AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK MADU LOKAL MELALUI...

AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK MADU LOKAL

MELALUI PENGHAMBATAN SEL KANKER PARU-PARU

A549 SECARA IN VITRO

SKRIPSI

IRSYAD BAHALWAN

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2018 M / 1439 H

AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK MADU LOKAL MELALUI

PENGHAMBATAN SEL KANKER PARU-PARU A549 SECARA IN

VITRO

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Kimia

Program Studi Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Oleh:

IRSYAD BAHALWAN

NIM : 1111096000071

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2018 M/ 1439 H

AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK MADU LOKAL MELALUI

PENGHAMBATAN SEL KANKER PARU-PARU A549 SECARA IN

VITRO

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Program Studi Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Oleh :

IRSYAD BAHALWAN

1111096000071

Menyetujui,

Pembimbing I Pembimbing II

A

A

Dr. La Ode Sumarlin, M.Si

NIP. 19750918 200801 1 007

Dr. Hendrawati, M.Si

NIP. 19720815 200312 2 001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Kimia

A

Drs. Dede Sukandar, M,Si

NIP. 19650104 199103 1 004

ABSTRAK

IRSYAD BAHALWAN. Aktivitas Antikanker Ekstrak Madu Lokal Melalui

Penghambatan Sel Kanker Paru-Paru A549 Secara In Vitro. Dibimbing oleh LA

ODE SUMARLIN dan HENDRAWATI.

Madu diketahui mengandung asam fenolat dan flavonoid yang berpotensi

sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antikanker

madu lokal melalui penghambatan terhadap sel A549. Sampel madu yang

digunakan berupa madu trigona, kelengkeng, rambutan dan kaliandra. Pengujian

kemampuan penghambatan sel kanker paru-paru dilakukan in vitro menggunakan

sel A549 sebagai sel kanker paru-paru manusia. Ekstraksi madu menggunakan

pelarut fraksi metanol, air, n-heksana dan etil asetat. Uji penghambatan sel A549

menggunakan metode (3-4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-Difeniltetrazolium bromide

(MTT assay) menunjukkan bahwa fraksi air terbaik ditunjukkan oleh madu

kaliandra dengan penghambatan sebesar 78.25% pada 50 ppm dan fraksi etil asetat

terbaik ditunjukkan oleh madu rambutan dengan penghambatan sebesar 70.81%

pada 200 ppm terhadap sel A549. Dengan demikian madu kaliandra dan rambutan

memiliki potensi sebagai suplemen untuk penderita kanker paru-paru.

Kata kunci : A549, kanker paru, madu rambutan, madu kaliandra, MTT assay

ABSTRACT

IRSYAD BAHALWAN. Anticancer Activity of Local Honey Extract by A549

Lung Cancer Cell Inhibition In Vitro. Supervised by LA ODE SUMARLIN and

HENDRAWATI.

Honey has been known contains phenolic acid and flavonoid which

potential act as anticancer. This research aims to discover the anticancer activity of

Indonesia’s local honey by inhibiting A549 cell. Honey which used is trigona

honey, longan honey, rambutan honey and kaliandra honey. Lung cancer inhibition

test done by in vitro using A549 cell as a human carcinoma lung cell. Honey

extracted with methanol, water, n-hexana and ethyl acetate. Inhibition test using 3-

(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-Difeniltetrazolium bromide (MTT assay) shows

highest inhibition level of water fraction from kaliandra honey which inhibit

78.25% A549 cell on 50 ppm and highest ethyl acetate fraction from rambutan

honey which inhibit 70.81% A549 cell on 200 ppm. Therefore, kaliandra and

rambutan honey are potential as a suplemen for lung cancer patients.

Keywords : A549, lung cancer, rambutan honey, kaliandra honey, MTT assay

vi

KATA PENGANTAR

Bismillahirrohmaanirrohim

Assalamualaikum Warahmatullah Wabarakatuh

Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Allah SWT, atas segala

nikmatNya sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini. Shalawat serta

salam selalu dilimpahkan kepada junjungan kita nabi Muhammad SAW. Skripsi

ini berjudul Aktivitas Antikanker Ekstrak Madu Lokal Melalui Penghambatan

Sel Kanker Paru-Paru A549 Secara In Vitro. Pada kesempatan ini, penulis ingin

menyampaikan ucapan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dan

mendukung sehingga penelitian dan penulisan skripsi ini dapat diselesaikan.

1. Dr. La Ode Sumarlin, M.Si selaku Spembimbing I yang telah memberikan

segala dorongan dan motivasi terhadap penulis.

2. Dr. Hendrawati, M.Si selaku pembimbing II yang telah banyak memberikan

saran dan masukan terhadap penulis.

3. Dr. Sandra Hermanto, M.Si selaku dosen penguji I yang telah banyak

memberikan bantuan dan koreksi dalam penulisan skripsi ini.

4. Nurhasni, M.Si selaku dosen penguji II yang memberikan masukan serta

kritiknya pada penelitian ini.

5. Drs. Dede Sukandar, M.Si selaku Ketua Program Studi Kimia, Fakultas Sains

dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Dr. Agus Salim, M.Si selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

vii

7. Orang tua dan keluarga yang selalu tanpa lelah memberikan dukungan.

8. Farhan dan teman seperjuangan dalam riset pada laboratorium.

9. Asep, Deni, Mirna, Reza, Susfa, Syahrullah yang berjuang bersama dan

memberikan atmosfir positif kepada penulis.

10. Rekan-rekan JFUIN, Reborn Organizer, UKM Bahasa-FLAT, Climate

Rangers Jakarta, Mai Maid Café, IOC, FakeRunners, Teater ENJUKU,

OMEGA, Jakarta Mikoshiren, CLF, Inazuma Yosakoi UIN Jakarta yang telah

memberikan penulis waktu, semangat dan dukungan moril sehingga penulisan

skripsi ini dapat terselesaikan.

Penulisan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari berbagai kekurangan, baik

dalam penulisan maupun penyusunannya. Oleh karena itu kritik dan saran yang

membangun diperlukan agar penelitian ini dapat lebih bermanfaat. Semoga skripsi

ini dapat berguna dan bermanfaat.

Jakarta, Juli 2018

Irsyad Bahalwan

viii

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ……………………………………………………….. vi

DAFTAR ISI …………………………………………………………………. viii

DAFTAR TABEL …………………………………………………………… x

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………… xi

DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………..……….. xii

BAB I PENDAHULUAN ……………………………………………………. 1

1.1. Latar Belakang …………………………………………………………... 1

1.2. Rumusan Masalah …………………………………………..…………… 4

1.3. Hipotesa Penelitian …………………………………………..…………... 4

1.4. Tujuan Penelitian ………………………………………………………... 4

1.5. Manfaat Penelitian ………………………………………….…………… 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA …………………………………………….. 6

2.1. Morfologi dan Klasifikasi Lebah Madu ………………………………….. 6

2.2. Madu ………………………………………………………..……………. 8

2.2.1. Proses Pembuatan Madu ……………………................................. 8

2.2.2. Jenis-Jenis Madu ……………………………………….………… 9

2.2.3. Komposisi Madu ……………………………………….………… 10

2.2.4. Persyaratan Mutu Madu ………………………………………….. 11

2.3. Kanker …………………………………………………..……………….. 11

2.4. Kanker Paru-Paru ………………………………………..…….………… 12

2.5. Sel Kanker Paru-Paru A549 ……………………………..….…………… 15

2.6. Regulasi Siklus Sel ……………………………………..……….............. 16

2.6.1. Checkpoint Pada Siklus Sel ……………………………………... 20

2.6.2. P53 pathway …………………………………………………….. 20

2.7. Uji Toksisitas ……………………………………………….….………... 26

2.8. MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) assay… 27

BAB III METODE PENELITIAN ……………………………………..…. 29

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ………………………………………….. 29

3.2. Alat dan Bahan Penelitian ……………………………….……………... 29

ix

3.2.1. Bahan Penelitian ………………………………..………............. 29

3.2.2. Peralatan Penelitian ……………………………..……………… 30

3.3. Prosedur Penelitian ……………………………………….……………. 31

3.3.1. Tahapan Penelitian ……………………………………..………. 31

3.3.2. Uji Fitokimia ……………..…………………………….………. 32

3.3.3. Ekstraksi Madu ………………………..……………………….. 33

3.3.4. Partisi Cair-Cair …………………………….………………….. 33

3.3.5. Uji Sitotoksisitas …………………………………….…............. 34

3.4. Analisis Data …………………….…..…………………………………. 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………….. 37

4.1. Ekstraksi Madu ………………..……………………………….……..... 37

4.2. Ekstraksi Cair-Cair ………………….…………………………….…… 37

4.3. Uji Fitokimia …………………………………………………….…….. 40

4.4. MTT assay …………………………………………………….….……. 41

4.5. Mekanisme Apoptosis ….………………………………….………..…. 50

BAB V PENUTUP ……………………….…………………………….….. 53

5.1. Simpulan ……………….………………………………………………. 53

5.2. Saran …………………………………………………………………… 53

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………... 55

LAMPIRAN ………………………………………..……………………... 61

x

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Tabel Persyaratan Mutu Madu ………………………….………. 11

Tabel 2. Tabel Ekstraksi Cair-Cair ……………………………….……… 38

Tabel 3. Tabel Uji Fitokimia Madu ……………………………….……... 40

xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Apis mellifera ……….. ……………………………………….. 7

Gambar 2. Struktur Quercetin, Asam Galat dan Luteolin ...………………. 10

Gambar 3. Hubungan Timbal Balik Antara Madu dan Kanker …….…….. 14

Gambar 4. Sel A549 …………..…………………………………………… 15

Gambar 5. Ilustrasi Siklus Sel …………………………………………….. 19

Gambar 6. Skematik Domain P53 …….………………………………….. 22

Gambar 7. Onkogen dan DNA Damage Agent dalam Pengaktifan P53….. 23

Gambar 8. Regulasi P53 Oleh Mdm2 dan P19ARF (Alternate Reading

Frame) …………………………………………………………. 24

Gambar 9. Struktur MTT dan Formazan ………………………………….. 27

Gambar 10. Ekstraksi Cair-Cair Dengan Corong Pisah ………………......... 39

Gambar 11. Proses MTT Assay ……………………………….………......... 42

Gambar 12. Reaksi Pada MTT Assay …………………………………......... 42

Gambar 13. Penghambatan Ekstrak Madu Fraksi Air ……..……………….. 43

Gambar 14. Penghambatan Ekstrak Madu Fraksi Etil Asetat ……..……….. 44

Gambar 15. Penghambatan Terbaik Setiap Sampel …………….………….. 45

Gambar 16. Skema Persentasi Aktivitas Antikanker Madu ………….…….. 48

Gambar 17. Proses Penghambatan A549 Oleh Madu ……………..………. 50

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil MTT assay fraksi Air …………………………………... 61

Lampiran 2. Hasil MTT assay fraksi Etil Asetat .………………………….. 62

Lampiran 3. Hasil MTT assay fraksi Atr Air …………………………........ 63

Lampiran 4. Hasil MTT assay fraksi Atr Etil Asetat……………………….. 64

Lampiran 5. Hasil MTT assay fraksi Bkld Air …………………………….. 65

Lampiran 6. Hasil MTT assay fraksi Bkld Etil Asetat……………………… 66

Lampiran 7. Hasil MTT assay fraksi Crb Air ……………………………… 67

Lampiran 8. Hasil MTT assay fraksi Crb Etil Asetat………………………. 68

Lampiran 9. Hasil MTT assay fraksi Dklx Air ……………………………. 69

Lampiran 10. Hasil MTT assay fraksi Dklx Etil Asetat…………………….. 70

Lampiran 11. Hasil MTT assay % Penghambatan Tertinggi ……………….. 71

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kanker merupakan salah satu masalah kesehatan yang diperhatikan serius

di bidang kedokteran. Prevalensi kanker di Indonesia cukup tinggi dengan nilai 1,4

per 100 penduduk atau sekitar 347.000 orang (Badan Penelitian dan Pengembangan

Kesehatan, 2013). Total kematian akibat kanker paru-paru di Indonesia mencapai

angka 21,8% dari total kematian akibat kanker dan 70% diantaranya adalah laki-

laki (World Health Organization, 2014). Kanker merupakan penyakit yang ditandai

oleh mekanisme yang tidak normal dan tidak terkontrol pada pengaturan

kelangsungan hidup, pertumbuhan (diferensiasi) dan perkembangan (proliferasi)

sel. Tingkat kelangsungan hidup penderita kanker dipengaruhi oleh beberapa faktor

seperti jenis kanker, tahap penyebaran kanker ketika terdiagnosa dan ketersediaan

perlakuan medis (Torre et al., 2015). Strategi terbaru dalam terapi kanker adalah

dengan mendorong penghancuran sel (apoptosis) dalam sel tumor yang ditandai

dengan aktifnya protein dalam sel, penyusutan sel, terbentuknya tonjolan pada

membrane sel dan fragmentasi DNA (Rupachandra dan Sarada 2014). Kanker

disebabkan oleh faktor eksternal seperti rokok, infeksi organisme dan pola hidup

yang tidak sehat, dan faktor internal seperti mutasi genetik turunan, hormone dan

kondisi imunitas (Torre et al,. 2015).

Sel A549 merupakan sel adenocarcinomic human alveolar basal epithelial

cells pada paru-paru yang bertugas pada difusi dari zat seperti air dan elektrolit di

2

alveolus. Sel A549 merupakan sel hipotriploid dengan nomor kromosom 66. Sel

ini biasa digunakan untuk sebagai sel model penelitian penyakit pernapasan seperti

kanker paru-paru, asthma, kerusakan jaringan karena penghirupan asbestos dan

kerusakan kantung paru-paru (emfisema) akibat rokok (Lakshmanan, 2013).

Saat ini penelitian mengenai kanker paru-paru belum banyak dilakukan,

mengingat kanker paru-paru merupakan kanker dengan persentase kematian

terbesar diantara kanker lainnya yaitu sebesar 70% dari penderita kanker paru-paru

meninggal dunia (Kementrian Kesehatan RI, 2015). Madu terbukti memiliki

aktivitas antikanker dan merupakan salah satu komoditas hutan bukan kayu dengan

produksi di Indonesia mencapai 4000 ton pertahun serta mudah untuk ditemui di

pasaran oleh semua kalangan (Novandra dan Widnyana, 2013).

Madu mengandung enzim seperti katalase, glukosa oksidase dan

peroksidase serta kandungan non enzimatik seperti karotenoid, asam amino,

protein, asam organik, produk reaksi Maillard dan lebih dari 150 senyawa polifenol

termasuk flavonoid, flavonol, asam fenolik, katekin dan turunan asam sinamat

(Ferreira et al., 2009). Madu adalah cairan manis yang diperoleh dari sekresi gula

tanaman (nektar) melalui pemuntahan (regurgitasi), aktivitas enzimatik dan

penguapan air oleh lebah madu (Hamdan, 2010). Madu juga mengandung asam

fenolik dan flavonoid seperti kuersetin, asam galat dan luteolin yang berperan

penting dalam aktivitas antioksidan (Alvarez-Suarez et al., 2014). Sejak zaman

Rasulullah SAW, madu telah banyak digunakan untuk pengobatan. Allah SWT

berfirman dalam Al-Qur’an pada surat An-Nahl ayat 69 yang berbunyi:

3

“Kemudian makanlah dari segala (macam) buah-buahan lalu tempuhlah

jalan Tuhanmu yang telah dimudahkan (bagimu). Dari perut lebah itu keluar

minuman (madu) yang bermacam-macam warnanya, di dalamnya terdapat zat yang

menyembuhkan bagi manusia. Sungguh, pada yang demikian itu benar-benar

terdapat tanda (kebesaran Allah) bagi orang yang berpikir” (QS. An-Nahl 16 : 69).

Madu yang banyak beredar di pasar Indonesia adalah madu dengan sumber

nektar tanaman yang banyak terdapat di wilayah Indonesia. Madu multiflora adalah

madu yang berasal dari beragam jenis nektar yaitu madu hutan dan madu trigona.

Madu monoflora adalah yang madu yang berasal dari satu jenis nektar yaitu madu

kelengkeng, kaliandra, rambutan dan mangga. Madu rambutan dapat menghambat

aktivitas radikal bebas sebesar 45.3% pada konsentrasi 1mg/L dibandingkan

kuersetin secara in vitro (Yuslianti et al., 2015).

Penelitian telah membuktikan bahwa fraksi etil asetat dari madu timi

mampu menghambat sel kanker prostat (PC-3) dan sel kanker payudara (MCF-7)

sebesar 30% terhadap kontrol positif doxorubicin (Spiloti et al., 2014). Sampel

madu lokal memiliki potensi sebagai antikanker dengan nilai LC50 yang diperoleh

dari metode Brine Shrimp Lethaly Test (BSLT) pada madu dari Bali sebesar 1,50

ppm (Sumarlin et al., 2014). Madu diuji dengan MTT assay menunjukkan nilai

4

IC50 sebesar 4 ppm terhadap sel kanker prostat (PC-3) dalam 72 jam (Saeed et al.,

2010).

Meskipun penelitian mengenai madu telah banyak dilakukan, namun

penelitian terkait madu lokal Indonesia masih sedikit dibahas. Oleh karena itu

tinjauan lebih dalam mengenai efektivitas madu sebagai asupan tambahan penderita

kanker dan aktivitas antikanker ekstrak madu terhadap sel kanker paru-paru

diperlukan sehingga nantinya dapat digunakan sebagai suplemen terapi alternatif

tambahan pada penderita kanker paru-paru.

1.2. Rumusan Masalah

1. Apakah ekstrak madu lokal memiliki aktivitas antikanker paru-paru

melalui penghambatan sel A549 secara in vitro?

2. Adakah pengaruh sumber nektar madu lokal terhadap aktivitas

antikanker melalui penghambatan sel A549?

1.3. Hipotesa Penelitian

1. Ekstrak madu lokal memiliki kemampuan menghambat sel A549.

2. Terdapat perbedaan aktivitas antikanker pada madu dari sumber nektar

yang berbeda.

1.4. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui aktivitas antikanker pada madu lokal.

5

2. Mengetahui jenis madu lokal terbaik yang memiliki kemampuan

menghambat sel A549.

1.5. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi aktivitas antikanker

ekstrak madu lokal sebagai alternatif terapi antikanker khususnya kanker paru-paru.

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Morfologi dan Klasifikasi Lebah Madu

Lebah madu telah tersebar ke seluruh penjuru dunia. Mereka hidup di

daerah beriklim dingin panjang hingga daerah beriklim tropis yang memiliki suhu

lebih tinggi. Lebah madu memiliki kemampuan beradaptasi yang amat baik

terhadap perubahan iklim dan lingkungan. Spesies lebah madu yang paling unggul

dalam sisi ekonomi, agrikultur dan lingkungan adalah Apis mellifera (Gupta et al.,

2014).

Apis mellifera tergolong ke dalam lebah madu berukuran sedang. Di alam,

Apis mellifera bersarang di goa, karang dan celah pepohonan. Sarangnya terdiri

atas beberapa kepingan yang tersusun parallel satu dengan lainnya dengan jarak

yang seragam dan hanya memiliki 1 buah pintu masuk. Populasi Apis mellifera

dalam satu koloni terdiri atas 15.000 – 60.000 lebah (Gupta et al., 2014).

Klasifikasi lebah madu

Divisio : Arthropda

Subdivio : Mandibulata

Classis : Insecta (Hexapoda)

Ordo : Nymenoptera

Genus : Apidea

Species : Apis indica, Apis mellifera, Apis dorsata, dan Apis trigona

Terdapat tujuh spesies lebah madu diketahui termasuk dalam genus Apis

yaitu : Apis dorsata, Apis laboriosa, Apis mellifera, Apis florea, Apis andreniformis,

Apis cerana dan Apis koschevnikovi (Cramp, 2008). Lebah madu yang ada di alam

7

Indonesia antara lain Apis dorsata, Apis cerana dan Apis andreniformis, sedangkan

di Kalimantan terdapat Apis koschevnikovi (Muslim, 2014). Apis mellifera

memiliki keanekaragaman yang melimpah, setidaknya ada 29 subspesies atau ras

yang telah diketahui. Sebagian besar kelompok lebah ini ditujukan untuk diambil

produk madunya.

Gambar 1. Apis mellifera (Sunita et al., 2017)

Gambar 1 menunjukkan perbandingan perbedaan ukuran antara setiap

bagian dari Apis mellifera. Ratu lebah memiliki tubuh yang relatif lonjong dan

berukuran 2-2.2 cm, memiliki lidah dan sayap pendek. Ratu lebah umumnya hanya

ada satu ekor pada setiap koloni, terkadang ada dua ratu jika ratu yang lebih tua

sudah akan digantikan dengan yang baru. Tugas dari ratu lebah adalah untuk

bertelur. Seekor ratu lebah yang sehat mampu bertelur hingga 1500 telur per hari.

Lebah pekerja memiliki ukuran tubuh sekitar ½ inci, memiliki lidah yang dua kali

lebih panjang dari ratu dan sayap yang besar hingga menutupi tubuhnya.

Pejantannya memiliki tubuh yang relatif lebih besar dari pekerja dan ratu, memiliki

mata yang menutupi hampir seluruh bagian kepala dan ditubuhnya memiliki rambut

8

kecil. Pejantan tidak dapat menyengat dan mengumpulkan nektar, tubuhnya

diprioritaskan untuk membuahi ratu (Sunita, 2017).

2.2 Madu

Madu adalah produk alami manis yang memiliki nutrisi tinggi bagi

kesehatan manusia dengan kandungan antioksidan, bakteriostatik, anti inflamasi

dan anti mikroba juga penyembuh luka (Alvarez et al., 2013). Madu diproduksi

oleh lebah dari nektar tanaman, sekresi dan eksresi tanaman. Kandungan madu

meliputi gula yang didominasi oleh fruktosa dan glukosa serta senyawa fenolik

(Bogdanov et al., 2008; Alvarez et al., 2010).

2.2.1 Proses pembuatan madu

Pembuatan madu adalah tugas utama bagi lebah madu pekerja. Lebah madu

pekerja terbang tanpa mengenal lelah dari pagi hingga petang ke segala arah dan

ketinggian berbeda dalam radius 3-5 kilometer dari sarang untuk mengumpulkan

nektar dari bunga tanaman dan pepohonan. Nektar adalah bahan dasar dari madu

yang mengandung 20-60% gula dan 40-80% air. Selain gula nektar mengandung

mineral, asam organik, vitamin, pigmen dan senyawa aromatik.

Lebah madu pekerja bekerja sama dalam memproduksi madu. Proses

diawali dengan lebah pencari madu meninggalkan sarang untuk mencari nektar.

Lebah madu akan menghisap nektar dari bunga dengan menggunakan proboscis

(lidah) dan menyimpannya di kantong khusus madu di tubuh lebah. Kantong ini

dapat menampung sekitar 4 mg nektar atau setengah dari berat badan lebah pekerja.

Lebah madu akan terbang ke bunga lainnya jika nektar telah dihisap habis. Lebah

9

madu membutuhkan 50-150 bunga untuk mengisi penuh kantong madu tergantung

dari spesies bunga. Lebah madu dengan kantong madu yang penuh akan kembali

ke sarang dan menambahkan enzim invertase selama perjalanan (Hamdan, 2010).

Lebah madu kembali ke sarang dan menyerahkan nektar yang telah

diperoleh ke lebah pekerja lain dan menyimpannya di rongga sarang lebah madu.

Lebah madu ini akan mengibaskan sayapnya guna mempercepat proses penguapan

air dari nektar sehingga madu dapat terbentuk. Madu yang telah matang memiliki

kandungan air antara 17-20%. Enzim lainnya ditambahkan sebelum madu

disimpan guna mencegah fermentasi dan serangan bakteri. Lebah madu akan

mengisi madu yang telah matang hingga rongga penuh selanjutkan akan ditutup

permukaan rongganya dengan lapisan lilin lebah hingga madu akan dipakai di

kemudian hari (Hamdan, 2010).

2.2.2 Jenis-jenis madu

Berdasarkan asalnya madu dapat dikelompokkan menjadi beberapa kategori

: (1) madu bunga, merupakan madu yang diperolah dari nektar bunga; (2) madu

honeydew, merupakan madu yang diperoleh dari honeydew atau cairan dengan

kandungan gula tinggi yang di sekresikan dari serangga genus Rhynchota; (3) madu

monoflora, merupakan madu yang diperoleh dari nektar satu jenis tanaman; (4)

madu multiflora (polyflora), merupakan madu yang diperoleh dari nektar

bermacam-macam tanaman (Alvarez-Suarez et al., 2014).

10

2.2.3 Komposisi madu

Komposisi madu sangat berpengaruh dari sumber nektar dan musim serta

faktor lingkungan juga dapat mempengaruhi komposisi dan efek biologis (Alvarez

et al., 2010). Kandungan terbesar pada madu adalah fruktosa (38%) dan glukosa

(31%), sukrosa (1%), air (18%), dan gula lainnya (7%) yang menyebabkan madu

memiliki viskositas yang tinggi, kecenderungan menyerap air dan imunitas

terhadap beberapa pembusukan (Salih et al., 2009). Madu juga mengandung

polifenolik dan flavonoid yang mana berperan penting dalam aktivitas antioksidan

(Alvarez-Suarez et al., 2014). Asam fenolat dan flavonoid yang terkandung dalam

madu diantaranya adalah kuersetin, asam galat dan luteolin (Alvarez-Suarez et al.,

2014).

(a) (b) (c)

Gambar 2. Struktur (a) kuersetin (Salem Alrawaiq dan Abdullah, 2014), (b) asam

galat (Nayeem et al., 2016) dan (c) luteolin (Tongda et al., 2012)

Madu juga mengandung Asam fenolat dan flavonoid. Asam fenolat dan flavonoid

yang terkandung pada madu diantaranya adalah kuersetin, asam galat dan luteolin

(Alvarez-Suarez et al., 2014).

11

2.2.4 Persyaratan mutu madu (SNI 01-3545-2004)

Sesuai dengan SNI 01-3545-2004 tentang madu, persyaratan mutu madu

adalah sebagai berikut.

Tabel 1. Tabel persyaratan mutu madu (SNI 01-3545-2004)

No Jenis uji Satuan Persyaratan

1 Aktifitas enzim diastase DN minimal 3

2 Hidroksimetilfurfural (HMF) Mg/kg maksimal 50

3 Air % b/b maksimal 22

4 Gula pereduksi (dihitung

sebagai glukosa)

% b/b minimal 65

5 Sukrosa % b/b maksimal 5

6 Keasaman mL NaOH

1 N/kg

maksimal 50

7 Padatan yang tak larut dalam air % b/b maksimal 0,5

8 Abu % b/b maksimal 0,5

9 Cemara logam Timbal (Pb)

Tembaga (Cu)

mg/kg

mg/kg

maksimal 1,0

maksimal 5,0

10 Cemara arsen (As) mg/kg maksimal 0,5

2.3 Kanker

Kanker merupakan penyakit akibat pertumbuhan sel yang tidak terkontrol

dan tidak normal dibandingkan dengan sel lainnya. Sel normal patuh terhadap

sinyal yang memerintahkan sel untuk membelah untuk membentuk sel lainnya atau

mati. Sel kanker mengembangkan dirinya tanpa menghiraukan perintah sinyal yang

datang sehingga menimbulkan pertumbuhan dan proliferasi yang tidak terkontrol

hingga dapat menyebabkan kematian akibat metastatis yaitu penyebaran sel kanker

12

melalui pembuluh darah (Momna, 2010). Kanker disebabkan oleh faktor eksternal

seperti rokok, infeksi organisme dan pola hidup yang tidak sehat, dan faktor internal

seperti mutasi genetik turunan, hormon kondisi imunitas dan mutasi yang timbul

dari metabolisme tubuh. Faktor-faktor ini dapat bekerja bersamaan sehingga

menyebabkan kelainan pada sel dan proliferasi berlebih (Torre et al., 2015).

Sel kanker memiliki enam karakter umum (The six hallmark of cancer),

enam karakter tersebut adalah sebagai berikut: (1) Immortalitas, yaitu pemisahan

sel yang berkelanjutan dan replikasi tak terbatas; (2) Onkogen dapat memproduksi

sinyal pertumbuhan sehingga selalu tumbuh berkelanjutan; (3) Mengabaikan sinyal

penghambat pertumbuhan dari tubuh; (4) Tidak peka terhadap sinyal apoptosis

karena terjadi mutasi pada regulator apoptosis; (5) Angiogenesis, dapat

menumbuhkan pembuluh darah baru disekitar jaringan kanker untuk bertahan

hidup; (6) Metastatis, kemampuan untuk berpindah ke lokasi sekunder atau tersier

lewat pembuluh darah dan merupakan faktor utama terjadi kematian pada penderita

kanker (Momna, 2010).

2.4 Kanker paru-paru

Kanker paru-paru merupakan kanker yang mempunyai tingkat insidensi

kematian tertinggi di dunia untuk laki-laki dan kedua untuk perempuan, tercatat 1,6

juta kematian pada 2012 (1,1 juta pada laki-laki dan 491.200 kematian pada

perempuan) (Torre et al., 2015).

Kanker paru-paru termasuk golongan kanker ganas yang tumbuh tak

terkendali di salah satu atau kedua bagian paru-paru. Kanker paru dapat menyebar

13

ke lokasi lainnya seperti kelenjar getah bening, otak, hati dan tulang. Faktor-faktor

penyebab kanker paru-paru tidak sepenuhnya diketahui namun sebagian besar

penderita kanker paru-paru berkaitan dengan hal-hal antara lain perokok aktif,

perokok pasif, penghirup asbestos, penghirup unsur lainnya seperti besi, nikel dan

gas buang, riwayat kesehatan keluarga, riwayat kesehatan pribadi dan lansia

(Cancer Counsil Australia, 2016).

Antioksidan yang tinggi menjadikan madu memiliki potensi untuk

mencegah pertumbuhan kanker akibat radikal bebas yang mendorong pembentukan

sel kanker (Valko et al., 2007). Kandungan fitokimia pada madu dapat dianggap

juga sebagai asam fenolat dan polifenol. Beragam jenis polifenol dilaporkan

memiliki sifat antiproliferatif terhadap beberapa macam kanker (Jaganathan dan

Mandal, 2009). Gambar 3 menunjukkan sifat madu lainnya terhadap faktor

penyebab kanker.

14

Gambar 3. Hubungan timbal balik antara madu dan kanker (Othman, 2012).

Madu telah diketahui sebagai obat dan tambahan nutrisi untuk kesehatan sejak

lama. Madu mengandung berbagai macam fitokimia dengan kandungan fenolik

dan flavonoid yang menjadikan madu memiliki tingkat antioksidan yang tinggi

(Lurlina et al., 2009). Penelitian lain mengenai ekstrak etanol dari kemangi

menunjukkan aktivitas sitotoksik pada sel kanker paru A549 melalui mekanisme

apoptosis (Magesh et al., 2009). Kim et al., (2010) juga menyatakan bahwa ekstrak

etanol daun kemangi memiliki aktivitas sitotoksik dan anti metastatik pada sel

kanker paru Lewis Lung Carcinoma (LLC) melalui aktivasi enzim oksidasi.

SIFAT-SIFAT MADU PENYEBAB KANKER

Antioksidan Tinggi

Agen Scavenging untuk

radikal bebas toksik

Antimikroba Alami

Boster Imun alami

Agen Anti-inflamasi alamI

Penyembuhan ulser

kronik dan luka

Agen terapi kanker

Akumulasi spesies oksigen

rekatif karena: rokok, alkohol,

obesitas, infeksi kronik dll

Infeksi kronik, seperti bakteri

(H. Pylori), virus (HPV, EBV,

Hepatitis B, C), parasit

(skitosomiasis), fungi

(Aspergillus flavus)

Status imun rendah seperti

diabetes, sakit kronis, obesitas

Inflamasi kronis seperti

karsinoma kolorektal pada

penyakit Chron’s dan kolitis

ulseratif

Pewarisan genetik

Penyebab yang tidak

diketahui

MADU KANKER

15

Kemampuan antikanker juga dipengaruhi oleh berbagai mekanisme fungsional

pada madu (Gambar 3). Oleh karena itu madu merupakan bahan yang sangat

berpotensi untuk menjadi antikanker.

2.5. Sel kanker paru-paru A549

Sel A549 adalah sel yang diperoleh dari jaringan kanker paru-paru dari pria

Kaukasia berusia 58 tahun. Sel A549 merupakan sel epitel alveolus yang bersifat

skuamosa dan bertugas untuk melakukan difusi antara senyawa seperti air dan

elektrolit pada alveolus paru-paru. Sel A549 digunakan dalam riset sebagai model

dari pneumosit Alveolar Tipe II (ATII) dari paru-paru manusia. Isolasi terhadap

sel A549 membuktikan bahwa sel ini mampu menunjukkan karakteristik yang sama

dengan fenotip sel epitel ATII (Jim, 2012). Sel A549 juga digunakan untuk

menginvestigasi penyakit pernapasan seperti kanker paru-paru, asthma, kerusakan

jaringan akibat asbestos, dan kerusakan kantung paru-paru (emfisema) akibat rokok

(Lakshmanan, 2013).

16

Gambar 4. Sel A549 (Jim, 2012)

Madu dapat menghambat pertumbuhan sel (apoptosis) dengan cara

menstimulasi makrofag sehingga makrofag akan melepaskan sitokin TNF-α,

interleukin-1 (IL-1) dan interlueken-6 (IL-6). Madu kemudian akan merangsang

monosit untuk melepaskan Tumor Nekrosis Faktor- α dan Interleukin 1β dan IL-6.

Mekanisme yang terjadi akan melibatkan pengikatan TNF-R ke TNF- α dan protein

adaptor seperti TNFR Associated Death Domain protein (TRADD), TNF Reseptor

Associated Factor (TRAF) dan Receptor Interact Protein (RIP) untuk mengatur

apoptosis dan inflamasi melalui sitokin. Pelepasan TNF- α dapat memainkan peran

kunci untuk mengatur proses penting dalam sel seperti apoptosis, proliferasi sel dan

inflamasi sel (Ahmed dan Othman, 2013).

17

2.6. Regulasi Siklus Sel

Siklus sel merupakan proses vital dalam kehidupan setiap organisme.

Secara normal, siklus sel menghasilkan pembelahan sel. Pembelahan sel terdiri dari

2 proses utama, yaitu replikasi DNA dan pembelahan kromosom yang telah

digandakan ke 2 sel anak. Secara umum, pembelahan sel terbagi menjadi 2 tahap,

yaitu mitosis (M) (pembelahan 1 sel menjadi 2 sel) dan interfase proses di antara 2

mitosis). Interfase terdiri dari fase gap 1 (G1), sintesis DNA (S), gap 2 (G2). Setiap

tahap dalam siklus sel dikontrol secara ketat oleh regulator siklus sel, yaitu:

a. Cyclin. Jenis cyclin utama dalam siklus sel adalah cyclin D, E, A, dan B.

Cyclin diekspresikan secara periodik sehingga konsentrasi cyclin berubah-

ubah pada setiap fase siklus sel. Berbeda dengan cyclin yang lain, cyclin D

tidak diekspresikan secara periodik akan tetapi selalu disintesis selama ada

stimulasi growth factor.

b. Cyclin-dependent kinases (Cdk). Cdk utama dalam siklus sel adalah Cdk 4,

6, 2, dan 1. Cdks merupakan treonin atau serin protein kinase yang harus

berikatan dengan cyclin untuk aktivasinya. Konsentrasi Cdks relatif konstan

selama siklus sel berlangsung. Cdks dalam keadaan bebas (tak berikatan)

adalah inaktif karena catalytic site, tempat ATP dan substrat berikatan diblok

oleh ujung C-terminal dari CKIs. Cyclin akan menghilangkan pengebloka

tersebut. Ketika diaktifkan, Cdk akan memacu proses downstream dengan

cara memfosforilasi protein spesifik.

c. Cyclin–dependent kinase inhibitor (CKI), merupakan protein yang dapat

menghambat aktivitas Cdk dengan cara mengikat Cdk atau kompleks cyclin

18

Cdk. Cyclin–dependent kinase inhibitor terdiri dari dua kelompok protein

yaitu INK4 (p15, p16, p18, dan p19) dan CIP/KIP (p21, p27, p57). Keluarga

INK4 membentuk kompleks yang stabil dengan Cdk sehingga mencegah Cdk

mengikat cyclin D. INK4 bertugas mencegah progresi fase G1. Keluarga

CIP/KIP meregulasi fase G1 dan S dengan menghambat kompleks G1 cyclin

Cdk dan cyclin B-Cdk1. Protein p21 juga menghambat sintesis DNA dengan

menonaktifkan proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Ekspresi p21

diregulasi oleh p53 karena p53 merupakan faktor transkripsi untuk ekspresi

p21 (Sarmoko dan Larasati, 2009)

Siklus sel dimulai dari masuknya sel dari fase G0 (quiescent) ke fase G1

karena adanya stimulus oleh growth factor. Pada awal fase G1, Cdk 4 dan atau 6

diaktifkan oleh cyclin D (cycD). Kompleks Cdk 4/6 dengan cycD akan menginisiasi

fosforilasi dari keluarga protein retinoblastoma (pRb) selama awal G1. Efek dari

fosforilasi ini, fungsi histon deasetilasi (HDAC) yang seharusnya menjaga

kekompakan struktur kromatin menjadi terganggu. Akibatnya struktur DNA

menjadi longgar dan faktor transkripsi yang semula diikat pRb menjadi lepas dan

transkripsi dari E2F responsive genes yang dibutuhkan dalam progresi siklus sel ke

fase S menjadi aktif. Gen tersebut antara lain cycE, cycA, Cdc25, DNA polimerase,

timidilat kinase, timidilat sintetase dan DHFR (Satyanarayana dan Kaldis, 2009).

Pada transisi fase G1 ke fase S, Cdk2 aktif dengan mengikat cycE.

Kompleks tersebut melanjutkan proses fosforilasi pRb (status hiperfosforilasi)

supaya proses transkripsi yang dipacu E2F tetap aktif dan Restriction point (R) yang

ada di batas fase G1/S dapat terlampaui. Pada saat inilah cycA ditranskripsi

19

(Satyanarayana dan Kaldis, 2009). Selama G1/S, kompleks Cdk2-cycE juga

memfosforilasi inhibitor p27 sehingga p27 terdegradasi. Ketika siklus sel akan

memasuki fase S, cycE akan didegradasi dan Cdk2 yang dibebaskan akan mengikat

cycA (Sarmoko dan Larasati, 2009).

Kompleks Cdk2-cycA dibutuhkan sel untuk mereplikasi DNA selama fase

S. Kompleks Cdk2-cycA akan memfosforilasi protein yang dibutuhkan dalam

replikasi DNA supaya aktif, contohnya adalah protein CDC6 (Cell Division Cycle

6). Kompleks tersebut juga menjaga supaya tidak terjadi multiplicity replikasi

DNA. Pada akhir fase S, cycA akan melepas Cdk2 dan mengikat Cdk1 (Cdc2) yang

meregulasi transisi sel dari S ke G2. Kompleks cycA-Cdk1 akan memfasilitasi

kondensasi kromatin yang dibutuhkan untuk penggandaan sel Pada fase G2, sel

juga memiliki kesempatan melakukan mekanisme repair apabila terjadi kesalahan

sintesis DNA (Lapenna dan Giordano, 2009)

20

Gambar 5. Ilustrasi siklus sel. (Lapenna dan Giordano, 2009)

Memasuki fase mitosis, cycA akan didegradasi dan terjadi peningkatan

ekspresi cycB yang akan mengikat Cdk1. Kompleks Cdk1-cycB secara aktif

memacu mitosis. Kompleks cycB-Cdk1 berperan penting dalam control

rearrangement mikrotubul selama mitosis (Lapenna dan Giordano, 2009).

Cdk1 dapat dinonaktifkan oleh Wee1 dan Myt1 dengan cara Wee1 dan

Myt1 akan memfosforilasi Cdk1 pada tirosin-15 dan atau threonin-14. Defosforilasi

pada situs tersebut dapat dilakukan oleh Cdc25 sehingga Cdk 1 menjadi aktif

kembali dan siklus sel tetap berlangsung. Pada akhir fase mitosis, cycB akan

didegradasi oleh anaphase promoting complex (APC) melalui proses proteolitik.

APC juga berfungsi untuk memacu kromatid untuk berpisah bergerak ke masing-

21

masing kutub untuk menyelesaikan mitosis (anafase) (Lapenna dan Giordano,

2009).

2.6.1. Checkpoint pada siklus sel

Siklus sel melakukan mekanisme checkpoint untuk menjamin bahwa DNA

berduplikasi dengan akurat dan separasi dari kromosom terjadi dengan benar.

Checkpoint bertugas mendeteksi kerusakan DNA. Apabila terdapat kerusakan

DNA, checkpoint akan memacu cell cycle arrest sementara untuk perbaikan DNA

atau cell cycle arrest permanen sehingga sel memasuki fase senescent. Bila

mekanisme cell cycle arrest tidak cukup menjamin DNA yang rusak diduplikasi,

maka sel akan dieliminasi dengan cara apoptosis (Sarmoko dan Larasati, 2009).

Faktor checkpoint pertama pada sel mamalia dikenal dengan restriction

point (R) dan muncul menjelang akhir G1. Pada checkpoint ini, DNA sel induk

diperiksa apakah terdapat kerusakan atau tidak. Bila terdapat DNA yang rusak,

siklus sel dihentikan hingga mekanisme repair DNA rusak telah selesai. Setelah

melampaui R, sel menjadi commited (komitment) untuk menyelesaikan

keseluruhan satu siklus (no return point) dan selanjutnya sel harus mampu

melakukan replikasi DNA. Bila tidak melampaui R, sel dapat kembali ke fase G0.

Hilangnya kontrol dari R akan menghasilkan survival DNA yang rusak (Sarmoko

dan Larasati, 2009).

2.6.2 P53 pathway

Pada checkpoint G1/S, kerusakan DNA dapat memacu cell cycle arrest dan

proses ini adalah p53-dependent. Secara umum, level p53 sel rendah karena

22

diregulasi negatif oleh mdm2 yang menarget degradasi p53, namun kerusakan DNA

dapat menginduksi aktivitas p53 dengan cepat.

P53 dikontrol oleh mdm2 dan p19ARF. Level protein p53 secara normal

adalah pada konsentrasi rendah di dalam sel. Namun, sekali distimulasi, level

protein secara cepat akan meningkat sepanjang waktu paruhnya, sedangkan level

mRNA relatif tidak berubah. Regulasi p53 terjadi pada level protein (bukan DNA

atau RNA) adalah hal yang sangat kritikal pada aktivasinya. Regulator negatif p53

yaitu mdm2 yang merupakan suatu p53-responsive gene (gen yang terekspresi

melalui faktor transkripsi p53).

Sehingga dapat dibayangkan di sini ada loop umpan balik negatif di sini.

p53 teraktifkan dan kemudian meningkatkan level mdm2. Mdm2 kemudian

menonaktifkan p53. Dengan cara mengikat kompleks atau mendegradasi p53. Jika

sel ingin menaikkan level protein p53 maka sel perlu menghambat mdm2.

Sel dapat menghambat mdm2 tergantung pada rangsangan seperti agen

perusak DNA (radiasi, UV, obat kemoterapi). DNA damage agent akan

menginduksi aktivasi kinase (seperti ATM dan DNA-PK) yang dapat

memfosforilasi critical residu serin dalam domain Mdm2-binding domain dari p53

(Sarmoko dan Larasati, 2009).

23

Gambar 6. Skematik domain p53 termasuk yang terlibat dalam stabilisasi,

aktivasi dan penekanan (Sarmoko dan Larasati, 2009)

Fosforilasi p53 pada serin-15 dan serin-37 oleh ATM atau protein kinase

lain setelah terjadi kerusakan DNA dapat mencegah ikatan MDM2 dengan p53.

Ketika p53 terfosforilasi sini, dia tidak bisa lagi mengikat mdm2. Kemudian, inilah

yang mampu menghilangkan penghambatan p53 dimediasi mdm2. P53 mengenali

ketika sel telah mengalami kerusakan DNA dan menghentikan siklus sel (cell cycle

arrest) sehingga sel dapat memperbaiki kerusakan (repair), atau dalam banyak

kasus, hanya memberitahu sel untuk bunuh diri (apoptosis), yaitu dengan cara

menstimulasi transkripsi gen seperti p21 dan Bax sehingga siklus sel berhenti atau

terjadi apoptosis (Sarmoko dan Larasati, 2009).

24

Gambar 7. Onkogen dan DNA damage agent dalam pengaktifan p53 (Sarmoko dan

Larasati, 2009)

Onkogen dan DNA damage agent mengaktifkan p53 melalui mekanisme

yang berbeda. p19ARF bertindak sebagai perantara dalam aktivasi p53 oleh onkogen

mitogenik seperti E1A, Ras, c-myc. Sebaliknya, aktivasi p53 karena DNA damage

agent melibatkan de novo fosforilasi serin 15 pada domain p53 (dan residu lainnya)

oleh kinase seperti protein kinase DNA-dependent (DNA-PK) atau produk dari gen

ataksia-telangiectasia (ATM). Aktivasi p53 dari onkogen tidak meliputi fosforilasi

serin-15 dan aktivasi p53 akibat kerusakan DNA tidak diimbangi dengan

keberadaan ARF. Oleh karena itu, dua jalur sinyal upstream ke p53 secara

fundamental berbeda. Mekanisme lain untuk menghambat mdm2 adalah dengan

onkogen, suatu protein mutan konstitutif aktif yang terus-menerus memberitahu sel

25

untuk tumbuh (E1A, Ras, c-Myc). P53 akan mengenali ketika sel tumbuh tak

terkendali ini terjadi dan menghentikan siklus sel. Namun, onkogen tidak mengarah

pada pengaktifan ATM atau DNA-PK, pada kenyataannya, onkogen bahkan tidak

mengarah pada fosforilasi p53 pada domain MDM2-binding. (Sarmoko dan

Larasati, 2009)

Gambar 8. Regulasi p53 oleh mdm2 dan p19ARF (Alternate Reading Frame)

(Sarmoko dan Larasati, 2009)

Gen p53 adalah gen yang paling sering termutasi pada kanker. Padas el

normal, p53 penting pada kontrol checkpoint utama. P53 dapat mengenali ketika

ada kerusakan terjadi seperti kerusakan DNA atau sel terstimulasi oleh onkogen

26

dan segera menghentikan siklus sel untuk mencegah sel menjadi kanker. Jika

sebuah sel kehilangan p53, maka sel akan kehilangan fungsi checkpoint utamanya.

Pada sel kanker, tidak hanya p53 saja yang ditemukan termutasi, kelebihan ekspresi

mdm2 yang menghambat p53 dan hilangnya p19ARF juga terjadi.(Beckerman, 2010)

Checkpoint selanjutnya terdapat pada fase S yang berfungsi mendeteksi

kerusakan DNA yang direplikasi. Checkpoint replikasi DNA selesai. Checkpoint

terdapat kerusakan DNA, protein kinase ATR akan memfosforilasi Chk1, kemudian

Chk1 memfosforilasi Cdc25C pada serin kompleks cycB-Cdk1 yang bertanggung

jawab pada progresi fase G Selain itu, Chk1 juga memfosforilasi Cdc25A yang

bertugas mengaktifkan kompleks selanjutnya terdapat pada fase S yang berfungsi

mendeteksi kerusakan Checkpoint pada G2 mencegah inisiasi mitosis sebelum

sebelum selanjutnya terdapat pada fase S yang berfungsi mendeteksi kerusakan

pada G2 mencegah inisiasi mitosis sebelum sebelum Checkpoint utama dalam fase

S/G2/M adalah Chk1. Ketika terdapat kerusakan DNA, protein kinase ATR akan

memfosforilasi Chk1, kemudian dalam fase S/G2/M adalah Chk1. Ketika terdapat

kerusakan DNA, protein kinase ATR akan memfosforilasi Chk1, kemudian forilasi

Cdc25C pada serin-216. Fosforilasi tersebut menyebabkan Cdk1 yang bertanggung

jawab pada progresi fase G Fosforilasi tersebut menyebabkan Cdk1 yang

bertanggung jawab pada progresi fase G2/M tidak akif. Selain itu, Chk1 juga

memfosforilasi Cdc25A yang bertugas mengaktifkan kompleks cycE-Cdk2 dan

cycA-Cdk2 yang berperan pada progresi fase S. Dengan difosforilasinya Cdc25A

oleh Chk1, kompleks cyc-Cdk menjadi tidak aktif dan terjadi S arrest (Beckerman,

2010)

27

Checkpoint yang terakhir, disebut spindle checkpoint, bertugas menjaga

integritas genom menjelang akhir mitosis. Jika terjadi kegagalan pada penempatan

pasangan kromosom pada spindle, akan terjadi mitosis arrest. Pada sel kanker,

checkpoint tidak berfungsi dengan baik dan siklus sel berlangsung tanpa kendali

(Beckerman, 2010).

2.7. Uji Toksisitas

Uji sitotoksisitas adalah salah satu pengujian in vitro yang umum digunakan

dalam menentukan toksisitas berdasarkan pada jumlah sel mati atau penurunan

pertumbuhan sel. Penetapan jumlah sel yang hidup (viabilitas sel) dalam uji

sitotoksisitas dapat dilakukan berdasarkan pada beberapa parameter seperti

gangguan sintesis, kerusakan membrane, perubahan morfologi sel serta degradasi

makromolekul. Uji sitotoksis digunakan untuk menentukan nilai IC50 (Inhibition

Concentration). Nilai IC50 adalah asumsi hubungan antara dosis sebuah senyawa

dan respon dari pengujian yang dapat menghasilkan hambatan proliferasi sel

sebanyak 50%. Semakin besar nilai IC50 maka makin kecil toksisitas dari suatu

senyawa tersebut. Hasil dari uji toksisitas adalah informasi persentase sel yang

mampu bertahan hidup (Sebaugh, 2011).

2.8. MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) assay

MTT adalah metode penentuan viabilitas dan proliferasi sel berdasarkan

pengujian in vitro dari populasi sel tertentu terhadap faktor eksternal. Prinsip

metode MTT ini adalah terjadinya reduksi terhadap garam kuning tetrazolium MTT

28

(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) yang telah diabsorbsi ke

dalam sel menjadi kristal formazan berwarna ungu yang tidak larut air oleh enzim

suksinat dehidrogenase yang terdapat dalam jalur respirasi sel pada mitokondria

yang aktif pada sel yang masih hidup (Riss et al,. 2013).

Gambar 9. Struktur MTT dan Formazan (Riss et al., 2013)

Sel yang mampu bertahan akan melakukan metabolisme terhadap MTT dan

merubahnya menjadi formazan yang berwarna ungu dengan nilai absorbansi

maksimum mendekati 570 nm. Sel yang mati tidak dapat melakukan metabolisme

MTT menjadi formazan berwarna ungu, sehingga warna yang muncul adalah

penanda atas viabilitas sel sedangkan penanda untuk sel yang masih hidup berwarna

ungu. Penambahan larutan stopper (bersifat detergenik) akan melarutkan kristal

berwarna ini kemudian diukur absorbansinya menggunakan microplate reader.

Intensitas warna ungu yang dihasilkan dari pembentukan kristal formazan

berbanding lurus dengan jumlah sel hidup (Riss et al., 2013).

29

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Pusat Laboratorium Terpadu Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan pengujian sel

kanker paru-paru A549 dilakukan di Laboratorium Virologi Pusat Studi Satwa dan

Primata (PSSP) Bogor. Penelitian dilaksanakan mulai dari bulan Januari 2018 –

Mei 2018.

3.2. Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1. Bahan Penelitian

Sampel yang digunakan pada penelitian ini yaitu 4 macam sampel madu

berbeda yang didapatkan dari peternak madu di beberapa wilayah Indonesia yaitu

madu multiflora yakni madu trigona dan madu monoflora yakni madu kelengkeng,

madu rambutan serta madu kaliandra. Bahan kimia yang digunakan pada penelitian

ini yaitu Sel kanker paru-paru A549 (American Type Culture Collection CCL 185),

Dulbecco’s Modified Eagle’s (D-MEM), Fetal Bovine Serum (FBS) 5%, penicillin

100U/mL, streptomycin 100 ug/mL, Dimetil sulfoksida (DMSO), MTT (3-4,5-

Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-Difeniltetrazolium bromide 5 mg/mL, pelarut ekstraksi,

metanol p.a. (FULLTIME), n-heksana p.a. (FULLTIME), etil asetat p.a.

(SmartLab), aquadest dan Na2SO4 anhidrat p.a. (Merck).

30

3.2.2. Peralatan Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu alat gelas, corong pisah,

corong Buchner, evaporator, pompa vakum, kertas saring whatman, pembaca piring

mikro, biosafety cabinet level-2 (Nuaire, USA), incubator CO2 (Binder, Germany),

Mikroskop terbalik (Nikon, Japan), flask T25 (Corning, USA), perangkat

hemositometer (Improved Neurbauner), 96 wadah piring pengkultur jaringan

(Corning USA), 12 wadah kultur jaringan (Corning, USA), pipet aid, pipet

volumetrik, botol media.

31

3.3 Prosedur Percobaan

3.3.1 Tahapan Penelitian

Non polar

(n-heksana)

Semi polar

(Etil Asetat)

Partisi cair-cair

Ekstraksi

(Metanol)

Uji sitoksisitas

(MTT assay)

Polar

(Air)

Uji Fitokimia

Alkaloid

Flavonoid

Terpenoid

Steroid

Saponin

Tanin

Madu

Sampel Terbaik

berdasarkan MTT Assay

32

3.3.2. Uji Fitokimia (Modifikasi Sukandar et al., 2015)

1. Uji alkaloid

Sampel sebanyak 10 mL dimasukan kedalam tabung reaksi dan

ditambahkan 10 mL kloroform dan 10 tetes amonia. Fraksi kloroform diambil

lalu ditambahkan 10 mL HCl 2% kedalam tabung reaksi lalu di vortex. Pereaksi

wagner sebanyak 5 tetes ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Jika terbentuk

endapan cokelat menandakan positif alkaloid.

2. Uji Flavonoid

Sampel sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan air sebanyak 1 mL. Ditambahkan 0,5 g sebuk Mg kedalam tabung

rekasi dan 10 tetes HCl pekat lalu diamati perubahan yang terjadi. Positif

flavonoid jika terbentuk busa bening orange.

3. Uji triterpenoid dan steroid

Sampel sebanyak 2 mL dimasukkan kedalam tabung reaksi dan

ditambahkan 1 mL air. Reagen Liberman-Burchard ditambahkan sebanyak 10

mL ke dalam tabung reaksi. Positif triterpenoid jika terbentuk cincin kecokelatan,

merah atau violet dan positif steroid jika berwarna hijau.

4. Uji tanin/polifenol


ditambahkan 1 mL air. FeCl3 1 % sebanyak 5 tetes ditambahkan ke dalam tabung

reaksi dan dikocok. Positif tanin jika larutan berubah warna menjadi hitam dan

positif polifenol jika berubah warna menjadi kebiruan.

33

5. Uji saponin


ditambahkan 5 mL air. Sampel selanjutnya dipanaskan di dalam penangas air

selama 5 menit lalu didiamkan hingga dingin, kemudian dikocok sampai timbul

busa. Positif saponin jika terbentuk busa stabil selama ± 10 menit.

3.3.3. Ekstraksi Madu (Dananjaya et al., 2013)

Sampel madu sebanyak 100 gram ditambahkan dengan 300 mL metanol

dan diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer selama 30 menit. Sampel

selanjutnya didiamkan didalam lemari asap (fume hood) selama 24 jam. Ekstrak

madu selanjutnya dipisahkan bagian residu yang mengendap dengan filtrat

menggunakan kertas saring. Filtrat ekstrak metanol madu lalu dipekatkan dengan

menggunakan rotary evaporator pada suhu 64oC sehingga diperoleh ekstrak pekat

metanol madu.

3.3.4. Partisi Cair-Cair (Modifikasi Dananjaya et al., 2013)

Ekstrak pekat metanol madu dipisahkan dengan metode partisi cair-cair

berurut-turut menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Ekstrak pekat

metanol madu dilarutkan dengan air-metanol (3:7) sebanyak 200 mL kemudian

dimasukan kedalam corong pisah dan ditambahkan dengan pelarut n-heksana 100

mL. Campuran kemudian dikocok selama 5 menit dan didiamkan hingga terpisah

sempurna menjadi 2 bagian. Fraksi n-heksana yang berada diatas dipisahkan

sedangkan fraksi air-metanol yang berada dibawah dipartisi kembali dengan

penambahan n-heksana hingga fraksi n-heksana berwarna bening dan diperoleh

fraksi n-heksana madu. Selanjutnya fraksi air-metanol madu ditambahkan dengan

34

pelarut etil asetat sebanyak 100 mL dan dipartisi dengan metode yang sama

dengan pelarut n-heksana hingga diperoleh fraksi etil asetat berwarna bening.

Fraksi air-metanol, n-heksana, dan etil asetat madu ditambahkan dengan 5 gram

Na2SO4 anhidrat untuk menghilangkan kadar air yang tersisa. Kemudian disaring

menggunakan corong Buchner untuk memisahkan Na2SO4. Semua fraksi madu

dipekatkan menggunakan rotary evaporator, fraksi n-heksana pada suhu 48oC,

fraksi etil asetat pada suhu 54oC, dan fraksi air-metanol pada suhu 64oC.

3.3.5. Uji Sitotoksisitas (PSSP, 2017)

1. Preparasi Ekstrak Madu

1 mg fraksi masing-masing madu ditimbang, kemudian dilarutkan dengan

1000 μl DMSO 99,5% lalu disentrifugasi hingga homogen. Larutan ini dijadikan

larutan standar fraksi madu dengan konsentrasi 1000 ppm. Larutan induk

diencerkan untuk dibuat seri larutan uji dengan konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 200

ppm, 400 ppm, dan 800 ppm.

2. Preparasi Sel Monolayer A549

Sel A549 merupakan sel kanker paru-paru manusia (human lung cancer

cell). Sel A549 dikulturkan dalam medium Dulbecco’s Modified Eagle Medium

(MDEM). MDEM mengandung 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Sel A549

kemudian didistribusikan ke 96-well microplate (4000 sel/200 mL/sumur). Sel

A549 selanjutnya diinkubasi di dalam inkubator CO2 dengan konsentrasi 5% dan

suhu sebesar 37oC selama 14 jam.

35

Perhitungan Sel

Sebanyak 50µl larutan sel ditambahkan 50µl trypan blue dialirkan ke dalam

haemocytometer, kemudian diamati dan dihitung sel yang hidup (tidak menyerap

warna) dari 2 kotak besar. Hasil yang diperoleh dihitung menggunakan rumus:

𝑆𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝑙 = 𝑟𝑎𝑡𝑎𝑎𝑛 𝑠𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 104

3. MTT Assay (Riss et al., 2013)

Sel kanker yang telah ditumbuhkan pada flask T25 disubkultur, kemudian

sel ditumbuhkan pada 96 wells tissue culture plate dengan jumlah 5000 sel/well dan

diinkubasi selama 24 jam dalam media pertumbuhan pada suhu 37oC dan CO2 5%.

Fraksi n-heksana, etil asetat, dan air madu masing-masing konsentrasi ditambahkan

sebanyak 100µL/well, sel tanpa perlakuan disertakan sebagai kontrol sel

selanjutnya diinkubasi kembali selama 48 jam. Senyawa 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-

yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ditambahkan dan diinkubasi selama 4

jam pada suhu 37oC dan CO2 5%. Supernatan sel dibuang, kristal formazan yang

terbentuk dilarutkan dengan etanol 70%. Pembacaan absorbansi dilakukan

menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 565 nm.

Perhitungan % viabilitas :

% viabilitas = (1 – (penghambatan kontrol – penghambatan perlakuan)) x 100%

OD kontrol sel

Perhitungan % penghambatan :

% Penghambatan = penghambatan kontrol - penghambatan perlakuan sel x100%

OD kontrol sel

36

3.4 Analisis Data

Data hubungan antara konsentrasi sediaan uji dan absorban

dianalisis secara statistik menggunakan analisa varian (ANOVA) satu arah

yang dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan (Duncan’s Multiple

Range Test).

37

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Ekstraksi Madu

Penentuan sampel madu dilakukan dengan mengambil 4 madu lokal

Indonesia. Sampel diekstraksi dengan tujuan untuk memisahkan kandungan

senyawa dari sampelnya dengan menggunakan pelarut. Ekstrak madu diekstrak

dengan metode maserasi menggunakan metanol 100 mL dari 100 mL sampel madu.

Maserasi digunakan karena mampu mengekstrak komponen dengan sifat

yang mudah menguap dan tidak tahan panas serta ekonomis. Proses maserasi

dimulai ketika melarutnya bahan kandungan simplisia dari sel yang rusak pada saat

ekstraksi (difusi) bahan kandungan sel yang masih utuh. Maserasi selesai ketika

keseimbangan antara bahan yang di ekstraksi pada bagian dalam sel telah tercapai.

4.2. Ekstraksi cair-cair

Ekstraksi cair-cair bertujuan untuk memisahkan senyawa berdasarkan

kepolarannya. Sampel madu di ekstraksi dengan menggunakan air (polar), etil

asetat (semi polar) dan n-heksana (non polar). Tabel 2 menunjukkan semua ekstrak

sampel madu yang dipisahkan berdasarkan kepolarannya.

38

Tabel 2. Tabel ekstraksi cair-cair

No. Madu Fraksi Warna Berat (gram)

1 Trigona

(Atr)

n-heksana Bening 0

Etil Asetat Kuning bening 23,98

Air Kuning keruh 69,23

2 Kaliandra

(Bkld)

n-heksana Bening 0



3 Rambutan

(Crb)

n-heksana Bening 0



4 Kelengkeng

(Dklx)

n-heksana Bening 0



*Bobot awal setiap sampel adalah 100gr

Ekstraksi cair-cair yang telah dilakukan terhadap setiap sampel madu pada

akhirnya menghasilkan 3 fasa. Fasa ini terbentuk akibat dari perbedaan bobot jenis

dari masing-masing pelarut, sehingga setiap pelarut memisahkan diri berdasarkan

bobot jenisnya masing-masing. Bobot jenis adalah rasio massa suatu benda

terhadap volume yang ditempatinya. Bobot jenis pelarut yang lebih rendah akan

melayang diatas pelarut yang bobot jenisnya lebih tinggi (Robinson, 2011).

39

Gambar 10. Ekstraksi cair-cair dengan corong pisah

Bobot jenis air, etil asetat dan n-heksana berturut-turut adalah 1 gr/cm3, 0,902

gr/cm3 dan 0,655 gr/cm3 sehingga urutan pelarut dalam corong pisah berurutan dari

yang paling berat dibawah dan paling ringan diatas yakni air, etil asetat dan n-

heksana (Gambar 10).

Ekstraksi memisahkan senyawa sampel sesuai fraksi kepolarannya masing-

masing. Hasil pada Tabel 2 menunjukkan bahwa Atr menghasilkan fraksi air

terbesar dengan jumlah 69,23 gram yang berarti sampel Atr memiliki kandungan

senyawa polar paling banyak diantara sampel lainnya diikuti dengan Bkld, Crb dan

Dklx. Fraksi etil asetat sebagai fraksi semi polar menunjukkan hasil terbesar pada

sampel Dklx dengan jumlah 28,34 gram dan diikuti dengan Crb, Bkld, Atr. Semua

ekstrak sampel tidak memiliki senyawa nonpolar sehingga hasil dari ekstraksi pada

fraksi n-heksana menunjukkan angka 0. Fraksi air mendominasi hasil ekstraksi

yaitu sebesar 60-70% yang diduga didominasi oleh karbohidrat pada madu.

Tingginya rendemen pada fraksi air menunjukkan kadar senyawa polar seperti

karbohidrat memiliki komposisi tertinggi didalam sampel sehingga menguatkan

40

pernyataan Hamdan (2010) yang menyatakan bahwa madu mengandung gula

sekitar 20-60% dan memiliki fraksi air sekitar 40-80%.

Fraksi etil asetat pada ekstraksi cair-cair menunjukkan angka 20-30%. Hal ini

diduga disebabkan oleh ekstraksi sampel yang menggunakan metanol sehingga

tidak menarik senyawa nonpolar pada sampel.

4.3 Uji Fitokimia

Uji fitokimia dilakukan guna menentukan golongan senyawa aktif dari

ekstrak tumbuhan secara kualitatif. Uji yang dilakukan terhadap sampel madu

menunjukkan hasil seperti pada tabel dibawah ini:

Tabel 3. Tabel uji fitokimia madu

Madu

Uji

Saponin

Uji

Tanin

Uji

Flavonoid

Uji

Steroid

Uji

Alkaloid

Atr (Trigona) + + + + +

Bkld (Kaliandra) + + + + +

Crb (Rambutan) + - + + -

Dklx (Klengkeng) + - + + -

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa sampel Atr dan Bkld bereaksi positif

terhadap seluruh aspek uji fitokimia sedangkan Crb dan Dklx keduanya

menunjukkan positif pada saponin, flavonoid dan steroid namun negatif terhadap

uji tannin dan alkaloid. Sampel Crb dan Dklx tidak mengandung tanin, kandungan

tanin berada pada bagian lain rambutan seperti biji dan kulitnya (Yuslianti, 2015)

sedangkan pada kandungan alkaloid berada pada biji rambutan (Soeng et al., 2015),

41

kulit buah kelengkeng (Fadhli dan Riau, 2017) dan daun kelengkeng (Apriyanto,

2014). Seluruh sampel positif mengandung saponin, flavonoid dan steroid, hal ini

sejalan dengan pernyataan bahwa madu mengandung flavonoid dan asam fenolat

serta steroid (Alvarez et al., 2014 ; Oelschlaegel et al., 2012). Flavonoid merupakan

produk bahan alam yang penting dan banyak terdapat pada buah-buahan, sayuran

serta minuman. Flavonoid juga memiliki aktivitas biokimia dan antioksidan yang

berfungsi dalam menangani berbagai penyakit seperti kanker, Alzheimer dan lain

sebagainya (Panche et al., 2016). Madu rambutan mengandung flavonoid yang

merupakan antioksidan alami, menunjukkan efek biologis seperti anti inflamasi,

antibakteri dan perlebaran pembuluh darah (vasodilator) (Yuslianti et al., 2015).

Flavonoid yang ditemukan pada madu merupakan actor utama dari aktivitas

proteksi terhadap beberapa pathogen. Flavonoid juga mampu berperan sebagai

antioksidan dan agen apoptosis (Salih et al., 2009). Hasil ini sesuai dengan hasil

uji fitokimia madu apiary oleh Nwanko (2013) yang menunjukkan hasil positif pada

alkaloid, saponin dan flavonoid.

4.4 MTT assay

Uji aktivitas antikanker diukur dengan menggunakan metode MTT (3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) assay karena aman, efektif dan

kuantitatif (Assays, 2007)(Riss et al., 2013). Metode MTT assay juga banyak

digunakan untuk menentukan viabilitas sel dari komponen sampel terlarut

walaupun penandanya lebih mengarah kepada metabolisme sel daripada proliferasi

sel (Riss et al., 2013).

42

Gambar 11. Proses MTT Assay (Riss et al., 2013)

Gambar 12. Reaksi pada MTT assay (Riss et al., 2013).

Metabolisme sel dapat ditunjukkan dengan ditandai oleh perubahan warna kuning

larutan MTT menjadi warna kuning larutan formazan. Perubahan warna kuning

tetrazolium menjadi ungu formazan ini menunjukkan bahwa sel A549 mengalami

proliferasi akibatnya banyak formazan yang terbentuk setelah menggunakan

tetrazolium untuk metabolisme. Perubahan ini juga disertai dengan peningkatan

tingkat absorbansi pada panjang gelombang 570 nm (Riss et al., 2013).

43

Gambar 12. menunjukkan MTT assay yang dilakukan terhadap sel A549

yang telah dikultur dengan penambahan sampel madu dengan konsentrasi berbeda

(50,100,200,400,800 ppm), mengakibatkan populasi sel A549 lebih sedikit bila

dibandingkan dengan kontrol.

Gambar 13. Penghambatan ekstrak madu fraksi air

Hasil analisis menunjukkan bahwa pada fraksi air madu berfluktuasi pada

berbagai konsentrasi. Bahkan penghambatan paling tinggi terdapat pada

konsentrasi paling rendah yaitu pada 50 ppm untuk madu kaliantra (Bkld). Hal ini

menunjukkan bahwa terdapat sejumlah senyawa aktif madu kaliandra yang larut

dalam air. Hal ini sejalan dengan penelitian (Saeed et al., 2010) yang menyatakan

bahwa perlakuan sel kanker dengan madu menghasilkan penghambatan yang

signifikan dari proliferasi sel bila dibandingkan dengan sel kontrol.

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

50 100 200 400 800% P

engh

amb

atan

Konsentrasi (ppm)

Atr

Bkld

Crb

Dklx

44

Gambar 14. Penghambatan ekstrak madu fraksi etil asetat

Gambar 14 menunjukkan hasil analisis menunjukkan bahwa pada fraksi etil

asetat madu berfluktuasi pada berbagai konsentrasi. Data penghambatan

menunjukkan bahwa setiap madu pada berbagai konsentrasi memiliki kemampuan

menghambat sel A549 yang berbeda-beda. Artinya setiap madu memiliki

perbedaan senyawa bioaktif karena berasal dari nektar yang berbeda. Hasil ini

mendukung pernyataan Spilioti et al., yang menyatakan bahwa penelitian

menggunakan HPLC chromatogram pada fraksi etil asetat madu menunjukkan

madu Yunani kaya akan asam fenolat. Asam fenolat yang dikonfirmasi terdapat

pada ekstrak yaitu protocatechiuc, p-hidroksibenzoat, vanilic, kafein dan asam

koumarik sementara galat, ferulat, sinapic, siringic, trans-sinamat dan asam

klorogenat tidak terdeteksi.

-40

-20

0

20

40

60

80

50 100 200 400 800

% P

engh

amb

atan

Konsentrasi (ppm)

Atr

Bkld

Crb

Dklx

45

Gambar 15. Penghambatan terbaik setiap sampel

Hasil analisis menunjukkan bahwa semua sampel madu yang diberikan

memberikan aktivitas penghambatan. Aktivitas penghambatan ini berbeda-beda

berdasarkan pelarut yang diberikan berkisar antara 26,49% sampai 78,25%

(Lampiran 10 dan Gambar 15).

Sampel Trigona fraksi air tidak menunjukkan aktivitas antikanker, sel A549

diduga melakukan proliferasi menggunakan gula dalam madu trigona dan

memberikan nutrisi pada sel A549 sehingga memicu pertumbuhan sel sebesar 10%.

Hal ini sudah dikemukakan juga yakni glukosa pada madu dapat memberikan

nutrisi pada sel kanker payudara sehingga dapat memicu pertumbuhan sel kanker

lebih cepat (Porcza et al., 2016).

Sampel madu Bkld dalam fraksi air menunjukkan hasil dengan penghambatan

terbaik yaitu sebesar 78,25%. Madu rambutan dan kelengkeng memiliki aktivitas

-20

0

20

40

60

80

100

Air EA

% P

engh

amb

atan

Fraksi

Atr

Bkld

Crb

Dklx

46

antikanker yang signifikan meskipun tidak menunjukkan aktivitas sebaik madu

kaliandra dengan penghambatan terbaik masing-masing sebesar 60,34% dan

65,33%. Perbedaan besaran %penghambatan ini diduga diakibatkan oleh tingginya

aktivitas dari flavonoid dan asam fenolat dibandingkan dengan karbohidrat pada

madu madu sehingga mampu menghambat proliferasi sel A549. Flavonoid dapat

diesktraksi berdasarkan kepolarannya. Flavonoid yang memiliki sifat kurang polar

seperti isoflavon, flavavon, metil flavon dan flavonol dapat diekstraksi dengan

menggunakan pelarut semi polar seperti etil asetat. Flavonoid lain yang bersifat

lebih polar dapat diekstraksi pada pelarut polar seperti alkohol dan air (Khoddami

et al., 2013).

Madu trigona fraksi etil asetat pada Gambar 15 menunjukkan penghambatan

terhadap sel kanker dengan nilai penghambatan sebesar 52,00% pada madu trigona.

Nilai ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat dalam madu trigona memiliki

aktivitas antikanker yang cukup baik dan senyawa antikankernya dominan berada

pada fraksi etil asetat. Madu kaliandra fraksi etil asetat yang juga ditampilkan pada

lampiran 3 menampilkan hasil yang cukup baik dengan nilai penghambatan sebesar

34,91%. Hasil yang sama juga ditunjukkan oleh fraksi etil asetat dari Crb dan Dklx

dengan penghambatan masing-masing sebesar 70,81% dan 26,49%. Madu

rambutan fraksi etil asetat diduga kuat mengandung flavonoid yang lebih besar

dibandingkan sampel madu kaliandra, trigona dan kelengkeng. Hal ini ditunjukkan

dari nilai penghambatan terhadap sel A549 yang paling besar dan merupakan fraksi

etil asetat. Hasil ini sejalan dengan hasil penelitian pada madu rambutan yang

menyatakan bahwa madu rambutan mengandung flavonoid yang mampu

47

menangkap radikal bebas untuk memabntu regenerasi sel. Hasil ini

mengindikasikan pengurangan tingkat radikal bebas pada proses pemulihan luka

jaringan terutama pada tahap infalmasi dan remodeling. Antioksidan dapat bereaksi

dengan (1) membersihkan senyawa atau mengurangi konsentrasi oksigen yang

bersifat reaktif, (2) membersihkan ion logam katalis, (3) Membersihkan radikal

bebas yang bertindak sebagai inisiator seperti hidroksil, peroksil dan aloksil, (4)

Pemutusan reaksi berantai yang diinisiasi oleh radikan bebas, (5) Mengurangi

rekasi dan pembersihan wadah oksigen (Yuslianti et al., 2015).

Hasil analisis MTT assay menunjukkan bahwa adanya perbedaan aktivitas

antikanker antara madu multi flora (Atr) dan madu monoflora (Blkd, Crb dan Dklx)

dilihat dari aktivitas antikankernya terhadap penghambatan sel A549. Hal ini

berlaku juga untuk fraksi etil asetat dengan nilai %penghambatan yang relatif lebih

baik dibandingkan fraksi air. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa aktif

penghambat sel A549 didominasi pada fraksi semi polar.

Keseluruhan hasil MTT assay, diperoleh nilai penghambatan terbaik

ditunjukan oleh sampel Bkld fraksi air dengan nilai penghambatan terbesar sebesar

78,25% terhadap sel A549. Seluruh hasil pengamatan, fraksi etil asetat

menunjukkan hasil yang lebih baik dibanding fraksi air. Hasil ini sejalan dengan

pernyataan Kassim (2010) dan Spilioti (2014) bahwa fraksi etil asetat memiliki

aktivitas biologis yang lebih baik dibanding ekstrak lainnya dan kemampuan

antikanker fraksi etil asetat menunjukkan hasil lebih baik akibat dari kandungan

senyawa fenolik dalam madu.

48

Madu memiliki kemampuan dalam menghambat proses pertumbuhan sel

kanker dengan cara menghambat proliferasi sel. Ketika sel kanker telah terhambat

oleh madu, sel kanker kemudian akan mengalami apoptosis dan menyebabkan

berubahnya siklus sel hingga menyebabkan depolarisasi membran mitokondria

pada sel kanker paru-paru (Aliyu et al., 2013).

Madu dan D-glukosa menunjukkan efek negatif diferensial yang signifikan

secara statistic (p<0.05) pada sel line A549 dibandingkan dengan kontrol yang tidak

terpapar. Temuan ini menunjukkan peran yang potensial madu dan D-glukosa

sebagai metabolit biotherapeutik yang diminati untuk pengelolaan kanker secara

selektif.

Penelitian Hsu et al., (2004) bahwa Acacetin (suatu flavonoid) menghambat

proliferasi sel A549, menginduksi apoptosis dan menghambat perkembangan siklus

sel pada fase G1. Ini juga memperbaiki ekspresi ligan p53 dan Fas. Dalam studi

lain, juga telah terbukti dapat menghambat proliferasi sel HepG2 dan

memprovokasi apoptosis dengan meningkatkan ligan p53 dan Fas seperti pada

kasus sel A549 (Hsu et al., 2004).

Gambar 16. Skema presentasi aktivitas antikanker madu (Ahmed dan Othman,

2013)

49

Analisis siklus sel A549 yang diobati dengan 5 dan 10μM acacetin

menunjukkan peningkatan fase G1 dari 34,7% menjadi 42,6% dan 61,2%.

Demikian pula uji fragmentasi DNA menunjukkan bahwa jumlah sel yang

mengalami apoptosis meningkat dari sekitar 3,2 kali lipat menjadi 8,1 kali lipat pada

5 dan 10μM acacetin, masing-masing setelah 48 jam (Khalil et al.,2010) . Penelitian

lain juga telah menyimpulkan bahwa perlakuan dengan 62,6-2,000 µg/mL madu

menghasilkan efek penghambatan moderat dan terbukti menjadi agen pembunuh

diferensial pada sel kanker paru-paru (A549).

Telah dilaporkan pula bahwa kuersetin konsentrasi rendah mem-promoted

proliferasi sel A549, sedangkan pada konsentrasi tinggi, terjadi penghambatan dan

kelangsungan hidup larva (Robaszkiewicz et al., 2007). Selanjutnya kuersetin

antiproliferatif berpengaruh terhadap glioma dan sel kanker payudara (Braganhol

et al., 2006; Choi et al., 2008; Indap et al., 2006).

50

4.5 Mekanisme Apoptosis

Gambar 17. Proses penghambatan A549 oleh madu (Ahmed dan Othman, 2013)

Proses apoptosis berlangsung melalui 3 tahapan, yaitu tahap induksi, tahap

eksekusi dan tahap degradasi (Gambar 17). Tahap induksi, madu menstimulasi

produksi protein caspase 9 yang memberikan sinyal proapoptosis kepada sel.

Tahap eksekusi yaitu dengan mematikan sel melalui pusat regulasi sel yang berada

di mitokondria, pada tahap eksekusi terbentuk caspase 3 sebagai protein yang

mengaktifkan proses apoptosis. Caspase 3 memicu terjadinya apoptosis dengan

cara membelah protein dalam sitoplasma dan nukleus. Caspase terdapat pada setiap

sel sebagai prekursor nonaktif yang mana di aktivasi oleh pembelahan dari caspase

lainnya. Tahap degradasi menyebabkan kromatin dan inti sel semakin mengeras

sehingga sel mengecil dan DNA sel terpecah serta membuat membrane sel

51

mengeluarkan banyak tonjolan. Sementara itu pada sitoplasma, enzim pembelahan

sel yang disebut caspase aktif hingga sel akhirnya memecah diri (Ahmed dan

Othman, 2013). Madu meningkatkan aktivitas caspase 3, p53 dan penyebaran poly

(ADP-ribose) polymerase (PARP) pada sel kanker. Efektivitas dari apoptosis oleh

madu dipengaruhi oleh tingkat kandungan fenoliknya (Erejuwa, 2014).

Saponin yang terkandung dalam madu dapat menghambat pertumbuhan sel

A549 dengan cara menghambat cell cycle arrest melalui induksi terhadap ekspresi

p53 dan peningkatan p21 dan melakukan downregulation terhadap CDK2 pada

siklus cyclin D1. Pada sebuah sel, p21 dan p53 adalah protein yang terkandung

dalam sel yang memiliki tugas sebagai penanda keadaan sebuah sel, jika sel

mengalami masalah kerusakan maka p21 akan meningkat dan merangsang jumlah

p53 yang akan mengakibatkan sel masuk ke dalam cell cycle arrest. Dalam tahap

ini sel akan mencoba memperbaiki keadaannya dengan melakukan regulasi

terhadap p19ARF sehingga produksi mdm2 meningkat. Fungsi dari mdm2 adalah

menahan jumlah p53 yang ada didalam sel agar proses apoptosis terhambat dan

melanjutan siklus cyclin D1. Sementara itu saponin menghambat CDK2 sehingga

proliferasi sel terhambat sementara tingkat p53 semakin tinggi. Akibatnya sel akan

menjadi tidak stabil dan memaksa mitokondria melakukan upregulation terhadap

caspase-9. Pembelahan caspase-9 akan mengaktifkan pertumbuhan caspace-3

didalam sel sehingga sel akan melakukan apoptosis (Xu et al., 2016).

Kandungan steroid pada madu mampu menghambat pertumbuhan sel kanker .

Steroid pada madu dengan cara melakukan downregulation pada ekspresi CDK2

sehingga mengakibat sel mengalami S phase cell arrest pada sel C6 glioma (Zheng

52

et al., 2013). Pada sel kanker payudara steroid melakukan menghambat

pembentukan protein anti-apoptosis seperti Bcl-2, cIAP-1 dan Mcl-1 (Kim et al.,

2014). Sehingga steroid akan mengakibatkan potensial membran mitokondria

berkurang (Wang et al., 2012). Selain itu steroid juga meningkatkan ekspresi dari

Bax dan Bak (Hu et al., 2013). Steroid mengaktivasi caspace-9, caspace-7 dan

caspace-3 dengan melepaskan sitokrom-c kedalam sitosol (Wang et al., 2014).

53

BAB V

PENUTUP

5.1. Simpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan terhadap ekstrak madu

lokal, maka dapat disimpulkan bahwa:

1. Ekstrak madu monoflora lokal Kaliandra fraksi air memiliki aktivitas

antikanker yang lebih baik dengan nilai 78,25 % dibandingkan madu

multiflora lokal Trigona -10,05 % melalui penghambatan sel A549 secara

in vitro.

2. Ekstrak madu monoflora lokal Rambutan fraksi etil asetat memiliki

aktivitas antikanker yang lebih baik dengan nilai 70,80 % dibandingkan

madu multiflora Trigona lokal 52,00 % melalui penghambatan sel A549

secara in vitro.

3. Sumber nektar madu mempengaruhi aktivitas sel A549 pada sampel

madu monoflora lokal ekstrak madu Kaliandra fraksi air dengan nilai

%penghambatan sebesar 78,25 % pada konsentrasi 50 ppm dibanding

sampel monoflora Rambutan dan Kelengkeng serta sampel multiflora

Trigona.

5.2. Saran

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan terhadap ekstrak madu lokal,

maka perlu dilakukan fraksinasi dan purifikasi senyawa aktif dari ekstrak madu

54

Rambutan fraksi etil asetat dan identifikasi senyawa aktif dengan LC-MS dan

NMR guna memastikan kandungan senyawa aktif yang memiliki aktivitas

antikanker terhadap penghambatan sel A549.

55

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, S., dan Othman, N. H. (2013). Honey as a potential natural anticancer

agent: A review of its mechanisms. Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicine, (c). https://doi.org/10.1155/2013/829070

Alen, Y, Agresa, F. L., dan Yuliandra, Y. (2017). Analisis Kromatografi Lapis Tipis

( KLT ) dan Aktivitas Antihiperurisemia Ekstrak Rebung Schizostachyum

brachycladum Kurz ( Kurz ) pada Mencit Putih Jantan. Jurnal Sains Farmasi

dan Klinis, 3(May), 146–152.

Aliyu, M., Odunola, O. A., Farooq, A. D., Rasheed, H., Mesaik, A. M., Choudhary,

M. I., Erukainure, O. . (2013). Molecular mechanism of antiproliferation

potential of Acacia honey on NCI-H460 cell line. Nutrition Cancer, 65, 296–

304.

Alrawaiq, NS, dan Abdullah, A. (2014). A review of flavonoid quercetin:

Metabolism, Bioactivity and antioxidant properties. International Journal of

PharmTech Research, 6(3), 933–941.

https://doi.org/10.3109/13880200490893492

Alvarez, S, Gasparrini, M., Forbes-Hernández, T., Mazzoni, L., dan Giampieri, F.

(2014). The Composition and Biological Activity of Honey: A Focus on

Manuka Honey. Foods, 3(3), 420–432. https://doi.org/10.3390/foods3030420

Alvarez, S., Giampiere, F., dan Battino, M. (2013). Honey as a source of dietary

antioxidants: Structures, bioavailability and evidence of protective effects

against human chronic diseases. Current Medicinal Chemistry, 20, 621–638.

Alvarez, S., Tulipani, S., Romandini, S., Bertoli, E., dan Battino, M. (2010).

Contribution of honey in nutrition and human health. Journal of Nutrition and

Metabolism, 3, 15–23.

Apriyanto, D. R. (2014). Efek dan mekanisme antiviral ekstrak metanol daun

Dimocarpus longan Lour . terhadap virus hepatitis C. [TESIS]

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. (2013). Riset Kesehatan Dasar

(RISKESDAS) 2013. Laporan Nasional 2013, 1–384. https://doi.org/1

Desember 2013

Beckerman, R., dan Prives, C. (2010). Transcriptional Regulation by P53. Cold

Spring Harbor Perspective in Biology, 2, 8.

Bogdanov, S., Jurendic, T., Sieber, R., dan Gallmann, P. (2008). Honey for nutrition

and health : A review. American Journal College Nutrition, 27, 677–689.

Braganhol, E., L. Zamin, D., dan Canedo. (2006). Antiproliferative effect of

quercetin in the human U138MG glioma cell line. Anti-Cancer Drugs, 17(6),

663–671.

56

Cancer Counsil Australia. (2016). Understanding Lung Cancer. (J. Mothoneos,

Ed.) (November 2). Sydney: National Publication Working Group Initiative.

Choi, E. ., Bae, S. M., dan Ahn, W. S. (2008). Antiproliferative effects of quercetin

through cell cycle arrest and apoptosis in human breast cancer MDA-MB-453

cells. Archives of Pharmacal Research, 31(10), 1281–1285.

Cramp, D. (2008). A Practical Manual of Beekeeping: How to keep bees and

develop your full potential as an apiarist. Spring, 304.

Dananjaya, A., Winarsih, S., dan Prijadi, B. (2013). Pengaruh Ekstrak Metanol

Fraksi Etil Asetat Madu Terhadap Pertumbuhan Escherichia coli Secara In

Vitro [skripsi]. Malang (ID): Universitas Brawijaya

Erejuwa, O. O., Sulaiman, S. A., dan Ab Wahab, M. S. (2014). Effects of honey

and its mechanisms of action on the development and progression of cancer.

Molecules, 19(2), 2497–2522. https://doi.org/10.3390/molecules19022497

Fadhli, H., dan Riau, U. (2017). ANTIBACTERIAL, ANTIFUNGAL AND

ANTIDIABETIC ACTIVITIES OF Dimocarpus longan FRUIT SKIN

EXTRACT, (May 2016).

Ferreira, I., Aires, E., Barreira, J., dan Estevinho, L. (2009). Antioxidant Activity

of Potuguese Honey Samples: Different Contributions of the Entire Honey and

Phenolic Extract. Food Chemistry, 114(4), 1438–1443.

Hamdan, K. (2010). How Do Bees Make Honey. The Netherlands.

Hsu, Y., Kuo, P., dan Lin, C. (2004). Acacetin inhibits the proliferation of Hep G2

by blocking cell cycle progression and inducing apoptosis. Biochem

Pharmacol, 67(5), 823–829.

Hsu, Y., Kuo, P., Liu, C., dan Lin, C. (2004). Acacetin induced cell cycle arrest and

apoptosis in human non-small cell lung cancer A549 cells. Cancer Lett.,

212(1), 53–60.

Hu, M., Xu, L., Yin, L., Qi, Y., Li, H., Xu, Y., dan Wan, X. (2013). Cytotoxicity of

dioscin in human gastric carcinoma cells through death receptor and

mitochondrial pathways. Journal of Applied Toxicol, 33, 712–722.

Indap, M. A., S. Radhika, L., Motiwale, dan K.V.K., Rao. (2006). Quercetin:

antitumor activity and pharmacological manipulations for increased

therapeutic gains. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 68(4), 465–469.

Jaganathan, S., dan Mandal, M. (2009). Antiproliferative effects of honey and of its

polyphenols. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2009, 1–13.

Jim, C. (2012). Cell line profile A549. European Collection of Authenticated Cell

Cultures Catalogue, 549(86012804), 1–2.

57

Kassim, M., Achoui, M., Mustafa, M., dan Yusuf, K. (2010). Ellagic acid, phenolic

acids, and flavonoids in Malaysian honey extracts demonstrate in vitro

phenolic acids, and flavonoids in Malaysian honey extracts demonstrate in

vitro anti-inflammatory activity. Nutrition Research, 30, 650–659.

Kementrian Kesehatan RI. (2015). Stop Kanker. Pusat Data Dan Informasi

Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.

Khoddami, A., Wilkes, M. A., dan Roberts, T. H. (2013). Techniques for analysis

of plant phenolic compounds. Molecules, 18(2), 2328–2375.

https://doi.org/10.3390/molecules18022328

Kim, E., Jang, J., Lee, Y., Sung, E., Song, I., Kim, J., dan Lee, T. (2014). Dioscin

induces caspase-independent apoptosis through activation of apoptosis-

inducing factor in breast cancer cells. Apoptosis, 19, 1165–1175.

Kim, S. C., Magesh, V., Jeong, S. J., Ahn, K. S., Lee, H. J., Lee, E. O., dan Kim, J.

H. (2010). Ethanol Extract of Ocimum Sanctum Exerts Anti-metastatic

Activity Through. Food Chem Toxicol, 48(6), 1478–1482.

Kumar, R., Reybroeck, W., Van Veen, J. W., dan Gupta, A. (2014). Beekeeping for

poverty alleviation and livelihood security. Technological Aspects of

Beekeeping (1st ed.) [Buku]. Dordrecht: Springer Netherlands.

https://doi.org/10.1007/978-94-017-9199-1

Lakshmanan. (2013). A549 Transfection Reagent From Altogen Biosystems.

diunduh March 8 2018, from https://altogen.com/product/a549-transfection-

reagent-lung-carcinoma-ccl-185/

Lapenna, S., dan Giordano, A. (2009). Cell Cycle Kinases as Therapeutic Targets

for Cancer. Nature Review Drug Discovery, 8, 547–566.

Lurlina, M. ., Saiz, A., Fritz, R., dan Manrique, G. . (2009). Major flavonoids of

Argentinean honeys. Optimisation of the etraction method and analysis of their

content in relationship to the geographical source of honeys. Trends in

Analytical Chemistry, 28(7), 893–902.

Magesh, V., Lee, J., Ahn, K. S., Lee, H. J., Lee, E. O., Shim, B. S., dan Kim, S. H.

(2009). Ocimum sanctum Induces Apoptosis in A549 Lung Cancer Cells and

Suppresses the In Vivo Growth of Lewis Lung Carcinoma Cells. Phytother

Res., 23(10), 1385–1391.

Momna, H. (2010). Introduction to Cancer Biology (2nd ed.) [Buku]. Denmark:

Ventus Publishing.

Muslim, T. (2014). Potensi Madu Hutan sebagai Obat dan Pengelolaannya di

Indonesia. In Tumbuhan Obat dari Hutan: Konservasi, Budidaya, dan

Pemanfaatan (pp. 67–82). Balikpapan: Balai Penelitian Teknologi Konservasi

Sumber Daya Alam.

58

Nayeem, N., SMB, A., Salem, H., dan AHEI, S. (2016). Gallic Acid: A Promising

Lead Molecule for Drug Development. Journal of Applied Pharmacy, 08(02),

8–11. https://doi.org/10.4172/1920-4159.1000213

Novandra, A., dan Widnyana, I. M. (2013). Peluang Pasar Produk Perlebahan

Indonesia. Balai Penelitian Teknologi Hasil Hutan Bukan Kayu, 13.

Oelschlaegel, S., Gruner, M., Wang, P., Boettcher, A., Koelling-Speer, I., dan

Speer, K. (2012). Classification and characterization of Manuka Honey based

on Phenolyc Compound and Methylgloxal. Journal Agrecultural Food

Chemistry, 60(14), 7669–7237.

Othman, N. (2012). Honey and Cancer: Sustainable Inverse Relationship

Particularly for Developing Nations-A Review Hindawi Publishing

Corporation. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.

Panche, A. N., Diwan, A. D., dan Chandra, S. R. (2016). Flavonoids: An overview.

Journal of Nutritional Science, 5. https://doi.org/10.1017/jns.2016.41

Porcza, L., Simms, C., dan Chopra, M. (2016). Honey and Cancer: Current Status

and Future Directions. Diseases, 4(4), 30.

https://doi.org/10.3390/diseases4040030

PSSP. (2017). Metode Penghitungan Viabilitas Sel Kultur In Vitro Pembuatan

[Paper]. Pusat Studi Satwa dan Primata. Bogor: PSSP.

Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T.

J., dan Minor, L. (2013). Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual,

114(8), 785–796. https://doi.org/10.1016/j.acthis.2012.01.006

Robaszkiewicz, A., A. Balcerczyk, G., dan Bartosz. (2007). Antioxidative and

prooxidative effects of quercetin on A549 cells. Cell Biology International,

31(10), 1245–1250.

Robinson, J. (2011). Mass Density. Creative Common Attribution, 04, 1–8.

Rupachandra, S., dan Sarada, D. V. L. (2014). Induction of Apoptotic Effects of

Antiproliferative Protein from the Seeds of Borreria hispida on Lung Cancer (

A549 ) and Cervical Cancer ( HeLa ) Cell Lines. BioMed, 2014, 1–8.

Saeed, S., ian, Jalil, T. A., dan Saeideh, D. (2010). Modulation of programmed cell

death by honey bee in human prostate adenocarcinoma. Journal of Medicinal

Plants Research, 4(23), 2551–2556. https://doi.org/10.5897/JMPR10.607

Salih, K. M., Al-Sa’ady, A. Y., dan Agha, S. I. (2009). Anti-Tumor And Immuno-

modulating Effect of Honey in Normal And Tumor-bearing Mice. Kufa

Medicine Journal, 12(2), 196–203.

Sarmoko, dan Larasati. (2009). Regulasi siklus sel. Cancer Chemoprevention

Research Center, 1–8.

59

Satyanarayana, A., dan Kaldis, P. (2009). Mammalian Cell-cycle Regulation:

Several Cdks, Numerous Cyclins, and Diverse Compensatory Mechanisms.

Oncogene, 28, 2925–2939.

Sebaugh, J. L. (2011). Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.

Pharmaceutical Statistics Journal, 10(2), 128–134.

https://doi.org/10.1002/pst.426

Soeng, S., Evacuasiany, E., Widowati, W., Fauziah, N., Manik, V. T., dan

Maesaroh, M. (2015). Inhibitory potential of rambutan seeds extract and

fractions on adipogenesis in 3T3-L1 cell line. Journal of Experimental and

Integrative Medicine, 5(1), 55–60.

https://doi.org/10.5455/jeim.200115.or.120

Spilioti, E., Jaakkola, M., Tolonen, T., Lipponen, M., Virtanen, V., Chinou, I.,

Moutsatsou, P. (2014). Phenolic acid composition, antiatherogenic and

anticancer potential of honeys derived from various regions in Greece. PLoS

ONE, 9(4), 1–10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094860

Sukandar, D., Hermanto, S., dan Amelia, E. R. (2015). Penapisan Bioaktivitas

Tanaman Pangan Fungsional Masyarakat Jawa Barat dan Banten. Jakarta:

Cinta Buku Media.

Sumarlin, L., Muawanah, A., Wardhani, P., dan Masitoh. (2014). Aktivitas

Antikanker dan Antioksidan Madu di Pasaran Lokal Indonesia (Anticancer

and Antioxidant Activity of Honey in the Market Local Indonesia). Jurnal

Ilmu Pertanian Indonesia (JIPI), 19(3), 136–144.

Sunita, Y., Yogesh, K., dan Babul, L. J. (2017). Industrial Entomology (XI) [Buku].

Singapore: Springer Nature Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-10-

3304-9

Tongda, X., Li, D., dan Jiang, D. (2012). Targeting cell signaling and apoptotic

pathways by luteolin: Cardioprotective role in rat cardiomyocytes following

ischemia/reperfusion. Nutrients, 4(12), 2008–2019.

https://doi.org/10.3390/nu4122008

Torre, L., Siegel, R., dan Ahmedin, J. (2015). Global Cancer Facts dan Figures 3rd

Edition. American Cancer Society, (800), 1–64.

https://doi.org/10.1002/ijc.27711

Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, T. ., Mazur, M., dan Telser, J. (2007).

Free radicals and antioxidants in normal physiological function and human

disease. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 3(1), 44–

84.

Wang, Y., He, Q., dan Chiu, J. (2014). Dioscin induced activation of p38 MAPK

and JNK via mithochondrial pathway in HL-60 cell line. European Journal of

Pharmacol, 735, 52–58.

60

Wang, Z., Cheng, Y., Wang, N., Wang, D., Li, Y., Han, F., dan Chen, J. (2012).

Dioscin induces cancer cell apoptosis through elevated oxidative stress

mediated by downregulation of peroxiredoxins. Cancer Biology, 13, 138–147.

World Health Organization. (2014). Cancer Country Profiles: Indonesia. Cancer

Country Profiles, 22–23.

Xu, X. H., Li, T., Fong, C. M. V., Chen, X., Chen, X. J., Wang, Y. T., dan Lu, J. J.

(2016). Saponins from chinese medicines as anticancer agents. Molecules,

21(10), 1–27. https://doi.org/10.3390/molecules21101326

Yuslianti, E. R., M. Bachtia, B., F. Suniart, D., dan B. Sutjiat, A. (2015).

Antioxidant Activity of Rambutan Honey: The Free Radical-Scavenging

Activity in vitro and Lipid Peroxidation Inhibition of Oral Mucosa Wound

Tissue in vivo. Research Journal of Medicinal Plant, 9(6), 284–292.

https://doi.org/10.3923/rjmp.2015.284.292

Zheng, L., Dong, D., Xu, L., Yin, L., Xu, Y., Qi, Y.,dan Peng, J. (2013). Dioscin, a

natural steroid saponin, induces apoptosis and DNA damage through reactive

oxygen species: A potential new drug for treatment of glioblastoma

multiforme. Food Chemistry, 59, 657–669.

61

LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil MTT assay fraksi air

Konsentrasi

50 100 200 400 800

Atr -21,5863 -26,9828 -33,3606 -34,9959 -10,0572

Bkld 78,2502 31,1529 66,14881 64,02289 30,66231

Crb 60,34342 0,327065 -0,2453 7,84955 -25,5928

Dklx 29,02698 -31,3164 50,28618 65,33115 11,36549

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

50 100 200 400 800% P

engh

amb

atan

Konsentrasi (ppm)

Atr

Bkld

Crb

Dklx

62

Lampiran 2. Hasil MTT assay fraksi etil asetat

Konsentrasi

50 100 200 400 800

Atr 36,2224 40,31071 -27,8823 11,69256 52,00327

Bkld 34,91415 -24,6934 29,76288 13,24612 -25,4293

Crb 65,98528 63,85936 70,80948 60,83401 50,12265

Dklx -2,04415 4,66067 -2,61652 -26,7375 26,49223

-40

-20

0

20

40

60

80

50 100 200 400 800

% P

engh

amb

atan

Konsentrasi (ppm)

Atr

Bkld

Crb

Dklx

63

Lampiran 3. Hasil MTT assay fraksi Atr air

Atr Air ppm

Ulangan % Penghambatan Standar Deviasi

Rata-rata % Penghambatan

% Penghambatan % viabilitas OD 1 OD 2 1 2

50 0,869 0,618 -42,1096 -1,06296 29,02433 -21,586263 -21,59 ± 29,02 121,58626

100 0,885 0,668 -44,7261 -9,23957 25,09275 -26,982829 -26,98 ± 25,09 126,98283

200 0,95 0,681 -55,3557 -11,3655 31,10576 -33,360589 -33,36 ± 31,11 133,36059

400 1,010 0,641 -65,1676 -4,8242 42,66924 -34,995912 -35,00 ± 42,67 134,99591

800 0,699 0,647 -14,3091 -5,8054 6,013009 -10,057236 -10,06 ± 6,01 110,05724

Kontrol 0,612 0,611 0 0 100

y = 0.0185x - 31.122R² = 0.3111

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

% P

ENG

HA

MB

ATA

N

KONSENTRASI (PPM)

64

Lampiran 4. Hasil MTT assay fraksi Atr etil asetat

Atr EA ppm


Rata-rata %

Penghambatan

% Penghambatan

% Viabilitas OD 1 OD 2 1 2

50 0,449 0,331 26,574 45,87081 13,64491 36,222404 36,22 ± 13,64 63,7776

100 0,611 0,119 0,081766 80,53966 56,89232 40,310711 40,31 ± 56,89 59,68929

200 0,812 0,752 -32,7882 -22,9763 6,938088 -27,88226 -27,89 ± 6,94 127,8823

400 0,760 0,32 -24,2845 47,66966 50,87931 11,692559 11,69 ± 50,88 88,30744

800 0,34 0,247 44,39902 59,60752 10,75404 52,003271 52,00 ± 10,75 47,99673

Kontrol 0,612 0,611 0 0 100

y = 0,0315x + 12,704R² = 0,0916

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 200 400 600 800 1000

% P

ENG

HA

MB

ATA

N

KONSENTRASI (PPM)

65

Lampiran 5. Hasil MTT assay fraksi Bkld Air

Bkld Air ppm



% Penghambatan

% Viabilitas OD 1 OD 2 1 2

50 0,147 0,119 75,96075 80,53966 3,237774 78,250204 78,25 ± 3,24 21,749796

100 0,63 0,212 -3,02535 65,33115 48,33534 31,152903 31,15 ± 48,33 68,847097

200 0,192 0,222 68,6018 63,69583 3,469044 66,148814 66,14 ± 3,47 33,851186

400 0,297 0,143 51,43091 76,61488 17,80776 64,022895 64,02 ± 17,81 35,977105

800 0,12 0,728 80,37612 -19,0515 70,30596 30,662306 30,66 ± 70,31 69,337694

Kontrol 0,612 0,611 0 0

y = -0,036x + 65,195R² = 0,2528

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 200 400 600 800 1000

% P

ENG

HA

MB

ATA

N

KONSENTRASI (PPM)

66

Lampiran 6. Hasil MTT assay fraksi Bkld etil asetat

Bkld EA ppm



% Penghambatan

%viabilitas OD 1 OD 2 1 2

50 0,21 0,586 65,65822 4,170074 43,47868 34,914146 34,91 ± 43,48 65,08585

100 0,856 0,669 -39,9836 -9,40311 21,62371 -24,69338 -24,69 ± 21,62 124,6934

200 0,228 0,631 62,71464 -3,18888 46,60082 29,762878 29,76 ± 46,60 70,23712

400 0,417 0,644 31,80703 -5,3148 26,2491 13,246116 13,25 ± 26,25 86,75388

800 0,874 0,66 -42,9272 -7,93132 24,74585 -25,42927 -25,43 ± 24,74 125,4293

Kontrol 0,612 0,611 0 0 100

y = -0,0496x + 20,922R² = 0,2701

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

% P

ENG

HA

MB

ATA

N

KONSENTRASI (PPM)

67

Lampiran 7. Hasil MTT assay fraksi Crb Air

Crb Air ppm



% Penghambatan

% viabilitas OD 1 OD 2 1 2

50 0,262 0,223 57,15454 63,5323 4,509757 60,343418 60,34 ± 4,51 39,656582

100 0,799 0,42 -30,6623 31,31643 43,82559 0,3270646 0,33 ± 43,82 99,672935

200 0,86 0,366 -40,6378 40,14718 57,12359 -0,2452984 -0,24 ± 57,12 100,2453

400 0,797 0,33 -30,3352 46,03434 54,00145 7,8495503 7,85 ± 54,00 92,15045

800 0,82 0,716 -34,0965 -17,0891 12,02602 -25,592805 -25,59 ± 12,03 125,5928

Kontrol 0,612 0,611 0 0 100

y = -0,0741x + 31,507R² = 0,5114

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900% P

ENG

HA

MB

ATA

N

KONSENTRASI (PPM)

68

Lampiran 8. Hasil MTT assay fraksi Crb etil asetat

Crb EA ppm



% Penghambatan


50 0,283 0,133 53,72036 78,2502 17,34522 65,985282 65,98 ± 17,34 34,01472

100 0,256 0,186 58,13573 69,58299 8,094436 63,859362 63,86 ± 8,09 36,14064

200 0,211 0,146 65,49469 76,12428 7,516262 70,809485 70,81 ± 7,52 29,19052

400 0,272 0,207 55,51922 66,14881 7,516262 60,834015 60,83 ± 7,52 39,16599

800 0,171 0,439 72,03598 28,20932 30,99013 50,122649 50,12 ± 30,99 49,87735

Kontrol 0,612 0,611 0 0 100

y = -0,0224x + 69,256R² = 0,7791

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

% P

ENG

HA

MB

ATA

N

KONSENTRASI (PPM)

69

Lampiran 9. Hasil MTT assay fraksi Dklx Air

Dklx Air ppm



% Penghambatan


50 0,225 0,643 63,20523 -5,15127 48,33534 29,026983 29,03 ± 48,33 70,973017

100 0,912 0,694 -49,1415 -13,4914 25,20839 -31,316435 -31,32 ± 25,21 131,31643

200 0,368 0,24 39,82011 60,75225 14,80125 50,286182 50,29 ± 14,80 49,713818

400 0,295 0,129 51,75797 78,90433 19,19538 65,331153 65,33 ± 19,19 34,668847

800 0,29 0,794 52,57563 -29,8446 58,27994 11,365495 11,36 ± 58,28 88,634505

Kontrol 0,612 0,611 0 0 100

y = 0,0133x + 20,816R² = 0,0117

-40

-20

0

20

40

60

80

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

% P

ENG

HA

MB

ATA

N

KONSENTRASI (PPM)

70

Lampiran 10. Hasil MTT assay fraksi Dklx etil asetat

Dklx EA ppm



% Penghambatan


50 0,617 0,631 -0,89943 -3,18888 1,618887 -2,044154 -2,04 ± 1,62 102,0442

100 0,591 0,575 3,352412 5,968929 1,850157 4,6606705 4,66 ± 1,85 95,33933

200 0,667 0,588 -9,07604 3,843009 9,135149 -2,616517 -2,62 ± 9,13 102,6165

400 0,893 0,657 -46,0343 -7,44072 27,28981 -26,73753 -26,74 ± 27,29 126,7375

800 0,35 0,549 42,7637 10,22077 23,01132 26,492232 26,49 ± 23,01 73,50777

Kontrol 0,612 0,611 0 0 100

y = 0,028x - 8,7285R² = 0,2012

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 200 400 600 800 1000

% P

ENG

HA

MB

ATA

N

KONSENTRASI (PPM)

71

Lampiran 11. Hasil MTT assay % Penghambatan tertinggi

Air EA

Atr -10,0572 52,00327

Bkld 78,2502 34,91415

Crb 60,34342 70,80948

Dklx 65,33115 26,49223

-20

0

20

40

60

80

100

Air EA

% P

engh

amb

atan

Fraksi

Atr

Bkld

Crb

Dklx

AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK MADU LOKAL MELALUI...

Documents

Transcript of AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK MADU LOKAL MELALUI...