 /raksi II
Pen5ukuran a!sor!ansi
a7 ekstrak kasar
!7 /raksi I
-7 /raksi II
>arutan !iru
>arutan !iru
>arutan !iru
'!sor!ansi 020arutan !enin5
>arutan !enin5
>arutan !enin5
>arutan !iru
>arutan !iru ,ekat
>arutan !iru
'!sor!ansi 07293
'!sor!ansi 0$=2
'!sor!ansi 0$44
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
19/31
IA7 IPO)SIS
Per-o!aan .'ktivitas S,esi/ik nim 'milase !ertu6uan untuk
menentukan aktivitas s,esi/ik enim amilase hasil isolasi +an ,emurnian
awal7 Prinsi, ,er-o!aan ini a+alah kemam,uan enim amilase untuk
mem!entuk 1 m5 5lukosa8satuan waktu inku!asi ,a+a kon+isi tem,eratur
+an , tertentu +an ,enentuan aktivitas s,esi/ik enim amilase yan5
!er+asarkan ,a+a unit aktivitas enim amilase8m5 ,rotein7 ;eto+e yan5
+i5unakan +alam ,er-o!aan ini a+alah nelsonsoumo5yi lowry +an
s,ektro/otometri7 asil yan5 +i,eroleh a+alah enim al,ha amilase yan5
le!ih murni +en5an aktivitas s,esi/ik enim al,ha amilase tertentu7
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
20/31
AI7 P;(''S'N
Per-o!aan aktivitas s,esi/ik enim amilase !ertu6uan untuk
menentukan aktivitas s,esi/ik enim amilase hasil isolasi +an ,emurnian
awal7 Prinsi, ,er-o!aan ini a+alah kemam,uan enim amilase untuk
mem!entuk 1 m5 5lukosa8satuan waktu inku!asi ,a+a kon+isi tem,eratur
+an , tertentu +an ,enentuan aktivitas s,esi/ik enim amilase yan5
!er+asarkan ,a+a unit aktivitas enim amilase8m5 ,rotein7 ;eto+e yan5
+i5unakan +alam ,er-o!aan ini a+alah nelsonsoumo5yi lowry +an
s,ektro/otometri7 ;eto+e nelsonsomou5yi +i+asarkan ,a+a ,emanasan
5ula +en5an larutan alkali dari tembaga tartarat dan terbentuk cupri oksida.
Metode lowry adalah pengukuran kadar protein yang didasarkan pada
pembentukan kompleks yang disebabkan adanya reaksi antara basa
tembaga dengan protein.sedangkan metode spektrofotometri adalah
penyerapan cahaya pada panjang gelombang tertentu yang diukur dalam
bentuk absorbansi. Sampel yang digunakan adalah ubi jalar yang
merupakan sumber karbohidrat. Enim !amilase merupakan enim yang
dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan !1"# glikosida
dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul" baik pada amilase
maupun amilopektin.
>an5kah awal ,er-o!aan ini a+alah +en5an menam!ahkan enim hasil
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
21/31
/raksinasi +alam amilum 1M7 Di5unakan amilum karena enim amilase
+a,at men5hi+rolisis amilum7 &emu+ian +ilakukan ,enam!ahan !u//er
/os/at +alam -am,uran terse!ut7 %un5si ,enam!ahan !u//er PO# adalah
sebagai larutan penyangga agar p$!nya tidak berubah. %i mana akti&itas
!amilase berada pada range p$ '"#!("#" maka digunakan buffer )*#
dengan p$ ("1 +buffer asam," di mana p$ ini merupakan p$ optimum
akti&itas !amilase. -ika p$!nya di atas p$ optimum maka enim akan
mengalami deprotonasi atau perubahan p$. ila p$ berada di atas
maupun di bawah p$ optimum maka dapat menyebabkan enim
terdenaturasi" sehingga akti&itas enim menurun.
Setalah ,enam!ahan !u//er /os/at -am,uran +iinku!asi ,a+a suhu
400/ karena suhu tersebut merupakan suhu optimum akti&itas enim
!amilase. $al ini sebanding dengan energi akti&asi +Ea, untuk
setiap enim membentuk kompleks enim!substrat dan kemudian
membentuk produk dan enim kembali. -ika suhu inkubasi lebih
tinggi maka protein akan terdenaturasi yang mengakibatkan akti&itas
enim menurun. egitu pula jika diinkubasi pada temperatur yang
lebih rendah maka akti&itas enim !amilase kurang optimal.
)enginkubasian ini bertujuan agar enim !amilase dapat bekerja
sempurna dalam mengidrolisiss amilum menjadi glukosa.
#717 Penentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi +en5an meto+e NelsonSoumo5yi
Per-o!aan ini !ertu6uan untuk ,enentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi +en5an
men55unakan meto+e NelsonSoumo5yi7 Penentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi
meru,akan wu6u+ +ari u6i akti/itas enim amilase7 'ktivitas enim
meru,akan unit aktivitas enim ,ermili5ram ,rotein se+an5kan satu unit
aktivitas enim amilase meru,akan kemam,uan enim amilase yan5
menye!a!kan ter!entuknya 1m5 ,ro+uk 5lukosa +ari su!strat amilum
,ersatuan waktu inku!asi ,a+a kon+isi tem,eratur +an , tertentu7 "6i
aktivitas s,esi/ik enim amilase +iawali +en5an reaksi enimatis yaitu
+en5an menam!ahkan larutan amilum 1M +an !u//er /os/at ke +alam enim
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
22/31
kasar +an enim halus7
0 D S 0S 0 D Pnim su!strat enimsu!strat enim ,ro+uk
Pa+a reaksi enimatis +i,erlukan ,roses inku!asi +imana ,a+a ,roses
inku!asi ini ter6a+i kontak antara enim amilase +en5an su!strat +alam
mem!entuk ,ro+uk yaitu 5lukosa7 *eaksi :
O
CH2OH
OH
OH
O
O
O D (u//er %os/atal/a 3 amilase
CH2OH
OH
OH
CH2OH
OH
OH
O
OCH2OH
OH
OH
O9
9O
OCH2OH
OH
OH
O9
9O
Maltosa lukosa
&a+ar 5ula ,ere+uksi +a,at +itentukan +en5an meto+e Nelson
Soumo5yi7 Penam!ahan larutan (aFOG2 bertujuan untuk meminimalisasi
masuknnya oksigen dari luar ke dalam larutan yang dapat mengoksidasi
kupri oksida +/u2*, dan penambahan nS*# bertujuan untukmengendapkan protein. Supernatan yang terbentuk ditambahkan reagen
elson!Soumogyi dan dipanaskan dengan tujuan untuk mempercepat
reaksi. )enambahan reagen elson!Soumogyi menyebabkan terbebtuknya
kupri oksida. 3eagen /u!tartrat akan direduksi oleh glukosa" hal ini karena
glukosa mempunyai gugus gula pereduksi" yaitu gugus aldehid.
*eaksi re+uksi ?u24 5
?u24 4 e /u24
Ion ?u4akan mengendap sebagai /u2* dalam suasana basa 5
2 ?u 44 2 *$! /u2* 4 $2*
*eaksi ter!entuknya ku,ri oksi+a :
CHO
C
C
C
C
CH2OH
OH
H
OH
OH
H
OH
H
H
CHO
C
C
C
C
CH2OH
OH
H
OH
OH
H
OH
H
H
?u2D
'lkali
D ?u2O
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
23/31
lukosa asam %!glukonat
;eto+e NelsonSoumo5yi men5analisa se-ara kuantitati/ ,ro+uk
reaksi enimatis !eru,a 5lukosa akan teta,i meto+e ini memiliki
kekuran5an karena 5ula non ,ere+uksi FsukrosaG ti+ak +a,at ter+eteksi +an
hanya !isa men+eteksi 5ula ,ere+uksi F5lukosa/ruktosaG ,a+ahal ,ro+uk
+ari ,eme-ahan amilum oleh enim amilase !ukan 5lukosa melainkan
maltosa sukrosa +an 5ula non ,ere+uksi yan5 lain7
ula +a,at +ire+uksi +en5an sinar "A karena memiliki elektron
elektron yan5 +a,at tereksitasi +ari kea+aan +asar ketin5kat ener5i yan5
le!ih tin55i7 (iasanya transisi elektron +ise!a!kan oleh elektron T +imana
+alam molekul 5lukosa men5an+un5 5u5us kar!onil yan5 +i!entuk oleh
elektron T7
Penentuan ka+ar 5lukosa +ilakukan +en5an men5ukur a!sor!ansi
larutan terse!ut +en5an men55unakan s,ektro/otometer "AAIS ,a+a $20
nm7 Pan6an5 5elom!an5 $20 nm ini meru,akan ,an6an5 5elom!an5
maksimum +imana ter6a+i sera,an maksimum oleh larutan 5lukosa7 &a+ar
5ula ,ere+uksi +itentukan +en5an mem!an+in5kan a!sor!ansi larutan
sam,el terha+a, kurva larutan stan+ar 5lukosa7 asil yan5 +i+a,atkan
a+alah larutan !erwarna !iru +en5an nilai a!sor!ansi yan5 +i+a,at a+alah
,a+a ekstrak kasar se!esar 020owry
Per-o!aan ini !ertu6uan untuk menentukan ka+ar ,rotein +en5an
meto+e lowry7 Penentuan ka+ar ,rotein +en5an meto+e lowry +i+asarkan
,a+a warna kom,leks yan5 yan5 +i!entuk +imana intensitas warnanya
!ervariasi !e+asarkan 6enis,rotein atau 6umlah asam amino aromatik ,a+a
,rotein7 Rarna yan5 tim!ul +ise!a!kan oleh reaksi tem!a5a alkali +en5an
,rotein7
*ea5en yan5 +i5unakan a+alah rea5en %olin ?io-alteu yan5
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
24/31
meru,akan -am,uran natrium tun5stat +an natrium moli!+at +alam asam7
?am,uran asam ini akan mere+uksi ,rotein yan5 +i5unakan +alam
,er-o!aan melalui ,en5uraian ?u2sehin55a -am,uran asam ini kehilan5an
satu atau le!ih atom oksi5en +an kom,leks !iru yan5 +ihailkan meru,akan
kom,leks antara ,rotein +en5an ?u2.
Struktur kom,leks !iru :
?u2D
HN
CH
C
HN
NH
C
HC
NH
O
RO
R
Penentuan kuantitati/ ka+ar ,rotein se-ara lowry +i+asarkan ,a+a
a!sor!ansi sinar oleh kom,leks !iru7 '!sor!ansi +iukur +en5an
men55unakan s,ektro/otometri "AAIS ,a+a
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
25/31
AII7 PN")"P
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
26/31
AIII7 D'%)'* P"S)'&'
'mi 200# Penentuan &on+isi O,timum %ermentasi 's,er5illus Oryae
"ntuk Isolasi nim 'milase Pa+a ;e+ium Pati (i6i Nan5ka
>a!oratorium &imia Burusan P;IP' %&IP "niversitas *iau Pekan!aru
Daintith 1994 &amus >en5ka, &imia rlan55a Bakarta7
Darma6ana 'n+ '5ustina 200= Pen5aruh &onsentrasi nim 'milase
)erha+a, Si/at %isik Dan Or5anole,tik %iltrat (alai (esar )eknolo5i
)e,at una L >i,i Su!an5
ar+6ono 2001 S,ekstrosko,i li!erty Uo5yakarta
>ehnin5er 1999 (iokimia Dasar rlan55a Bakarta
Poe+6ia+i 1994 Dasar+asar (iokimia "I Press Bakarta
Rinarno 19=3 &imia Pan5an +an ii P) rame+ia Pustaka "tama
Bakarta
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
27/31
>;('* PNS''N
Semaran5 24 Novem!er 2012
Praktikan
Istiana Sulisminawati Zasrie Putri Oktaviani
24030110120011 2#0tomo
240301101410 20 2403011014102(
%itria &usumawati
240301101410
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
28/31
;en5etahui
'sisten
*eny In5emer S
B2?009044
>';PI*'N
Penentuan &a+ar lukosa
'!sor!ansi NelsonSomou5yi
kstrak kasar :020
Asam,el : $m>
Atotal : $m>
Aenim : 01m>
t inku!asi : 40 meniit
ka+ar 5lukosa:
@ E
kstrak kasar
@ E
E 1
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
29/31
E #032 unit
%raksi I
@ E
E 003#2
E 012$< unit
%raksi II
@ E
E 0024$
E 00=$1 unit
Penentuan &a+ar Protein
'!sor!ansi >owry
kstrak kasar : 0293
%raksi I : 0$=2
%raksi II : 0$44
/aktor ,en5en-eranF/,G :
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
30/31
ka+ar ,rotein E
kstrak kasar
&a+ar ,rotein E
E 2$
%raksi II
&a+ar ,rotein E
E 4
-
8/13/2019 Aktivitas Spesifik Enzim a-Amilase
31/31
'ktivitas s,esivik E
E 234# unit8m5 ,rotein
%raksi I
'ktivitas s,esi/ik E
E 0024# unit8m5 ,rotein
%raksi II
'ktivitas s,esi/ik E
E 001