AKTIVITAS ACE INHIBITOR HIDROLISAT PROTEIN SUSU KEDELAI...
89
AKTIVITAS ACE INHIBITOR HIDROLISAT PROTEIN SUSU KEDELAI HASIL HIDROLISIS PAPAIN SKRIPSI FISKA EVIANTI PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2019 M / 1441 H
Transcript of AKTIVITAS ACE INHIBITOR HIDROLISAT PROTEIN SUSU KEDELAI...
i
AKTIVITAS ACE INHIBITOR HIDROLISAT PROTEIN SUSU
KEDELAI HASIL HIDROLISIS PAPAIN
SKRIPSI
FISKA EVIANTI
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2019 M / 1441 H
ii
AKTIVITAS ACE INHIBITOR HIDROLISAT PROTEIN SUSU
KEDELAI HASIL HIDROLISIS PAPAIN
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Program Studi Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
Oleh:
FISKA EVIANTI
1115096000070
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2019 M / 1441 H
iii
iv
v
vi
ABSTRAK
FISKA EVIANTI, Aktivitas ACE Inhibitor Hidrolisat Protein Susu Kedelai
Hasil Hidrolisis Papain. Dibimbing oleh SANDRA HERMANTO dan SRI
YADIAL CHALID.
Hipertensi merupakan suatu kondisi medis meningkatnya tekanan darah di atas
tekanan darah normal yang disebabkan oleh kebiasaan hidup yang buruk. Upaya
untuk mencegah dan menurunkan tekanan darah dapat dilakukan dengan
mengkonsumsi makanan atau minuman yang mengandung peptida bioaktif
antihipertensi seperti susu kedelai. Penelitian ini bertujuan menghasilkan
hidrolisat protein susu kedelai yang memiliki aktivitas antihipertensi. Hidrolisis
protein dengan papain dilakukan dengan perbandingan enzim : substrat 0,1; 0,2;
0,5% (b/v), waktu inkubasi 0, 2, 4, 8, 16 dan 24 jam pada suhu 37 °C. Hidrolisat
protein diuji derajat hidrolisis (DH) untuk mengetahui kondisi optimal hidrolisis.
Aktivitas antihipertensi hidrolisat diuji dengan metode inhibisi ACE (Angiotensin
Converting Enzyme) yang merupakan enzim kunci dalam pengaturan tekanan
darah. Hidrolisat yang paling aktif dipisahkan dengan ultramembran filtrasi
(MWCO <3kDa). Hidrolisat dan fraksi teraktif diidentifikasi dengan
elektroforesis SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukkan kondisi optimal
hidrolisis pada konsentrasi papain 0,2% dan waktu hidrolisis 8 jam dengan nilai
DH sebesar 11,001%. Aktivitas ACE inhibitor tertinggi diperoleh pada hidrolisat
dengan konsentrasi papain 0,2% dan waktu hidrolisis 8 jam yaitu sebesar
59,211% dengan nilai 𝐼𝐶50 sebesar 89,640 mg/L. Filtrat hasil fraksinasi
menghasilkan aktivitas ACE inhibitor yang lebih rendah yaitu sebesar 2,203%.
Hasil SDS-PAGE menunjukkan bahwa hidrolisat dengan konsentrasi papain 0,2%
dan waktu hidrolisis 2-16 jam terdeteksi 11 pita pada bobot molekul 13,880-
68,512 kDa.
Kata kunci : Antihipertensi, papain, peptida bioaktif, SDS-PAGE, susu kedelai
vii
ABSTRACT
FISKA EVIANTI, ACE Inhibitor Activity Hydrolyzate Protein of Soy Milk
From Papain Hydrolysis. Supervised by SANDRA HERMANTO and SRI
YADIAL CHALID.
Hypertension is the medical condition where blood pressure rises above normal
blood pressure. Hypertension were caused by difficulties in living a bad life.
Efforts to prevent and to reduce blood pressure could be done by consuming food
or drinks containing antihypertensive bioactive peptides such as soy milk, because
they which have high protein contain. This research purpose to produce protein
soy milk hydrolyzate which has antihypertensive activity. Protein hydrolysis with
the papain is carried out by comparison of enzymes: substrates 0.1; 0.2; 0.5%
(b/v), incubation time 0, 2, 4, 8, 16 and 24 hours at 37 ° C. Protein hydrolyzate
was tested for the degree of hydrolysis (DH) to determine the optimal hydrolysis
conditions. Antihypertensive activity of hydrolyzate is tested by ACE
(Angiotensin Converting Enzyme) inhibition method which is a key enzyme in
regulating blood pressure. The most active hydrolyzate was separated by
ultramembranation filtration (MWCO <3kDa). The hydrolyzate and the most
active fraction were identified by SDS-PAGE electrophoresis. The results showed
optimal conditions of hydrolysis at a papain concentration of 0,2% and hydrolysis
time of 8 hours with a DH value of 11,001%. The highest ACE inhibitor activity
was obtained in hydrolyzate with a papain concentration of 0,2% and an 8-hour
hydrolysis time of 59,211% with a 𝐼𝐶50 value of 89,640 mg/L. The fractionated
filtrate resulted ACE inhibitor activity which was lower at 2,203%. The SDS-
PAGE results showed that soy milk hydrolyzate 0,2% with a hydrolysis time of 2-
16 hours detected 11 bands at molecular weights 13,880- 68,512 kDa.
Keywords: Antihypertension, papain, bioactive peptide, SDS-PAGE, soy milk
viii
KATA PENGANTAR
Segala puji dan syukur penulis haturkan atas kehadirat Allah SWT atas
segala nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
Shalawat serta salam semoga selalu dilimpahkan kepada junjungan kita Nabi
Muhammad SAW. Skripsi ini berjudul Aktivitas ACE Inhibitor Hidrolisat Protein
Susu Kedelai Hasil Hidrolisis Papain.
Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih
kepada semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis sehingga dapat
menyelesaikan skripsi ini.
1. Dr. Sandra Hermanto, M.Si selaku pembimbing I yang telah memberikan
ilmu pengetahuan, arahan, dan nasehat dalam penelitian maupun dalam
penulisan skripsi ini.
2. Dr. Sri Yadial Chalid, M.Si selaku pembimbing II yang telah membimbing
dan memberikan arahan kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.
3. Dr. La Ode Sumarlin, M.Si dan Nurhasni, M.Si selaku penguji I dan II yang
telah memberi kritik dan saran yang bermanfaat kepada penulis pada
penyusunan skripsi ini.
4. Dr. La Ode Sumarlin, M.Si selaku Ketua Program Studi Kimia Fakultas Sains
dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
5. Prof. Dr. Lily Surayya Eka Putri, M.Env.Stud. selaku Dekan Fakultas Sains
dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
6. Segenap dosen program studi kimia yang telah memberikan ilmu kepada
kami dengan ikhlas dan sabar.
ix
7. Kedua orang tua tersayang Nurhayati (Ibu), Hartono (Bapak), serta adik-
adikku Fanny dan Fairish yang telah memberikan semangat, doa, serta
dukungan kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini.
8. Tommy Syahputra yang senantiasa memberikan motivasi, saran, dan menjadi
teman diskusi selama penyusunan skripsi ini.
9. Leni Nursafitri, Rizkiyah Hasanah, Yessinta Kurnianti, Reni Rismayanti,
Nurul Annisa, dan Yuthika Mardiyah yang selalu memberikan semangat,
keakraban, keceriaan, dan selalu ada untuk menemani dari awal perkuliahan
hingga saat ini.
10. Teman-teman seperjuangan kimia angkatan 2015 yang senantiasa
memberikan semangat serta motivasi.
Akhir kata, penulis berharap Allah SWT membalas segala kebaikan semua
pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat.
Jakarta, November 2019
Penulis
x
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR. ..................................................................................... viii
DAFTAR ISI. ....................................................................................................... x
DAFTAR TABEL. ............................................................................................ xii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiii
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xiv
BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ................................................................................................ 1
1.2 Rumusan Masalah ........................................................................................... 3
1.3 Hipotesis Penelitian ......................................................................................... 4
1.4 Tujuan Penelitian ............................................................................................ 4
1.5 Manfaat Penelitian .......................................................................................... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 6
2.1 Susu Kedelai ................................................................................................... 6
2.2 Hipertensi ........................................................................................................ 8
2.3 Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Inhibitor .......................................... 9
2.4 Peptida Bioaktif ............................................................................................. 12
2.5 Enzim Papain ................................................................................................. 14
2.6 Uji Aktivitas ACE Inhibitor Secara In Vitro ................................................. 15
2.7 SDS-PAGE .................................................................................................... 16
2.8 Membran Ultafiltrasi ..................................................................................... 18
BAB III METODE PENELITIAN .................................................................. 20
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................................... 20
3.2 Alat dan Bahan .............................................................................................. 20
3.2.1 Alat . .................................................................................................... 20
3.2.2 Bahan . ................................................................................................ 20
3.3 Diagram Alir Penelitian ................................................................................ 21
3.4 Prosedur Penelitian........................................................................................ 22
3.4.1 Pembuatan Susu Kedelai ..................................................................... 22
3.4.2 Uji Proksimat ...................................................................................... 22
xi
3.4.3 Pemisahan Protein dengan Presipitasi HCl ......................................... 24
3.4.4 Pengukuran Kadar Protein .................................................................................................. 24
3.4.5 Hidrolisis Protein ................................................................................ 25
3.4.6 Analisis Derajat Hidrolisis (DH) ........................................................ 25
3.4.7 Uji ACE Inhibitor ............................................................................... 26
3.4.8 Fraksinasi dengan Ultramembran Filtrasi ........................................... 27
3.4.9 Analisis Fraksi Protein Hidrolisat dengan SDS-PAGE ...................... 27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................... 30
4.1 Susu Kedelai .................................................................................................. 30
4.2 Isolat Protein Susu Kedelai ........................................................................... 34
4.3 Derajat Hidrolisis Susu Kedelai .................................................................... 34
4.4 Aktivitas ACE Inhibitor dan IC50 ................................................................. 37
4.5 Fraksinasi Protein Hidrolisat ......................................................................... 40
4.6 Karakteristik Protein Hidrolisat Susu Kedelai .............................................. 41
BAB V PENUTUP ............................................................................................. 45
5.1 Simpulan ........................................................................................................ 45
5.2 Saran .............................................................................................................. 45
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 46
LAMPIRAN ....................................................................................................... 54
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Perbandingan Gizi Susu Kedelai dengan Susu Sapi dalam 100 Gram .. 6
Tabel 2. Perbandingan Gizi Kacang Kedelai, Kacang Tanah, dan Kacang Hijau 7
Tabel 3. Sifat Fungsional Peptida Bioaktif ........................................................ 13
Tabel 4. Hasil Analisis Proksimat Kacang Kedelai dan Susu Kedelai............... 31
Tabel 5. Kadar Protein dan Persentase Inhibisi Hasil Fraksinasi ....................... 40
Tabel 6. Berat Molekul Protein Susu Kedelai dan Hidrolisat Susu Kedelai ...... 42
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Mekanisme ACE Inhibitor Menghambat Angiotensin I ................. 10
Gambar 2. Interaksi Kaptopril dengan Sisi Aktif ACE ..................................... 11
Gambar 3. Hidrolisis Protein oleh Endo-protease dan Ekso-protease .............. 12
Gambar 4. Reaksi Hidrolisis Hipuril-Histidin-Leusin (HHL) oleh ACE .......... 16
Gambar 5. Susu Kedelai .................................................................................... 30
Gambar 6. Nilai Derajat Hidrolisis Susu Kedelai.............................................. 35
Gambar 7. Mekanisme Kerja Enzim Papain ..................................................... 37
Gambar 8. Aktivitas ACE Inhibitor Hidrolisat Susu Kedelai ........................... 38
Gambar 9. Profil Protein Hasil SDS-PAGE ...................................................... 42
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Kadar Air .......................................................................................... 54
Lampiran 2. Kadar Abu ......................................................................................... 55
Lampiran 3. Kadar Protein .................................................................................... 56
Lampiran 4. Kadar Protein Total ........................................................................... 57
Lampiran 5. Derajat Hidrolisis .............................................................................. 58
Lampiran 6. Analisis Angiotensin Converting Enzim (ACE) Inhibitor ................ 60
Lampiran 7. IC50 Hidrolisat Susu Kedelai .......................................................................................... 62
Lampiran 8. Kadar Protein Hasil Fraksinasi ......................................................... 63
Lampiran 9. Analisis Elektroforesis SDS-PAGE .................................................. 64
Lampiran 10. Pembuatan Larutan Kerja SDS-PAGE (Laemmli, 1971) ............... 66
Lampiran 11. Pembuatan Larutan Kerja Uji ACE inhibitor ................................. 69
Lampiran 12. Pembuatan Larutan Kerja Lowry .................................................... 71
Lampiran 13. Pembuatan Larutan Standar BSA ................................................... 72
Lampiran 14. Pembuatan Buffer Fosfat 0,02 M .................................................... 73
Lampiran 15. Pembuatan Larutan Trichloroacetic Acid (TCA) 10% ................... 74
Lampiran 16. Perhitungan Konsentrasi Enzim : Substrat untuk Hidrolisis . ........ 74
Lampiran 17. Sertifikat Analisis Papain . ............................................................. 75
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Hipertensi adalah suatu kondisi medis yang kronis karena tekanan darah
meningkat di atas tekanan darah normal dan merupakan penyakit pembunuh
paling dahsyat di dunia ini (Peter, 2011). Prevalensi hipertensi Nasional
berdasarkan Riskesdas (2013) sebesar 25,8% (Depkes, 2017). Hipertensi telah
mengakibatkan kematian sekitar 8 juta orang setiap tahun, 1,5 juta kematian
tersebut terjadi di Asia Tenggara (WHO, 2011). Hipertensi dapat diobati dengan
obat-obatan sintetik seperti kaptopril dan lisinopril, namun memberikan efek
samping seperti batuk kering, sakit kepala, dan lemas (Kurniawati et al., 2015).
Alternatif lain yang dapat digunakan untuk menjaga tekanan darah agar tetap
normal adalah dengan mengkonsumsi bahan pangan yang memiliki peptida
bioaktif ACE inhibitor, diantaranya adalah ayam kampung (Jamhari et al., 2013),
umbi-umbian seperti ubi gembili dan ubi kelapa (Kurniawati, 2015), susu kedelai
(Wang et al., 2008), dan lain-lain.
Allah berfirman dalam surat Yasin ayat 33:
Artinya : Dan suatu tanda (kebesaran Allah) bagi mereka adalah bumi yang mati
(tandus). Kami hidupkan bumi itu dan Kami keluarkan darinya biji-bijian,
maka dari (biji-bijian) itu mereka makan.
Ayat diatas menjelaskan bahwa Allah telah mengeluarkan biji-bijian di
atas bumi yang dapat dikonsumsi oleh manusia. Biji-bijian tersebut memiliki
banyak manfaat yaitu selain dapat dijadikan sebagai makanan pokok, biji-bijian
2
juga dapat dimanfaatkan sebagai pangan fungsional yang dapat menjaga
kesehatan tubuh. Kacang kedelai merupakan salah satu biji-bijian yang dimaksud
ayat tersebut. Kacang kedelai merupakan sumber protein nabati dengan kualitas
tinggi yaitu mengandung protein sebesar 35% dan susunan asam amino essensial
yang lengkap (Purnomo et al., 2007). Protein dan peptida kedelai memiliki
potensi sebagai Angiotensin Converting Enzyme (ACE) inhibitor yang dapat
menurunkan tekanan darah (Shimakage et al., 2012). Kacang kedelai dapat diolah
menjadi minuman seperti susu kedelai dan dapat dimanfaatkan sebagai minuman
antihipertensi.
Penelitian beberapa bahan pangan yang mengandung peptida bioaktif
sebagai ACE inhibitor diantaranya yaitu yogurt plain (53,470%) (Wulandani,
2017) dan ayam kampung (77,670%) (Jamhari et al., 2013). Hidrolisis susu
kedelai menggunakan protease oleh Shimakage et al., (2012) menghasilkan
delapan peptida dengan aktivitas ACE inhibitor sekitar 36 kali lebih tinggi
daripada susu kedelai tanpa hidrolisis. Fermentasi protein kedelai dengan
Lactobacillus casei spp. pseudoplantarum menghasilkan 2 peptida antihipertensi
dengan nilai IC50 sebesar 17 dan 30 mg/L (Vallabha et al., 2013).
Kacang kedelai pada penelitian ini diolah menjadi susu kedelai dan
dilakukan karakterisasi sifat kimia dan fisika untuk dibandingkan dengan SNI.
Susu kedelai kemudian dihidrolisis menggunakan papain dengan aktivitas enzim
125,2 TU/mg (Lampiran 17) untuk mendapatkan hidrolisat protein dan diuji
kemampuan aktivitas ACE inhibitor. Penggunaan papain pada penelitian ini
berdasarkan hasil penelitian Abubakar (2004) yaitu hidrolisis protein whey dengan
enzim papain konsentrasi 5% (aktivitas enzim 500 U/mg) pada suhu 37 °C, pH
3
7,5 dan menggunakan buffer fosfat 0,02 M menghasilkan aktivitas ACE inhibitor
sebesar 86,5%. Susu kerbau fermentasi hasil fraksinasi menggunakan membran
ultrafiltrasi <3 kDa menghasilkan aktivitas ACE inhibitor sebesar 99,300%, lebih
besar dibandingkan sebelum fraksinasi yaitu 87,520% (Chalid et al., 2018).
Penggunaan papain pada penelitian ini karena papain mudah didapat,
relatif tahan terhadap suhu, dan termasuk protease sistein golongan endoprotease
yang dapat memutus ikatan peptida pada rantai protein sehingga dihasilkan
peptida dan polipeptida (Winarno, 1986). Penggunaan papain untuk mendapatkan
peptida bioaktif ACE inhibitor dari susu kedelai belum dilakukan, karenanya pada
penelitian ini enzim yang digunakan yaitu papain. Meinlschmidt et al., (2015)
menghasilkan derajat hidrolisis sebesar 4,6% dan pita protein dengan bobot
molekul <10 kDa dari hidrolisis susu kedelai menggunakan enzim papain dengan
konsentrasi 0,2% selama 2 jam. Hamid et al., (2016) menghasilkan IC50 sebesar 9
mg/L dari hidrolisat susu kerbau yang dihidrolisis menggunakan papain 0,005%
dengan aktivitas enzim >10 U/mg.
Penelitian ini dilakukan dengan optimasi proses hidrolisis dengan cara
memvariasikan waktu hidrolisis yaitu 0, 2, 4, 8, 16, dan 24 jam, serta konsentrasi
enzim yaitu 0,1; 0,2; dan 0,5% dengan tujuan mendapatkan kondisi optimum
proses hidrolisis sehingga didapatkan hidrolisat dengan derajat hidrolisis dan
aktivitas ACE inhibitor optimal. Hidrolisat dengan nilai ACE inhibitor tertinggi
dilakukan fraksinasi menggunakan membran ultrafiltrasi dengan tujuan
mendapatkan protein ukuran <3 kDa dengan aktivitas ACE inhibitor yang lebih
tinggi. Hidrolisat susu kedelai dan hasil fraksinasi dilakukan karakterisasi protein
menggunakan elektroforesis SDS-PAGE untuk mengetahui profil protein.
4
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana karakteristik kimia dan fisika kacang kedelai dan susu kedelai
pada penelitian ini?
2. Bagaimana kondisi optimum hidrolisis protein susu kedelai yang mampu
menghasilkan derajat hidrolisis dan aktivitas ACE inhibitor tertinggi?
3. Bagaimana aktivitas ACE inhibitor dan profil protein hidrolisat susu
kedelai sebelum dan sesudah dilakukan fraksinasi?
1.3 Hipotesis Penelitian
1. Kacang kedelai dan susu kedelai pada penelitian ini memiliki karakteristik
kimia dan fisika sesuai dengan SNI.
2. Kondisi optimum hidrolisis protein susu kedelai yang mampu
menghasilkan derajat hidrolisis dan aktivitas ACE inhibitor tertinggi pada
waktu 8 – 24 jam.
3. Hidrolisat protein susu kedelai setelah fraksinasi memiliki aktivitas ACE
inhibitor yang lebih tinggi dan profil protein dengan bobot molekul yang
lebih rendah.
1.4 Tujuan Penelitian
1. Menentukan karakteristik kimia dan fisika kacang kedelai dan susu kedelai
pada penelitian ini.
2. Menentukan kondisi optimum proses hidrolisis melalui variasi waktu dan
konsentrasi enzim yang mampu menghasilkan hidrolisat protein dengan
derajat hidrolisis dan aktivitas ACE inhibitor tertinggi.
5
3. Membuktikan kemampuan hidrolisat susu kedelai sebagai ACE inhibitor
dan profil proteinnya setelah proses fraksinasi.
1.5 Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan kepada
masyarakat mengenai manfaat susu kedelai sebagai pangan fungsional
antihipertensi yang lebih murah, dan mudah diperoleh.
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Susu Kedelai
Susu kedelai merupakan salah satu produk olahan kedelai yang diperoleh
dengan cara menggiling kedelai yang dicampur air kemudian disaring dan
dipanaskan (Astawan, 2004). Susu kedelai merupakan minuman yang bergizi
tinggi, terutama kandungan proteinnya. Susu kedelai juga mengandung lemak,
karbohidrat, kalsium, fosfor, zat besi, provitamin A, dan vitamin B (Santoso,
1994). Susu dapat berasal dari berbagai sumber, misalnya dari hewan ternak
seperti sapi atau kambing, selain itu susu juga dapat berasal dari nabati seperti
susu kedelai (Susanti et al., 2016).
Susu kedelai jika dibandingkan dengan susu hewani, memiliki kandungan
gizi, sifat fisik dan kimiawi yang hampir mirip dengan susu hewani. Susu kedelai
mengandung protein yang lebih tinggi dari susu sapi, kandungan lemak rendah,
tidak mengandung kolesterol, dan terkoagulasi apabila terkena asam (Rossi et al.,
2016).
Tabel 1. Perbandingan gizi susu kedelai dengan susu sapi dalam 100 g
Sumber: Mega (2013)
Komponen Susu Kedelai Susu Sapi
Kalori (Kkal) 41,00 61,00
Protein (gram) 3,50 3,20
Lemak (gram) 2,50 3,50
Karbohidrat (gram) 5,00 4,30
Kalsium (mg) 50,00 143,00
Fosfor (gram) 45,00 60,00
Besi (gram) 0,70 1,70
Vitamin A (SI) 200,00 130,00
Vitamin B1 (tiamin) (mgram) 0,08 0,03
7
Kandungan gizi antara susu kedelai dengan susu sapi hampir sama (Tabel
1) sehingga susu kedelai dapat digunakan sebagai pengganti susu sapi bagi orang
yang alergi terhadap protein hewani (Picauly et al., 2015). Fatisa et al., (2011)
menyatakan bahwa protein kedelai memiliki susunan asam amino essensial yang
dibutuhkan manusia yaitu isoleusin, leusin, metionin, valin, dan lisin yang
merupakan asam amino yang paling banyak terdapat dalam susu kedelai.
Susu kedelai baik dikonsumsi oleh orang-orang yang alergi susu sapi,
yaitu orang-orang yang tidak punya atau kekurangan enzim laktase (b-
galaktosidase) dalam saluran pencernaannya, sehingga tidak mampu mencerna
laktosa yang terkandung dalam susu sapi (Santoso, 1994). Ketahanan tubuh
masing-masing orang terhadap susu hewani yang mengandung laktosa berbeda-
beda, hal ini sangat dipengaruhi oleh kandungan enzim laktase dalam mukosa
usus. Enzim laktase berguna untuk menghidrolisis laktosa menjadi gula sederhana
yaitu glukosa dan galaktosa agar dapat digunakan untuk metabolisme dalam tubuh
manusia. Kekurangan enzim laktase akan menyebabkan laktosa tidak dapat
dicerna dengan baik, sebagai akibatnya laktosa akan tertimbun dalam jaringan
tubuh manusia sehingga mengakibatkan kerusakan jaringan tubuh (Buckle, 1987).
Kedelai dipilih sebagai bahan baku susu karena memiliki kandungan
protein yang lebih tinggi diantara jenis kacang-kacangan lainnya (Tabel 2).
Tabel 2. Perbandingan gizi kacang kedelai, kacang tanah, dan kacang hijau.
No Kandungan gizi (g) Kacang kedelai Kacang tanah Kacang hijau
1. Protein 35,00 30,40 22,00
2. Lemak 18,00 47,70 1,00
3. Karbohidrat 32,00 11,70 60,0
4. Serat 4,00 2,50 4,00
Sumber: Purnomo dan Purnawati (2007).
8
Kandungan protein pada kacang kedelai lebih tinggi dibandingkan kacang
tanah dan kacang hijau (Tabel 2), sehingga pada penelitian ini digunakan kacang
kedelai sebagai sumber protein. Biji-bijian pada dasarnya dapat diproses menjadi
susu sehingga akan menaikkan nilai cerna dari biji-bijian tersebut. Pembuatan
susu kedelai pada dasarnya adalah memproses kacang kedelai untuk diambil
sarinya. Proses pembuatan susu kedelai meliputi tahap-tahap: penyortiran,
pencucian, perendaman, penghancuran hingga berbentuk bubur, kemudian
penyaringan sehingga diperoleh sari kacang kedelai, setelah itu pemanasan
(Adnan, 1984).
2.2 Hipertensi
Hipertensi adalah suatu kondisi medis yang kronis dimana tekanan darah
meningkat di atas tekanan darah normal. Tekanan darah meningkat ketika terjadi
tekanan sistolik >140 mmHg dan diastolik >90 mmHg (Peter, 2011). Hipertensi
merupakan gangguan kesehatan yang sering dijumpai dan termasuk masalah
kesehatan penting karena angka prevalensi yang tinggi sehingga evaluasi
penggunaan obatnya perlu dilakukan (WHO, 2011). Prevalensi hipertensi nasional
berdasarkan Riskesdas (2013) mencapai 25,8%, tertinggi di Kepulauan Bangka
Belitung (30,9%), sedangkan terendah di Papua sebesar (16,8%) (Depkes, 2017).
Sebanyak 9,4 juta jiwa meninggal dunia setiap tahun akibat hipertensi, dan
diperkirakan pada tahun 2025 sekitar 29% penduduk dunia terkena hipertensi
(WHO, 2011).
Hipertensi merupakan kerusakan heterogen yang disebabkan oleh
penyebab khusus (hipertensi sekunder) atau karena penyebab yang tidak diketahui
(hipertensi primer atau esensial) (Wells et al., 2000). Enzim pengubah angiotensin
9
(Angiotensin Converting Enzyme (ACE)) mengubah angiotensin I menjadi
angiotensin II, yaitu suatu oktapeptida (8 asam amino) yang memiliki kemampuan
merangsang sekresi aldosteron sehingga terjadinya retensi natrium ekstraseluler.
Aldosteron merupakan hormon steroid yang memiliki peranan penting pada ginjal
(Akil, 2006).
Retensi Na ekstraseluler menyebabkan volume cairan ekstraseluler
meningkat sehingga terjadi hipertensi. Angiotensin II juga merangsang sekresi
Anti-Deuretic Hormone (ADH). ADH menyebabkan sedikitnya urin yang
diekskresikan keluar tubuh sehingga menyebabkan darah menjadi kental, untuk
mengencerkannya, cairan intraseluler akan ditarik keluar sehingga volume cairan
ekstraseluler akan meningkat, akibatnya volume darah akan meningkat yang
menyebabkan meningkatnya tekanan darah (Akil, 2006).
2.3 Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Inhibitor
ACE inhibitor merupakan senyawa atau zat aktif yang dapat menghambat
kerja dari Angiotensin Converting Enzyme (ACE) dalam pengubahan angiotensin
I menjadi angiotensin II sehingga terjadi pelebaran pembuluh darah (vasodilatasi)
dan penurunan sekresi hormon aldosteron (Siswandono et al., 2008). Vasodilatasi
secara langsung menurunkan tekanan darah, sedangkan berkurangnya aldosteron
menyebabkan ekskresi air, natrium dan retensi kalium (Nafrialdi, 2007).
ACE inhibitor digunakan terutama dalam pengobatan hipertensi, walaupun
kadang juga digunakan dalam pengobatan gangguan jantung atau penyakit ginjal.
Kontrol tekanan darah dapat dilakukan salah satunya dengan penghambat enzim
pengubah angiotensin (Riyadi, 2018).
10
Gambar 1. Mekanisme ACE Inhibitor menghambat angiotensin I
(Ismahun, 2001)
Mekanisme ACE inhibitor ditampilkan pada Gambar 1 yaitu mekanisme
penghambatan angiotensin I yang berupa dekapeptida menjadi angiotensin II yang
berupa oktapeptida oleh ACE inhibitor. ACE menyebabkan degradasi bradikinin
menjadi peptida inaktif. ACE inhibitor memiliki peranan dalam memblok
degradasi bradikinin, sehingga kadar bradikinin meningkat dan memberikan
konstribusi sebagai vasodilator pembuluh darah. Vasodilatasi tersebut akan
menurunkan tekanan pembuluh peripheral, preload, dan afterload pada jantung
sehingga tekanan darah dapat diturunkan (Riyadi, 2018). Rangkaian dari seluruh
sistem renin sampai menjadi angiotensin II dikenal dengan Renin Angiotensin
Aldosteron System (RAAS). Sistem tersebut memegang peranan penting dalam
patogenesis hipertensi. RAAS merupakan sistem hormonal yang kompleks
11
berperan dalam mengontrol sistem kardiovaskular, ginjal, kelenjar adrenal, dan
regulasi tekanan darah (Ismahun, 2001).
Obat sintetik telah ditemukan dan terbukti memiliki aktivitas ACE
inhibitor seperti kaptopril. Kaptopril adalah senyawa aktif yang berfungsi sebagai
ACE inhibitor golongan sulfihidril yang banyak digunakan untuk pengobatan
hipertensi dan gagal jantung (Khirzin et al., 2015). Kaptopril berinteraksi dengan
sisi aktif enzim ACE sehingga proses pengubahan angiotensin I menjadi
angiotensin II dihambat yang berakibat pada tidak naiknya tekanan darah.
Gambar 2. Interaksi kaptopril dengan sisi aktif ACE
(Wang et al., 2011)
Interaksi antara kaptopril dengan ACE terjadi pada gugus sulfihidril yang
terletak pada ujung kaptopril akan berinteraksi dengan ion Zn2+
yang berada pada
sisi aktif enzim ACE (Gambar 2). Gugus karbonil yang terletak di tengah akan
berinteraksi dengan sisi Hydrogen binding dengan adanya ikatan hidrogen yang
sangat kuat. Atom O pada gugus karboksilat yang terletak di ujung akan
berinteraksi secara ionik dengan tirosin, glutamin dan lisin pada struktur ACE
(Natesh et al., 2004).
Bahan makanan yang memiliki aktivitas ACE inhibitor diantaranya adalah
daun singkong karena mengandung flavonoid yang dapat menghambat ACE (Asif
ACE
Substrat
Inhibitor
12
et al., 2013), umbi-umbian seperti ubi gembili, gadung dan ubi kelapa karena
mengandung protein dioscorin yang memiliki aktivitas penghambatan ACE
(Kurniawati, 2015), dan susu kedelai karena mengandung glisinin yang memiliki
sifat ACE inhibitor (Wang et al., 2008).
2.4 Peptida Bioaktif
Peptida bioaktif merupakan potongan-potongan protein yang terdiri dari 2-
20 asam amino dan memiliki aktivitas tertentu yang baik bagi tubuh. Protein
dalam bentuk utuh memiliki bioaktivitas yang rendah, sedangkan protein yang
telah dihidrolisis dengan enzim memiliki bioaktivitas yang tinggi karena protein
telah terpotong menjadi peptida-peptida yang lebih kecil. Peptida bioaktif
memiliki potensi sebagai senyawa yang bersifat antihipertensi, antioksidan,
antibakteri, antitrombotik, dan imunomodulator (Riyadi, 2018).
Gambar 3. Hidrolisis protein oleh endoprotease dan eksopeptidase
(Thiquynhhoa et al., 2014)
Proses hidrolisis protein ditampilkan pada Gambar 3 yaitu endoprotease
menghidrolisis protein menjadi peptida yang memiliki ukuran lebih pendek.
Peptida dapat dihidrolisis kembali oleh eksopeptidase menghasilkan peptida dan
asam amino bebas. Eksopeptidase adalah enzim yang bekerja dengan cara
memotong bagian ujung amino atau karboksil dari suatu ikatan peptida. Sifat
13
fungsional peptida bioaktif ditentukan oleh susunan asam amino. Peptida dengan
susunan asam amino Val-Lys-Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys mempunyai fungsi
sebagai antioksidan (Edesma et al., 2004), sedangkan peptida dengan urutan asam
amino Val-Pro-Pro atau Ile-Pro-Pro mempunyai fungsi sebagai ACE inhibitor
(Nakamura et al., 1995). Peptida yang dihasilkan dari protein pangan dapat
menurunkan tekanan darah, meningkatkan sistem imun, memiliki aktivitas
antibakteri dan antikapang (Riyadi, 2018). Sifat fungsional peptida bioaktif
lainnya disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Sifat fungsional peptida bioaktif
No Protein Peptida
Bioaktif Bioaktivitas Sumber Referensi
1. β-conglycinin LAIPVNKP ACE inhibitor Susu
kedelai
Wang et al.,
2008
2. β-conglycinin
(α’-subunit)
Soymetide-9:
MITLAIPVN
Meningkatkan
sistem imun
Susu
kedelai
Yoshikawa,
2015
3. β-conglycinin
(β-subunit)
Soymorphin-
5: YPFVV Antidiabetes
Susu
kedelai
Yoshikawa,
2015
4. Glycinin VLIVP ACE inhibitor Susu
kedelai
Wang et al.,
2008
5.
α-La, β-La
dan Serum
albumin
Lactokinins ACE inhibitor Susu
sapi
Park et al.,
2015
6. αs2-casein Casocidin Antimikroba Susu
sapi
Park et al.,
2015
7. Lactoferrin Laktoferin
Antimikroba,
meningkatkan
sistem imun
Susu
sapi
Park et al.,
2015
8. κ-casein Casoplatelin Antitrombotik Susu
sapi
Park et al.,
2015
Peptida bioaktif dapat dihasilkan dari beberapa cara yaitu hidrolisis
enzimatis dengan enzim pencernaan, fermentasi dengan memanfaatkan enzim
yang dihasilkan dari aktivitas mikroba, dan sintesis kimia. Hidrolisis protein
14
secara enzimatis memiliki kelebihan dibandingkan hidrolisis protein dengan asam
dan alkali karena produk peptida yang dihasilkan memiliki komposisi dan urutan
asam amino yang spesifik sesuai dengan jenis protease yang digunakan. Hidrolisis
protein secara enzimatis berlangsung pada kondisi tidak ekstrim (mild)
dibandingkan menggunakan asam atau basa sehingga tidak merusak asam amino
yang dihasilkan (Restiani, 2016). Hidrolisis enzimatis mampu menghasilkan
peptida dengan aktivitas yang diharapkan. Kondisi fisiko-kimia dari substrat
seperti suhu dan pH larutan harus sesuai dengan kondisi optimal kerja enzim.
Beberapa enzim protease yang digunakan adalah papain, tripsin, α-kimotripsin,
pepsin, bromelin, alkalase, dan netrase (Bhat et al., 2015).
2.5 Enzim Papain
Enzim papain adalah enzim proteolitik yang dihasilkan oleh tanaman
pepaya (Cacica papaya L.) pada bagian batang, daun, dan buahnya. Enzim papain
relatif mudah didapatkan serta mempunyai daya tahan panas yang tinggi
(Winarno, 1995). Enzim ini mampu memecah protein pada makanan seperti
daging, ikan, dan susu menjadi molekul yang lebih sederhana, seperti oligopeptida
pendek atau asam amino dengan reaksi hidrolisis pada ikatan peptida sehingga
lebih mudah dicerna dan diserap oleh tubuh (Suhartono, 1989).
Papain tergolong dalam protease sistein yang ditemukan dalam getah
pepaya. Papain dapat memotong pada bagian tengah suatu rantai polipeptida
(endopeptidase) (Suhartono, 1989). Aktivitas enzim papain cukup spesifik karena
papain dapat mengkatalis proses hidrolisis protein dengan baik pada kondisi pH
serta suhu dalam kisaran waktu tertentu. Papain mempunyai pH optimum 7,2 pada
substrat BAEE (benzoil arginil etil ester); pH 6,5 pada substrat kasein; pH 7,0
15
pada albumin dan pH 0,5 pada gelatin (Muchtadi, 2010). Suhu optimal papain
sendiri adalah 50 hingga 60 °C. Papain relatif tahan terhadap suhu, dibandingkan
dengan enzim proteolitik lainnya seperti bromelin dan lisin (Winarno, 1986).
Abubakar (2004) menghidrolisis protein whey dengan enzim papain pada suhu 37
°C, pH 7,5 dan menggunakan buffer fosfat 0,02 M.
2.6 Uji Aktivitas ACE Inhibtor Secara In Vitro
Uji ACE Inhibitor adalah pengujian yang dilakukan untuk mengetahui
aktivitas inhibisi dari suatu bahan dengan cara in vivo dan in vitro. Uji ACE
Inhibitor secara in vivo dapat dilakukan dengan menggunakan hewan uji seperti
tikus, sedangkan pengujian secara in vitro dapat dilakukan dengan metode
Cushman et al., (1971). Metode uji aktivitas ACE inhibitor menggunakan hipuril-
histidil-leusin atau HHL sebagai substrat, dimana HHL ini akan dihidrolisis oleh
ACE menjadi asam hipurat (Gambar 4). Asam hipurat tersebut diukur
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 228 nm untuk
menggambarkan konsentrasi asam hipurat, bila terdapat ACE inhibitor, maka
konsentrasi asam hipurat yang terbentuk berkurang, sebaliknya apabila tidak
terdapat ACE inhibitor maka asam hipurat yang dihasilkan meningkat.
16
Gambar 4. Reaksi hidrolisis Hipuril-Histidin-Leusin (HHL) oleh ACE
(Cushman et al., 1971)
2.7 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Elektroforesis (SDS-PAGE)
Elektroforesis adalah cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran
berdasarkan pergerakan partikel koloid yang bermuatan dibawah pengaruh medan
listrik. Elektroforesis digunakan untuk analisis virus, asam nukleat, enzim, dan
protein, serta molekul-molekul organik dengan berat molekul rendah seperti asam
amino (Westermeier, 2004). Teknik elektroforesis yang umum digunakan adalah
SDS-PAGE.
Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Elektroforesis (SDS-PAGE)
adalah teknik untuk memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan
kemampuannya bergerak dengan bantuan arus listrik. Penambahan deterjen SDS
dan pemanasan merusak struktur tiga dimensi pada protein dengan terpecahnya
ikatan disulfida yang selanjutnya direduksi menjadi gugus sulfidihidril. SDS akan
membentuk kompleks dengan protein dan kompleks ini bermuatan negatif karena
gugus-gugus anionic dari SDS (Hermes, 1998).
Hipuril
Leusin Histidil
Hipuril-Histidil-Leusin
(HHL) Histidil-Leusin
Asam hipurat
17
Proses elektroforesis menggunakan gel elektroforesis dan larutan sampel
buffer yang mengandung SDS dan merkaptoetanol. SDS berfungsi untuk
mendenaturasi protein dalam bentuk protein kompleks (kuartener, tersier, dan
sekunder) menjadi bentuk yang lebih sederhana (primer atau linear) (Bintang,
2010). Merkaptoetanol berfungsi untuk memutus ikatan disulfida yang ada pada
protein. Pemanasan pada sampel dilakukan sebelum elektroforesis dengan tujuan
untuk membantu proses denaturasi protein dan akan menghasilkan molekul linier
yang akan bermigrasi berdasarkan bobot molekulnya. Faktor-faktor yang
mempengaruhi proses migrasi protein adalah konsentrasi akrilamid, voltase,
waktu, konsentrasi protein dan pemanasan bahan baku (Wijaya et al., 2001).
Gel akrilamid dalam SDS-PAGE diletakkan diantara dua plat kaca. Gel
yang digunakan terdiri dari 2 jenis, yaitu separating gel dan stacking gel.
Separating gel merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak
dibagian bawah alat. Separating gel berfungsi untuk memisahkan protein
berdasarkan berat molekulnya. Stacking gel terletak pada bagian atas, digunakan
untuk mencetak sumuran (sekat pemisah untuk penempatan sempel) (Wijaya et
al., 2001). Protein tertarik ke bagian bawah oleh arus listrik. Protein yang
memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai
bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar
akan berada pada bagian atas dari gel. Protein marker digunakan sebagai standart
untuk menentukan berat molekul dari sampel (Kusumasari, 2017).
Pita-pita protein terpisahkan berdasarkan berat molekul. Intensitas warna
pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai
berat molekul yang sama. Pergerakan molekul bermuatan memiliki prinsip yaitu
18
molekul bermuatan dapat bergerak bebas dibawah pengaruh medan listrik,
molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau
pita yang sama atau berdekatan (Sudarmadji, 1996). Penentuan berat molekul
protein yang terpisahkan dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif
protein marker dengan logaritma dari berat molekul marker yang diketahui.
Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein
dengan jarak migrasi protein marker (Kusumasari, 2017).
Analisis protein menggunakan SDS-PAGE telah dilakukan oleh Susanti
(2016) dan menghasilkan pita protein yang khas hanya dimiliki susu kambing
pada pita 150 kDa, sementara pita protein yang khas hanya dimiliki susu kedelai
pada pita 44 kDa dan 55 kDa. Profil protein susu kedelai dan tofu memiliki pita
yang khas pada18 kDa.
2.8 Membran Ultrafiltrasi
Ultrafiltrasi adalah suatu proses filtrasi menggunakan membran yang
sifatnya terletak antara hiperfiltrasi dan mikrofiltrasi. Membran ultrafiltrasi
termasuk membran berpori yang mampu menyaring partikel–partikel dengan
ukuran 0,01 – 1 mikron, dimana mampu memisahkan koloid, makro molekul,
mikroorganisme, dan pirogen (Redjeki, 2011).
Mekanisme pemisahan pada proses ultrafiltrasi adalah penyaringan
berdasarkan ukuran molekul dengan menggunakan perbedaan tekanan antar
membran sebagai gaya dorong. Aliran dari dan ke dalam membran dapat terjadi
karena adanya perbedaan tekanan pada kedua permukaan membran. Ultrafiltrasi
dioperasikan dengan tekanan 1–10 atm (Redjeki, 2011). Ukuran pori untuk
19
ultramembran berkisar antara 5-10 nm dan mampu menahan molekul dalam
rentang bobot molekul 10 kDa-1 MD (Rho et al., 2009).
Membran ultrafiltrasi diaplikasikan antara lain pada industri makanan
yaitu untuk pemekatan susu, pembuatan keju, pengambilan protein whey, dan
lain-lain (Redjeki, 2011). Chalid et al., (2018) dalam penelitiannya melakukan
fraksinasi menggunakan membran ultrafiltrasi <3 kDa pada protein susu kerbau
fermentasi dan menghasilkan aktivitas ACE inhibitor sebesar 99,300%, lebih
besar dibandingkan sebelum fraksinasi menggunakan membran ultrafiltrasi yaitu
sebesar 87,520%.
20
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta, dimulai pada bulan November 2018 hingga Juni 2019.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi alat-alat gelas, vortex,
water bath, refrigerated microcentrifuge (Peqlab), pH meter (Tolledo), alat
elektroferesis SDS-PAGE (Bio-Rad), dan spektrofotometri Uv-Vis (Lamda 25
Perkin Elmer).
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kacang kedelai yang
diperoleh dari supermarket di wilayah Bogor (tanpa klasifikasi), asam klorida,
aquades, larutan buffer fosfat (Merck), ekstrak enzim papain dengan aktivitas
125,2 TU/mg (Xian Tonking Biotech Co., Ltd), larutan Bovin Serum Albumin
(Merck), asam asetat (Merck), buffer phosphate buffered saline (Merck),
ammonium sulfat (Merck), sodium dodecyl sulfate 10%, Larutan Lowry I dan
Lowry II, Gel Acrylamide solution (12,5%T; 2,67C) (Bio-Rad), Bis-acrylamide,
Resolving Buffer (Tris-HCl 1,5M pH 8,8 Bio-Rad), Stacking Buffer (Tris-HCl
0,5M pH 6,8 Bio-Rad), N,N,N’N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)
(Sigma), Running buffer (Sigma), Staining solution silver stain (Bio-Rad), Marker
Spectra Multicolor Low Range Protein Ladder (bobot molekul 1,7-40 kDa).
21
3.3 Diagram Alir
Presipitasi dengan HCl dan disentrifugasi
Endapan Supernatan
Ditambahkan buffer fosfat 0,02 M
dan dihidrolisis menggunakan
enzim papain dengan
perbandingan 0,1; 0,2; 0,5%
selama 2, 4, 8, 16 dan 24 jam
pada suhu 37 ᵒC.
Ditambahkan buffer
fosfat 0,02 M pada
waktu 0 jam
Hidrolisat Protein
Uji derajat
hidrolisis
fraksinasi fragmen (ultramembran filtrasi)
Uji aktivitas antihipertensi dan
analisa fragmen (SDS-PAGE)
Filtrat hasil
fraksinasi Uji Aktivitas
Antihipertensi
Uji Kadar Protein
(metode Lowry)
Kedelai
Susu kedelai
Ditambahkan air (1:6), dihomogenisasi dan dipasteurisasi
Hidrolisat Protein paling aktif
Uji Kadar Protein
(metode Lowry)
Uji Proksimat
Uji Proksimat
22
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Pembuatan Susu Kedelai (Nirmagustina et al., 2013)
Kacang kedelai sebanyak 200 gram direndam selama 3 jam dengan
perbandingan kedelai : air 1:3 (b/v). Kacang kedelai yang telah direndam dicuci
menggunakan air mengalir dan kulit ari dikupas. Kedelai tanpa kulit dihancurkan
dengan menggunakan blender selama 3-5 menit dengan ditambahkan akuades
sebanyak 1:6 (1200 mL), kemudian bubur kedelai disaring dengan kain kasa lalu
direbus selama 10 menit (80-90 °C), sehingga dihasilkan susu kedelai.
3.4.2 Uji Proksimat
Uji proksimat dilakukan untuk menganalisis kadar protein, kadar air dan
kadar abu pada kacang kedelai dan susu kedelai.
Kadar Protein (AOAC, 2005)
Analisis total nitrogen terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi
dan titrasi. Tahap destruksi dilakukan dengan cara memasukkan sebanyak 0,5 g
sampel ke dalam labu Kjeldahl, ditambahkan 2 g campuran katalis selen (SeO2
+ K2SO4 + CuSO4), serta ditambahkan H2SO4 pekat 15 mL. Destruksi
dilakukan selama 2,5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan
menjadi berwarna hijau toska dan didinginkan. Sampel hasil destruksi
diencerkan dengan akuades sampai 100 mL.
Tahap destilasi dilakukan dengan memasukkan 25 mL sampel hasil
destruksi ditambahkan 25 mL larutan NaOH 30% dan 3 tetes indikator
Fenolftalein. Kondensor diletakkan dibawah erlenmeyer 250 mL yang berisi 25
23
mL larutan asam borat dan 3 tetes indikator conway. Destilasi dilakukan hingga
terjadi perubahan warna destilat menjadi hijau toska.
Tahap titrasi dilakukan dengan cara larutan hasil destilasi dititrasi
dengan larutan HCl 0,05 N yang sebelumnya telah distandarisasi dengan
menggunakan larutan boraks 0,05 N. Titrasi dilakukan sampai terjadi
perubahan warna dari hijau toska sampai warna merah seulas, selanjutnya
diukur volume HCl yang terpakai untuk titrasi.
Dimana:
Faktor Konversi (FK) = 5,75
Kadar Air (AOAC, 2005)
Pengukuran kadar air dilakukan dengan metode gravimetri. Cawan
kosong dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC selama 15 menit,
didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Sebanyak 2 g sampel
ditimbang dalam cawan. Cawan berisi sampel dikeringkan dalam oven dengan
suhu 105 oC selama 6 jam. Sampel yang telah dikeringkan kemudian
didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar air dihitung dengan rumus:
Kadar air (%) =
Dimana:
A= Bobot sampel awal (g)
B= Bobot sampel akhir (g)
Kadar Abu (AOAC, 2005)
Analisis kadar abu dilakukan dengan metode gravimetri. Sampel
ditimbang sebanyak 2 g (B) dan dimasukkan ke dalam cawan porselin yang telah
24
diketahui bobotnya (A). Sampel diarangkan hingga tidak berasap, kemudian
dimasukkan ke dalam tanur bersuhu 500-600 oC sampai menjadi abu berwarna
putih selama 3 jam. Cawan yang berisi abu didinginkan dalam desikator dan
dilakukan penimbangan hingga diperoleh bobot tetap (C). Kadar abu ditentukan
dengan rumus:
Kadar abu (%) =
Dimana:
A= Bobot cawan+ abu (g)
B= Bobot cawan kosong (g)
C= Bobot sampel awal (g)
3.4.3 Pemisahan Protein dengan Presipitasi HCl (Smith & Circle, 1972)
Susu kedelai sebanyak 100 mL ditambahkan dengan NaOH IN hingga
mencapai pH 8,5, kemudian diaduk dengan magnetic stirrer selama 1 jam pada
suhu ruang, setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 6000-7000 rpm selama 20
menit pada suhu dingin. Supernatan dikumpulkan dan ditambahkan HCl sampai
pH mencapai ±4,5. Suspensi disentrifugasi pada 6000-7000 rpm selama 20 menit
pada suhu dingin. Supernatan dibuang dan presipitat disimpan dalam freezer.
3.4.4 Pengukuran Kadar Protein (Lowry et al., 1951)
Presipitat protein sebanyak 0,5 g dilarutkan dalam 10 mL buffer fosfat
0,02 M (Lampiran 15) kemudian ditentukan kadar protein dengan metode Lowry.
1 mL sampel dicampurkan dengan 5 mL larutan C (Lampiran 13). Campuran
reaksi dihomogenkan dengan vortex dan didiamkan selama 10 menit. Larutan D
(reagen Folin ciocalteu 1 N) sebanyak 0,25 mL ditambahkan ke dalam campuran
reaksi, dihomogenkan dengan vortex dan didiamkan selama 30 menit. Campuran
25
reaksi diukur pada 750 nm dan konsentrasi protein ditentukan dengan kurva
standar bovine serum albumin (BSA) (Lampiran 14).
3.4.5 Hidrolisis Protein (Abubakar, 2004)
Erlenmeyer sebanyak 3 buah (A, B, dan C) disiapkan, kemudian masing-
masing diisi dengan presipitat protein yang telah dilarutkan dalam 500 mL larutan
buffer fosfat (Lampiran 15). Erlenmeyer A ditambahkan enzim papain dengan
konsentrasi 0,1% (b/v). Elenmeyer B ditambahkan enzim papain dengan
konsentrasi 0,2% (b/v). Erlenmeyer C ditambahkan enzim papain dengan
konsentrasi 0,5% (b/v) (Lampiran 16). Ketiga erlenmeyer yang telah terisi substrat
dan enzim diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 37 ºC.
Selama proses inkubasi, sebanyak 100 mL hidrolisat pada setiap
erlenmeyer diambil pada interval 2, 4, 8, 16, dan 24 jam, kemudian masing-
masing hidrolisat dipanaskan pada suhu 90 °C selama 20 menit untuk inaktivasi
enzim. Hidrolisat yang telah didapatkan diukur nilai derajat hidrolisisnya dengan
menggunakan metode Hoyle et al., (1994).
3.4.6 Analisis Derajat Hidrolisis (DH) (Hoyle et al., 1994)
Derajat hidrolisis dianalisis dengan metode Soluble Nitrogen
Trichloroacetic Acid (SN-TCA) (Hoyle et al., 1994). Sebanyak 10 mL hidrolisat
protein ditambahkan TCA 10% (b/v) (Lampiran 16) sebanyak 10 mL. Campuran
didiamkan selama 30 menit agar terjadi pengendapan, kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 6000-7000 rpm selama 15 menit. Supernatan dianalisis kadar
proteinnya dengan menggunakan metode Lowry, sedangkan endapannya dibuang.
Derajat hidrolisis dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
26
3.4.7 Uji ACE Inhibitor (Cushman et al., 1971)
Uji ini berdasarkan pembebasan asam hipurat dari substrat Hip-His-Leu
yang dikatalisis oleh ACE. Larutan sampel hidrolisat protein susu kedelai
sebanyak 15 µL dicampur dengan 125 µL buffer Na-borat 100 Mm (pH 8.3) yang
mengandung 7.6 mM Hip-His-Leu dan 608 mM NaCl (Lampiran 12), kemudian
dipreinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 °C. Reaksi dimulai dengan
penambahan 50 µL enzim ACE yang dilarutkan dalam air destilat. Campuran
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. Air destilat sebanyak 50 µL
digunakan sebagai blanko.
Reaksi dihentikan dengan penambahan 125 µL HCl 1N. Asam hipurat
yang dilepaskan oleh ACE diekstrak dengan menambahkan 750 µL etil asetat ke
dalam campuran dan segera divorteks. Campuran disentrifugasi pada kecepatan
12000 rpm selama 10 menit, kemudian sebanyak 500 µL lapisan atas dari
supernatan dikumpulkan dan dikeringkan pada suhu 90 °C selama 30 menit
(untuk blanko dan kontrol dilakukan perlakuan yang sama). Asam hipurat
dilarutkan dalam 1 mL air destilat dan diukur besarnya absorbansi dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 228 nm.
Aktivitas ACE inhibitor dihitung menurut persamaan berikut :
% Aktivitas penghambatan = [(C-A) / (C-B)] x 100 %
Dimana :
A= absorbansi sampel,
B= absorbansi blanko,
C= absorbansi kontrol (sampel diganti dengan air destilasi).
27
3.4.8 Fraksinasi dengan Ultramembran Filtrasi (Ranamukhaarachchi, 2012)
Pemisahan protein dilakukan dengan metode ultrafiltrasi. Hidrolisat dengan
aktivitas ACE inhibitor tertinggi dipisahkan proteinnya dengan menggunakan
membran ultrafiltrasi protein (MWCO < 3kDa). Hidrolisat sebanyak 500 μL
diinjeksikan ke dalam membran ultrafiltrasi, kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C. Hasil fraksinasi diuji
kembali aktivitas ACE inhibitor dengan metode Cushman et al., (1971). Fraksi
hasil filtrasi yang telah diketahui aktivitas ACE inhibitor-nya kemudian dianalisis
dengan SDS-PAGE.
3.4.9 Analisis Fraksi Protein Hidrolisat dengan SDS-PAGE (Laemmli, 1970)
Hidrolisat susu kedelai dianalisis profil proteinnya dengan elektroforesis
menggunakan gel akrilamida. Gel terdiri atas dua bagian, yaitu stacking gel dan
separating gel. Konsentrasi akrilamida yang digunakan pada stacking gel adalah
5% dan separating gel 12,5%. Tahapan yang dilakukan adalah sebagai berikut:
Separating gel
Sebanyak 4,8 mL larutan A (Lampiran 11) dipipet ke dalam gelas piala,
kemudian ditambakan 3 mL larutan B (Lampiran 11) dan 4,2 mL akuades.
Campuran kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala.
Selanjutnya, sebanyak 60 µL APS 10% (Lampiran 11) dan 4 µL TEMED
ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran
dimasukkan ke dalam lempengan kaca (mini slab) tanpa menimbulkan gelembung
udara dengan menggunakan mikro pipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan.
Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk.
Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 60-120 menit.
28
Stacking gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan
tissue. Akuades, larutan A (Lampiran 11) dan larutan C (Lampiran 11) masing-
masing sebanyak 2,3 mL; 0.67 ml dan 1.0 ml dicampurkan ke dalam gelas piala
dan diaduk perlahan dengan cara menggoyangkan gelas piala. APS 10%
(Lampiran 11) sebanyak 30 µl dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran
dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab,
kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara.
Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Sisir diangkat
dari atas gel dengan perlahan setelah gel berpolimerisasi dan slab ditempatkan ke
dalam wadah elektroforesis. Buffer elektroforesis (Lampiran 11) dimasukkan ke
dalam wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam.
Preparasi dan injeksi sampel
Sebanyak 40 µl ekstrak protein sampel dimasukkan ke dalam microtube
dan ditambahkan 40 µl buffer sampel (Lampiran 11). Larutan dipanaskan selama
5 menit dalam air mendidih 100 °C. Sampel kemudian diinjeksikan ke dalam
sumur menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl. Protein marker diinjeksikan pada
salah satu sumur sebanyak 5 µl sebagai standar.
Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik
dinyalakan dan dijaga konstan pada 60 V. Running dilakukan selama 180 menit
sampai migrasi tersisa sekitar 0,5 cm dari dasar. Aliran listrik dimatikan dan katup
elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.
29
Staining gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang
telah berisi pewarna silver stain (Lampiran 11) sebanyak 20 ml, kemudian
didiamkan selama 10 menit.
Destaining gel
Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades sebanyak 3 kali masing-
masing selama 5 menit. Larutan destaining solution (Lampiran 11) ditambahkan
dan digoyangkan sekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Larutan
penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
Penentuan berat molekul protein
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara
mobilitas relatif protein marker (penanda protein) dengan logaritma dari berat
molekul marker yang diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan
membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel
sampai ujung pita protein yang dibandingkan dengan jarak migrasi pewarna.
Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai persamaan berikut :
Rf =
30
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Susu Kedelai
Susu kedelai yang diperoleh pada penelitian ini berwarna putih
kekuningan (Gambar 5), memiliki aroma sedikit langu seperti susu kedelai pada
umumnya, dan memiliki pH sebesar 6,9 (Tabel 4). Nilai pH merupakan salah satu
indikasi ada atau tidaknya aktivitas mikroorganisme maupun enzim pada bahan
pangan (Picauly et al., 2015). Syarat mutu pH susu kedelai berdasarkan SNI
(1995) yaitu kisaran 6,5 – 7,0, sehingga susu kedelai pada penelitian ini
memenuhi syarat mutu SNI.
Susu kedelai dibuat dengan menambahkan air untuk mempermudah proses
penggilingan, setelah itu dilakukan pemanasan untuk menghilangkan bau langu
(Picauly et al., 2015). Perbandingan penambahan air pada penelitian ini yaitu 1:6
(b/v) mengacu pada Nirmagustina et al., (2014), sehingga dari 200 g kacang
kedelai didapatkan ±1200 mL susu kedelai.
Gambar 5. Susu kedelai
Susu kedelai baik dikonsumsi karena memiliki banyak nutrisi, yaitu
protein, karbohidrat, lemak, fosfor, kalsium, dan magnesium (Winarsi, 2010),
31
sehingga pada penelitian ini dilakukan pengujian terhadap karakteristik kimia dan
fisika susu kedelai dan kacang kedelai.
Tabel 4. Hasil analisis proksimat kacang kedelai dan susu kedelai
Karakter-
istik Parameter Kacang kedelai Susu kedelai
SNI (1995)
Kedelai Susu
kedelai
Kimia
Kadar air (%) 4,530±0,004 92,951±1,968 Max.16 -
Kadar abu (%) 7,540±0,311 0,257±0,001 - -
Kadar protein (%) 35,286±0,059 5,667±1,593 - Min. 2
pH - 6,9 - 6,5-7,0
Fisika Warna Kuning
Putih
kekuningan Normal Normal
Aroma Normal Normal Normal Normal
Kadar Air
Kacang kedelai pada penelitian ini memiliki kadar air yang rendah yaitu
sebesar 4,530±0,004%. Kadar air yang didapat tersebut sesuai dengan SNI 01-
3922-1995 tentang syarat mutu kacang kedelai yaitu kadar air maksimal 16%.
Dewayani et al., (2016) melakukan pengujian kadar air dari kacang kedelai dan
memperoleh nilai sebesar 10,680%. Kadar air dari kacang kedelai ini memiliki
nilai yang lebih rendah jika dibandingkan dengan penelitian Dewayani et al.,
(2016), diperkirakan karena kacang kedelai yang digunakan sangat keras, namun
SNI (1995) tidak membatasi kadar air pada kacang kedelai.
Kadar air pada susu kedelai lebih tinggi daripada kadar air pada kacang
kedelai, karena pada proses pembuatan susu kedelai terjadi penambahan air pada
saat perendaman dan penggilingan. Kadar air pada susu kedelai didapatkan nilai
sebesar 92,951±1,968%. Shakeel et al., (2015) mendapatkan kadar air susu
kedelai sebesar 99,650%. Kadar air susu kedelai pada penelitian ini berbeda
dengan penelitian Shakeel (2015), diperkirakan karena jumlah penambahan air
32
yang berbeda pada saat pembuatan susu kedelai dan lamanya waktu pemanasan
yang menyebabkan banyaknya air yang menguap.
Kadar Abu
Kadar abu merupakan campuran dari komponen anorganik atau mineral
yang terdapat pada suatu bahan pangan. Bahan-bahan organik dalam proses
pembakaran akan terbakar tetapi komponen anorganiknya tidak, karena itulah
disebut sebagai kadar abu (Sudarmadji, 1996). Kacang kedelai pada penelitian ini
memiliki kadar abu sebesar 7,540±0,311%. Dewayani et al., (2016) melaporkan
kadar abu kacang kedelai sebesar 8,860%. Kadar abu kacang kedelai pada
penelitian ini memiliki nilai yang lebih rendah jika dibandingkan dengan
penelitian Dewayani (2016), namun SNI (1995) tidak membatasi kadar abu untuk
kacang kedelai. Kadar abu yang terdapat pada kacang kedelai dapat diartikan
bahwa kacang kedelai tersebut mengandung komponen anorganik atau mineral
(Winarsi, 2010).
Kadar abu susu kedelai pada penelitian ini didapatkan sebesar
0,257±0,001%., sedangkan kadar abu susu kedelai yang didapatkan Nirmagustina
et al., (2013) sebesar 2,880%. Kadar abu susu kedelai pada penelitian ini lebih
rendah jika dibandingkan dengan kadar abu kacang kedelai, diperkirakan karena
pada proses pembuatan susu kedelai dilakukan pengelupasan kulit ari kacang
kedelai sehingga mengakibatkan sejumlah mineral yang terdapat pada kulit
kacang kedelai terbuang. Rohmawati (2015) menyatakan bahwa kulit ari kedelai
memiliki kandungan mineral sebesar 3,15%.
33
Kadar Protein
Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang
merupakan polimer dari monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain
dengan ikatan peptida. Analisa protein menghasilkan unsur-unsur C, H, N, O dan
beberapa protein juga mengandung unsur-unsur lain, terutama P, Fe, Zi dan Cu
(Katili, 2009). Analisa kadar protein pada penelitian ini menggunakan metode
kjedahl untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak
langsung, karena yang dianalisis adalah kadar nitrogennya. Kadar protein
diperoleh dengan mengonversikan hasil analisis tersebut dengan faktor konversi
bahan makanan yaitu sebesar 5,75 untuk kedelai (Munthe et al., 2007).
Kadar protein kacang kedelai yang digunakan pada penelitian ini
didapatkan sebesar 35,286±0,059%. Kadar Protein pada penelitian ini sesuai
dengan pernyataan Purnomo (2007) yaitu kadar protein pada kacang kedelai
sebesar 35%. Kandungan protein pada kacang kedelai tinggi, karena kacang
kedelai merupakan sumber protein yang sangat baik.
Kadar protein susu kedelai pada penelitian ini didapatkan sebesar
5,667±1,593%, sedangkan kadar protein susu kedelai yang didapatkan
Nirmagustina et al., (2013) sebesar 2,040%. Kadar protein susu kedelai pada
penelitian ini berbeda dengan Nirmagustina (2013), diperkirakan karena
perbedaan jenis kacang kedelai yang digunakan. Penelitian ini menggunakan
kacang kedelai kuning, sedangkan penelitian Nirmagustina (2013) menggunakan
kacang kedelai edamame. Kadar protein susu kedelai pada penelitian ini
memenuhi standar SNI 01-3990-1995 yang menetapkan kadar protein susu
kedelai minimal 2%.
34
4.2 Isolat Protein Susu Kedelai
Protein yang terdapat pada susu kedelai dipisahkan dari komponen lain
dengan menggunakan pelarut asam klorida (HCl) untuk mengendapkan protein
pada titik isoelektrik. Titik isoelektrik adalah kondisi saat asam amino tidak
memiliki muatan. Jumlah muatan positif dan negatif asam amino sama pada saat
titik isoelektrik tercapai (Naga, 2010). Presipitasi susu kedelai pada penelitian ini
menghasilkan yield isolat protein sebesar 40,060%.
Isolat protein yang telah didapatkan kemudian diuji kadar proteinnya
dengan menggunakan metode Lowry, dan didapatkan kadar protein sebesar
1163,571 mg/L (Lampiran 4). Presipitat protein pada penelitian ini dihidrolisis
untuk menghasilkan peptida yang memiliki aktivitas ACE inhibitor yang tinggi.
Hamid et al., (2016) menghasilkan IC50 sebesar 9 mg/L dari hidrolisat susu kerbau
yang dihidrolisis menggunakan papain 0,005% dengan aktivitas enzim >10 U/mg.
Penggunaan enzim papain pada penelitian ini dikarenakan enzim papain mudah
didapat, relatif tahan terhadap suhu, dan memiliki aktivitas enzim yang spesifik
yaitu termasuk protease sistein golongan endoprotease yang dapat memutus ikatan
peptida pada rantai protein sehingga dihasilkan peptida dan polipeptida (Winarno,
1986).
4.3 Derajat Hidrolisis Susu Kedelai
Derajat Hidrolisis (DH) merupakan persentase yang menyatakan tingkat
pemotongan peptida dalam hidrolisis protein, baik oleh asam, basa ataupun enzim
protease (Baehaki et al., 2015). Penentuan derajat hidrolisis pada penelitian ini
dilakukan dengan menggunakan metode Soluble Nitrogen Trichloroacetic Acid
(SN-TCA). Menurut Rutherfurd (2010), prinsip pengukuran derajat hidrolisis
35
dengan metode SN-TCA adalah pengukuran kadar peptida dan asam amino hasil
hidrolisis yang terlarut dalam larutan Trichloroacetic Acid (TCA), setelah
komponen yang tidak terlarut mengalami pengendapan akibat proses sentrifugasi.
Gambar 6. Nilai derajat hidrolisis susu kedelai
Konsentrasi enzim dan waktu hidrolisis mempengaruhi nilai derajat
hidrolisis. Derajat hidrolisis pada penelitian ini mengalami peningkatan dari 2 jam
hingga 8 jam, setelah itu derajat hidrolisis mengalami penurunan (Gambar 6).
Derajat hidrolisis yang semakin menurun dapat disebabkan oleh adanya
penghambatan proses hidrolisis substrat oleh produk yang dihasilkan selama
proses hidrolisis (Ovissipour et al., 2010)
Nilai derajat hidrolisis pada penelitian ini meningkat dari konsentrasi
enzim 0,1 sampai 0,2%, sedangkan pada konsentrasi 0,5% derajat hidrolisis
mengalami penurunan (Gambar 6). Penurunan derajat hidrolisis tersebut
diperkirakan karena jumlah enzim yang digunakan terlalu tinggi. Poedjiadi et al.,
(2006) menyatakan bahwa penggunaan enzim berlebih menyebabkan tidak semua
enzim berikatan dengan substrat, sehingga kecepatan maksimal tidak dapat
7,295 8,028
8,832
6,714
4,565
10,022 10,284 11,001
10,213
8,637 7,873 8,040
8,757
6,942 6,393
0
2
4
6
8
10
12
2 4 8 16 24
0,10%0,20%0,50%
Waktu Hidrolisis (jam)
Konsentrasi papain:
Der
ajat
Hid
rolis
is (
%)
36
dicapai. Eisenthal et al., (2002) menyatakan bahwa semakin sedikitnya substrat
yang dapat diikat oleh enzim maka dapat mengurangi kecepatan reaksi.
Derajat hidrolisis tertinggi didapatkan pada hidrolisat dengan konsentrasi
papain 0,2% dan waktu hidrolisis 8 jam, yaitu sebesar 11,001%. Meinlschmidt et
al., (2015) menghasilkan derajat hidrolisis sebesar 4,600% pada hidrolisat susu
kedelai yang dihidrolisis selama 2 jam dengan konsentrasi papain 0,2%. Nilai
derajat hidrolisis pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan derajat
hidrolisis Meinlschmidt et al., (2015), diperkirakan karena kerja enzim lebih
optimal pada waktu hidrolisis 8 jam. Kumar et al., (2016) menghasilkan derajat
hidrolisis sebesar 16% pada hidrolisat susu unta yang dihidrolisis menggunakan
enzim papain dengan konsentrasi 1% selama 6 jam dan pada suhu 55 °C.
Nilai derajat hidrolisis yang berbeda dapat disebabkan karena spesifikasi
enzim yang digunakan terdapat perbedaan, penelitian ini menggunakan papain
dengan aktivitas 125,2 Tyrosine Unit/mg (Lampiran 17), sedangkan Meinlschmidt
et al., (2015) dan Kumar et al., (2016) menggunakan papain dengan aktivitas >10
Unit/mg. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang
dibutuhkan untuk melepaskan 1 μmol tirosin pada substrat kasein per menit
(Yuniati et al., 2015). Perbedaan nilai derajat hidrolisis juga dapat disebabkan
oleh konsentrasi enzim, waktu hidrolisis, dan perbedaan peptida dan asam amino
akibat pemutusan ikatan peptida selama hidrolisis yang terlarut dalam TCA
(Hasnaliza et al., 2010). Kondisi optimum papain dalam menghidrolisis protein
pada penelitian ini terdapat pada konsentrasi papain 0,2%, suhu 37 °C, dan waktu
hidrolisis 8 jam.
37
Gambar 7. Mekanisme Kerja Enzim Papain
(Fersht, 1985)
Mekanisme kerja enzim papain ditampilkan pada Gambar 7, yaitu selama
proses katalisis hidrolisis gugus-gugus amida, mula-mula gugus sistein yang
bersifat sangat reaktif berikatan dengan substrat pada sisi aktif papain sehingga
dihasilkan ikatan kovalen substrat dengan enzim yang berbentuk tetrahedral.
Gugus histidin kemudian terprotonasi sehingga berikatan dengan nitrogen yang
terdapat di dalam substrat. Gugus amin pada substrat kemudian terdifusi dan
kedudukannya digantikan oleh molekul-molekul air yang pada akhirnya
menghidrolisis hasil intermediet sehingga mengembalikan enzim ke dalam bentuk
dan fungsinya seperti semula (Beveridge, 1996).
4.4 Aktivitas ACE Inhibitor dan Inhibition Concentration (IC50)
ACE inhibitor adalah senyawa atau zat aktif yang dapat menurunkan
tekanan darah tinggi dalam tubuh (Febrisiantosa et al., 2013). Nilai aktivitas ACE
38
inhibitor berdasarkan Gambar 8 mengalami perubahan seiring berjalannya waktu
hidrolisis dan perbedaan konsentrasi enzim yang ditambahkan.
Gambar 8. Aktivitas ACE Inhibitor hidrolisat susu kedelai
Aktivitas ACE inhibitor meningkat seiring dengan semakin lama waktu
hidrolisis, namun kemudian mengalami penurunan setelah hidrolisis 8 dan 16 jam
(Gambar 8). Penurunan yang terjadi seiring dengan berjalannya waktu hidrolisis
diduga karena terjadinya kerusakan urutan peptida ACE inhibitor yang terbentuk
selama proses hidrolisis sehingga peptida mengalami penurunan aktivitas
(Khirzin, 2015).
Aktivitas ACE inhibitor tertinggi pada penelitian ini terdapat pada
hidrolisat dengan konsentrasi enzim 0,2% dan waktu hidrolisis 8 jam yaitu sebesar
59,211%, dan terkecil pada hidrolisat 0,5% 2 jam yaitu 16,300%. Hidrolisat susu
kedelai dapat menghambat ACE karena memiliki peptida bioaktif yang bersifat
ACE inhibitor. Peptida bioaktif biasanya mengandung 3–20 asam amino dengan
berat molekul yang rendah. Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini
89,868
21,145
30,617 32,895 34,211 39,474
18,421 17,105
40,789
59,211
35,526
50
16,3 18,943 19,737
51,316
17,105
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2 4 8 16 24
Konsentrasi papain:
KaptoprilKontrol0,10%0,20%0,50%
Waktu Hidrolisis (jam)
Akt
ivit
as A
CE
inh
ibit
or
(%)
39
adalah kaptopril. Kaptopril dengan konsentrasi yang sama dengan hidrolisat
terbaik pada penelitian ini (0,2% 8 jam) yaitu 578,750 mg/L (Tabel 5), memiliki
aktivitas ACE inhibitor sebesar 89,868%. Hidrolisat susu kedelai jika
dibandingkan dengan kaptopril memiliki aktivitas ACE inhibitor yang lebih
rendah, dikarenakan sampel hidrolisat masih dalam bentuk peptida kasar (crude).
Shimakage et al., (2012) berhasil mengidentifikasi peptida ACE inhibitor
yang mengandung Phe-Phe-Tyr-Tyr dan Trp-His-Pro dari susu kedelai yang
dihidrolisis menggunakan protease bacterial 0,1% selama 16 jam pada suhu 50
°C dihasilkan aktivitas ACE inhibitor 36 kali lebih tinggi dibandingkan dengan
susu kedelai tanpa hidrolisis. Febrisiantosa et al., (2013) menghasilkan aktivitas
ACE inhibitor sebesar 73,070% pada kefir berbahan baku whey keju gouda yang
diinkubasi pada suhu 28 ºC selama 20 jam. Wulandani et al., (2017) menghasilkan
aktivitas ACE inhibitor sebesar 53,470% pada plain yogurt dari susu sapi yang
difermentasi dengan starter Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus
bulgaricus pada suhu 43 °C .
Nilai IC50 pada penelitian ini ditentukan dari hidrolisat yang memiliki
aktivitas ACE inhibitor tertinggi yaitu hidrolisat 0,2% selama 8 jam, dan
didapatkan nilai IC50 sebesar 89,640 mg/L (Lampiran 7). Penelitian yang
dilakukan oleh Shimakage et al., (2012) menghasilkan IC50 sebesar 0,88 mg/L
untuk asam amino Trp-Asn-Pro-Arg. Vallabha et al., (2013) menghasilkan IC50
sebesar 17,2 mg/L untuk asam amino Leu-Ile-Val-Thr-Gln yang berasal dari
hidrolisat susu kedelai hasil fermentasi menggunakan Lactobacillus casei spp.
Pseudoplantarum. Nilai IC50 hidrolisat susu kedelai yang dihasilkan penelitian ini
lebih besar jika dibandingkan dengan IC50 yang diperoleh Shimakage et al.,
40
(2012) dan Vallabha et al., (2013), diperkirakan karena pada penelitian ini sampel
masih berupa campuran fragmen peptida dengan bobot molekul yang lebih besar.
Semakin besar nilai IC50 maka semakin kecil tingkat efisiensi penghambatannya
terhadap ACE (Febrisiantosa, 2013).
4.5 Fraksinasi Protein Hidrolisat
Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukurannya dengan menggunakan
membran filtrasi. Pemisahan protein pada penelitian ini dilakukan untuk
mendapatkan peptida dengan bobot molekul <3 kDa yang diharapkan memiliki
aktivitas ACE inhibitor yang lebih tinggi. Campos et al., (2013) menghasilkan
aktivitas ACE inhibitor protein Chia yang lebih besar yaitu 64,5%, dibandingkan
sebelum fraksinasi yaitu sebesar 58,5% dengan menggunakan membran
ultrafiltrasi <3 kDa.
Tabel 5. Kadar protein dan aktivitas ACE inhibitor hasil fraksinasi
Sampel Kadar Protein (mg/L) Aktivitas ACE inhibitor
(%)
Hidrolisat 0,2% 8 jam 578,750±0,007 59,211±0,003
Filtrat 181,250±0,001 2,203±0,004
Retentat 451,875±0,001 20,264±0,003
Filtrat adalah hasil pemisahan yang tersaring yang diduga berupa protein
dengan ukuran <3 kDa, sedangkan yang tidak tersaring disebut dengan retentat.
Filtrat hasil fraksinasi memiliki kadar protein sebesar 181,250±0,001 mg/L, hasil
tersebut lebih kecil dari kadar protein hidrolisat sebelum dilakukan fraksinasi
yaitu 578,750±0,007 mg/L (Tabel 5). Aktivitas ACE inhibitor juga mengalami
penurunan setelah dilakukan fraksinasi. Hasil pengujian didapatkan bahwa
aktivitas ACE inhibitor mengalami penurunan sebanyak 57,008%, sehingga
41
aktivitas ACE inhibitor menjadi 2,203±0,004%, sedangkan sampel retentat
memiliki aktivitas inhibitor yang lebih besar yaitu 20,264±0,003% (Tabel 5).
Penurunan kadar protein dan aktivitas ACE inhibitor pada penelitian ini
tidak sejalan dengan penelitian Chalid et al., (2018) yang menghasilkan aktivitas
ACE inhibitor protein susu kerbau fermentasi yang lebih besar yaitu 99,300%,
dibandingkan sebelum fraksinasi yaitu sebesar 87,520% dengan menggunakan
membran ultrafiltrasi <3 kDa. Penurunan kadar protein dan aktivitas ACE
inhibitor pada penelitian ini diperkirakan karena ultrafiltrasi memiliki kelemahan,
yaitu adanya potensi hilangnya protein akibat penyerapan protein ke lapisan
membran atau ke dalam pori-pori membran ultrafiltrasi, hal tersebut berakibat
pada terbentuknya lapisan protein di permukaan membran dan akhirnya terjadi
polarisasi atau penyumbatan pada membran (Janson, 2011). Mulder (1996)
menyatakan bahwa ultrafiltrasi memiliki kelemahan yaitu molekul dengan berat
molekul yang lebih tinggi akan tertahan seluruhnya dan menimbulkan lapisan
dinamis seperti membran yang dapat menahan partikel padatan dengan berat
molekul rendah.
4.6 Karakteristik Protein hidrolisat Susu Kedelai
Jumlah pita yang terdeksi pada protein susu kedelai dan hidrolisatnya
dihitung dengan cara menghitung jarak migrasi protein. Nilai kuantitatif Rf
(perbandingan jarak tempuh sampel dengan marker), jarak pita, dan berat molekul
setiap pita pada protein marker dan isolat protein susu kedelai serta hidrolisatnya
terdapat pada Lampiran 9.
42
Gambar 9. Profil protein hasil SDS-PAGE
(Protein marker (M), isolat protein susu kedelai (0), hidrolisat susu kedelai 0,2% 2
jam, 4 jam, 8 jam, 16 jam, 24 jam, filtrat (F), dan retentat (R))
Isolat protein susu kedelai (kontrol 0 jam) memiliki pita pada bobot
molekul yang lebih rendah dibandingkan dengan hidrolisat susu kedelai (Gambar
10). Filtrat (F) hasil fraksinasi tidak terdeteksi pita protein, sedangkan retentat (R)
terdeteksi 1 pita protein.
Tabel 6. Berat molekul profil protein susu kedelai dan hidrolisat susu kedelai
Pita
ke-
Protein Marker Kontrol
(0 jam)
Hidrolisat
0,2%
2-16 jam
Hidrolisat
0,2%
24 jam
Filtrat Retentat
Rf BM Rf BM Rf BM Rf BM Rf Bm Rf BM
1 0,233 40,000 0,070 68,225 0,068 68,512 0,000 0,000 0,000 0,000 0,068 68,512
2 0,384 25,000 0,303 33,400 0,110 60,399 0,110 60,399
3 0,589 15,000 0,452 21,128 0,164 51,055 0,164 51,055
4 0,740 10,000 0,658 11,250 0,205 45,009 0,205 45,009
5 0,890 4,800 0,740 8,743 0,233 41,382 0,000 0,000
6 0,274 36,481 0,274 36,481
7 0,301 33,541 0,301 33,541
8 0,356 28,352 0,356 28,352
9 0,397 24,995 0,397 24,995
10 0,507 17,860
11 0,589 13,880
43
Profil protein isolat susu kedelai tanpa hidrolisis menghasilkan 5 pita
dengan berat molekul terendah sebesar 8,743 kDa, dan tertinggi sebesar 68,225
kDa (Tabel 6). Penelitian yang dilakukan oleh Amnuaycheewa et al., (2010)
melaporkan 3 subunit asam amino pada isolat protein susu kedelai yaitu β-
conglycinin α’ (~67–72 kDa), α (~63 kDa), dan β (~47 kDa), serta Glycinin yang
terdiri dari 2 subunit, dimana subunit yang bersifat asam yaitu “A” (~29–33 kDa)
dan yang bersifat basa yaitu (“B”) pada 22 kDa.
Hidrolisat protein susu kedelai setelah hidrolisis mengalami pemutusan,
sehingga jumlah pita protein bertambah. Hidrolisat susu kedelai hasil hidrolisis
dengan enzim papain 0,2% selama 2-16 jam menghasilkan jumlah pita protein
sebanyak 11 pita pada berat molekul 13,880-68,512 kDa, sedangkan pada
hidrolisat 24 jam jumlah pita menurun menjadi 7 pita, yaitu pada berat molekul
24,995-60,399 kDa (Tabel 6). Waktu hidrolisis yang semakin lama menyebabkan
pita protein semakin pudar, seperti yang terlihat pada waktu hidrolisis 24 jam, hal
ini menunjukkan bahwa telah terjadi hidrolisis protein (Matra et al., 2018).
Isolat susu kedelai tanpa hidrolisis (kontrol) menghasilkan pita protein
terendah pada bobot molekul 8,743 kDa, sedangkan susu kedelai hasil hidrolisis
dengan enzim papain 0,2% menghasilkan pita protein terendah pada bobot
molekul 13,880 kDa (Tabel 6). Perbedaan bobot molekul tersebut diperkirakan
karena konsentrasi gel pemisah yang digunakan kurang tinggi, semakin rendah
bobot molekul yang dipisahkan, maka konsentrasi akrilamida yang digunakan
harus semakin tinggi agar kisi-kisi yang terbentuk semakin rapat (Kusumasari,
2017). Semakin tinggi konsentrasi akrilamid maka diameter pori-pori di dalam gel
akan semakin kecil, sebaliknya jika konsentrasi akrilamid rendah maka diameter
44
pori-pori di dalam gel akan semakin besar. Apabila protein berukuran kecil atau
memiliki berat molekul yang kecil, maka memerlukan gel dengan konsentrasi
akrilamid yang besar, dengan demikian ukuran pori di dalam gel akan kecil
(Wibowo, 2010).
Filtrat hasil fraksinasi tidak terdeteksi pita protein, diperkirakan karena
bobot molekul sampel sangat kecil yaitu kurang dari 3 kDa sehingga dibutuhkan
gel dengan konsentrasi yang lebih tinggi, sedangkan pada retentat hasil fraksinasi
hanya terdeteksi 1 pita dengan bobot molekul tinggi yaitu 68,512 kDa (Tabel 6).
Penelitian yang dilakukan oleh Kusumasari (2017) menggunakan gel pemisah
dengan konsentrasi 20% dan protein marker dengan bobot molekul 4,6 kDa untuk
mengetahui pita-pita protein dari sampel hidrolisat susu kedelai yang dihidrolisis
dengan enzim papain 6%.
Kusumasari (2017) melaporkan hasil hidrolisis menggunakan papain 6%
pada susu kedelai komersial menghasilkan 9 pita protein dengan berat molekul
antara 18,400 kDa-105,800 kDa. Palupi et al., (2015) melaporkan hasil
elektroforesis SDS-PAGE isolat kacang kedelai kuning menghasilkan 8 pita
protein dengan berat molekul antara 9,600 kDa-114,700 kDa. Astuti (2012)
mendapatkan 7 pita protein pada kacang kedelai pasar dengan berat molekul
antara 20 kDa-83,700 kDa.
45
BAB V
PENUTUP
5.1 Simpulan
1. Kacang kedelai dan susu kedelai pada penelitian ini memiliki karakteristik
kimia dan fisika sesuai dengan SNI, diantaranya yaitu kadar protein susu
kedelai sebesar 5,667% sesuai dengan syarat mutu SNI yaitu minimal 2%
dengan aroma sedikit langu dan berwarna putih kekuningan.
2. Kondisi optimum hidrolisis susu kedelai terdapat pada hidrolisat dengan
penambahan papain 0,2% (b/v) dan waktu hidrolisis selama 8 jam
menghasilkan derajat hidrolisis tertinggi sebesar 11,001% dan aktivitas ACE
inhibitor tertinggi sebesar 59,211% dengan IC50 sebesar 89,640 mg/L.
3. Hidrolisat susu kedelai setelah fraksinasi mengalami penurunan aktivitas
ACE inhibitor dari 59,211% menjadi 2,203%, dan profil protein tidak
menunjukkan pita protein.
4. Hidrolisat sebelum fraksinasi menghasilkan 11 pita protein pada bobot
molekul 13,880 - 68,512 kDa
5.2 Saran
1. Optimasi hidrolisis susu kedelai dengan enzim papain pada suhu yang lebih
tinggi (50-70 °C) dan inkubasi menggunakan shaker inkubator.
2. Isolasi peptida bioaktif dan analisis dengan menggunakan LCMS/MS untuk
mengetahui komposisi dan urutan asam amino yang terkandung dalam
hidrolisat susu kedelai.
46
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC]. (2005). Association Official Analytical Chemist’s Technical Standard.
Official Methods of Analysis.
Abubakar, A. (2004). Isolasi Peptida Anti Hipertensi dari Protein Susu. Journal
of the Indonesian Tropical Animal Agriculture, 29(3), 121–128.
Adnan, M. (1984). Kimia dan Teknologi Pengolahan Air Susu. Yogyakarta: Andi
Offset.
Akil, H. A. M. (2006). Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta: Departemen Ilmu Penyakit
Dalam. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Amnuaycheewa, P., & Mejia, E. G. De. (2010). Purification, Characterisation, and
Quantification of the Soy Allergen Pofilin (Gly m 3) in Soy Products. Food
Chemistry, 119(4), 1671–1680.
Asif, M., & Khodadadi, E. (2013). Medicinal Uses and Chemistry of Flavonoid
Contents of some Common Edible Tropical Plants, Journal of Paramedical
Science, 4(3), 119-38.
Astawan, M. (2004). Tetap Sehat dengan Produk Makanan Olahan. Surakarta:
Tiga Serangkai.
Astuti, R.M. (2012). Isolasi dan Karakterisasi Protein Kacang Kedelai, Kacang
Tanah, dan Kacang Bogor untuk Pembuatan Isolat Alergen [TESIS]. Bogor:
Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Badan Standarisasi Nasional. (1995). SNI 01-3922-1995 Kedelai. Jakarta: Badan
Standarisasi Nasional.
Badan Standarisasi Nasional. (1995). SNI 01 -3990-1995 Susu Kedelai. Jakarta:
Badan Standarisasi Nasional.
Baehaki, A., Lestari, S. D., & Romadhoni, A. R. (2015). Hidrolisis Protein Ikan
Patin Menggunakan Enzim Papain dan Aktivitas Antioksidan Hidrolisatnya.
Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia, 18(3), 230–239.
Beveridge, A. J. (1996). A Theoretical Study of The Active Sites of Papain and
S195C Rat Trypsin: Implications For The Low Reactivity of Mutant Serine
Proteinases. Protein Science, 5, 1355–1365.
47
Bhat, Z. F., Kumar, S., & Bhat, H. F. (2015). Bioactive peptides of animal origin:
a review. Journal Food Science Technology, 52, 5377–5392.
Bintang, M. (2010). Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga.
Buckle. (1987). Ilmu Pangan. Jakarta: Universitas Indonesia Press.
Campos, M. R. S., Gonzalez, F. P., Guerrero, L. C., & Ancona, D. B. (2013).
Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Peptides of Chia (Salvia
hispanica) Produced by Enzymatic Hydrolysis. International Journal of
Food Science, doi: 10.1155/2013/158482.
Cushman, D. W., Cheung, H. S., & Brunswick, N. (1971). Concentrations of
angiotensin-converting enzyme in tissues of the rat, 250.
Chalid, S. Y., Nurbayti, S., & Pratama, A. F. (2018). Karakterisasi Dan Uji
Aktivitas Protein Susu Kerbau (Bubalus Bubalis) Fermentasi Sebagai
Angiotension Converting Enzyme (ACE) Inhibitor. Jurnal Ilmu
Kefarmasian Indonesia. 16(2), 214-224.
Depkes. (2006). Pharmaeceutical Care Untuk Penyakit Hipertensi. Jakarta.
Depkes. (2017). Sebagian Besar Penderita Hipertensi tidak Menyadarinya.
Diambil dari http://www.depkes.go.id/article/view/17051800002/sebagian-
besar-penderita-hipertensi-tidak-menyadarinya.html. Diakses pada
12Agustus 2019. Pukul 19.22.
Dewayani, W. (2016). Karakteristik Fisikokimia Beberapa Varietas Kedelai dan
Pengolahannya Menjadi Tempe. In Prosiding Seminar Nasional Inovasi
Teknologi Pertanian (pp. 776–781). Banjarbaru.
Edesma, Ä. N., Migo, L. O. A., Amos, M. E. R., & Ecio, I. S. R. (2004).
Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Activity in Commercial
Fermented Products. Journal Agricultural and Food Chemistry, 52(6),
1504–1510.
Eisenthal, R. & Danson, M. J. (2002). Enzyme Assays: a practical approach. 2nd
ed. New York: Oxford University Press Inc.
Fatisa, Y., & Maslinda. (2011). Pengaruh Suhu Air Pada Proses Penggilingan
Kedelai (Glycin Max (L) Merril) Terhadap Kadar Protein Susu dengan
Metode Spektrofotometri Uv-Vis. Jurnal Photon, 2(1), 23–26.
48
Febrisiantosa, A., Purwanto, B. P., Isnafia, I., & Widyastuti, Y. (2013).
Karakteristik Fisik, Kimia, Mikrobiologi Whey Kefir dan Aktivitasnya
Terhadap Penghambatan Angiotensin Converting Enzyme (ACE). Journal
Teknologi dan Industri Pangan, 24(2), 147–153.
Fersht, A. (1985). Enzyme: Structure and Mechanism, 2nd Edition. Wr Freeman
and Company: New York.
Hamid, M. A., Otte, J., Gobba, C. D., Osman, A., & Hamad, E. (2016).
Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Activity and Antioxidant
Capacity of Bioactive Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysis of
Buffalo Milk Proteins. International Dairy Journal, 66, 91-98.
Hasnaliza, H., Maskat, M. Y., Wan, Aida, W. M., & Mamot, S. (2010). The
Effects of Enzyme Concentration, Temperature and Incubation Time on
Nitrogen Content and Degree of Hydrolysis of Protein Precipitate From
Cockle (Anadara Granosa) Meat Wash Water. International Food Research
Journal, 17, 147–152.
Hermes, B. D. (1998). Gel Electrophoresis of Proteins. New York: Oxford
University Press.
Hoyle, N. T., & Merrit, J. H. (1994). Quality of Fish Protein Hydrolysates from
Herring (Clupea harengus). Journal Of Food Science, 59(1), 1–4.
Ismahun, P. (2001). Peranan Angiotensin II Receptor Antagonist pada Penyakit
Jantung Hipertensi. Cermin Dunia Kedokteran.
Jamhari, Yusiati, L. M., Suryanto, E., Cahyanto, M. N., Erwanto, Y., &
Mugurama, M. (2013) Comparative Study on Angiotensin Converting
Enzyme Inhibitory Activity of Hydrolysate of Meat Protein of Indonesian
Local Livestocks. Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture,
38(1), 27-33.
Janson, J. C. (2011). Protein Purification: Principles, High Resolution, Method,
and Applications (3rd ed.). Canada: A John Willey & Sons.
Katili, A. S. (2009). Struktur dan Fungsi Protein Kolagen. Jurnal Pelangi, 2(5),
19–29.
Khirzin, M. H., Sukarno, Yuliana, N. D., Fawzya, Y. N., & Chasanah, E. (2015).
Aktivitas Inhibitor Enzim Pengubah Angiotensin (ACE) dan Antioksidan
Peptida Kolagen dari Teripang Gama (Stichopus variegatus). Jurnal
Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, 10(1), 27–35.
49
Kumar, D., & Chatli, M. K. (2016). Enzymatic Hydrolysis of Camel Milk Casein
and its Antioxidant Properties. Dairy Science & Technology, 96(7), 391–
404.
Kurniawati, I. T., & Estiasih, T. (2015). Efek Antihipertensi Senyawa Bioaktif
Dioscorin Pada Umbi- Umbian Keluarga Dioscorea : Kajian Pustaka. Jurnal
Pangan dan Agroindustri, 3(2), 402–406.
Kusumasari, S. (2017). Validasi Metode Deteksi Alergen Kedelai dan Aplikasinya
Dalam Pengembangan Isolat Protein Kedelai dan Susu Kedelai
Hipoalergenik [TESIS]. Institut Pertanian Bogor.
Laemmli. (1970). SDS PAGE (1st ed.). Fanglian He Carnegie Institution at
Stanford.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, L. A., & Randall, R. J. (1951). Protein
Measurement With The Folin Phenol Reagent. Journal Biology Chemistry,
193, 265–275.
Matra, N. F., Puspitasari, E., & Siswoyo, T. A. (2018). Hidrolisis Protein Isolat
Biji Melinjo menggunakan Alkalase Terimobilisasi dan Aktivitasnya
sebagai Antihipertensi. E-Jurnal Pustaka Kesehatan, 6(1), 18–24.
Mega, M. (2013). Perbandingan Kadar Protein dan Lemak Dalam Asi "X", Susu
Sapi Formula "Y" dan Susu Kedelai Formula "Z". Jurnal Ilmiah
Mahasiswa. Universitas Surabaya.
Meinlschmidt, P., Sussmann, D., Schweiggert-weisz, U., & Eisner, P. (2015).
Enzymatic Treatment of Soy Protein Isolates : Effects on The Potential
Allergenicity, Technofunctionality, and Sensory Properties. Food Science &
Nutrition, 4(1), 11–23.
Muchtadi, T. R., Sugiyono, & Ayustaningwarno, F. (2010). Ilmu Pengetahuan
Bahan Pangan. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Mulder, M. 1996. Basic Principles of Membrane Technology. Nederland: Kluwer
Academic Publishers.
Munthe, I., Isa, M., Winaruddin, Sulasmi, Herrialfian, & Rusli. (2007). Analisis
Kadar Protein Ikan Depik (Rasbora Tawarensis) di Danau Laut Tawar
Kabupaten Aceh Tengah. Jurnal Medika Veterinaria, 10(1), 67–69.
Nafrialdi. (2007). Antihipertensi. (Editor: Gunawan SG, Setiabudy R, Nafrialdi,
Ed.) (5th ed.). Gaya Baru.
50
Naga, S.W., Adiguna, B., Retnoningtyas, E.S., & Ayucitra, A. (2010). Koagulasi
Protein dari Ekstrak Biji Kecipir dengan Metode Pemanasan. Widya Teknik,
9(1), 1-11.
Nakamura, Y., Yamamoto, N., Sakai, K., Okubo, A., Yamazaki, S., & Takano, T.
(1995). Enzyme Inhibitors from Sour Milk. Journal of Dairy Science, 78(4),
777–783.
Natesh, R., Schwager S. L. U., Evans, H. R., Sturrock, E. D., & Acharya, K. R.
(2004). Structural Details on the Binding of Antihypertensive Drugs
Captopril and Enalapril at to Human Testicular Angiotensin I-Converting
Enzyme. Biochemistry, 43(27), 8718-8724.
Nirmagustina, D. E., & Rani, H. (2013). Pengaruh Jenis Kedelai Dan Jumlah Air
Terhadap Sifat Fisik, Organoleptik dan Kimia Susu Kedelai. Jurnal
Teknologi Industri dan Hasil Pertanian, 18(2), 168–174.
Nirmagustina, D. E., & Wirawati, C. U. (2014). Potensi Susu Kedelai Asam
(Soygurt) Kaya Bioaktif Peptida Sebagai Antimikroba. Jurnal Penelitian
Pertanian Terapan, 14(3), 158–166.
Nurrahman. (2015). Evaluasi Komposisi Zat Gizi dan Senyawa Antioksidan
Kedelai Hitam dan Kedelai Kuning. Jurnal Aplikasi Teknologi Pangan,
4(3), 89–93.
Ovissipour, M., Benjakul, S., Safari, R., & Motamedzadegan, A. (2010). Fish
Protein Hydrolysates Production From Yellowfin Tuna Thunnus Albacares
Head Using Alcalase And Protamex. International Aquatic Research, 2, 87–
95.
Palupi, N. S., Sitorus, S. R, & Kusnandar, F. (2015). Perubahan alergenitas
protein kacang kedelai dan. kacang bogor akibat pengolahan dengan panas.
Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 26(2) : 222-231.
Park, Y. W., & Nam, M. S. (2015). Bioactive Peptides in Milk and Dairy
Products : A Review Functionalities of Bioactive Peptides. Korean Journal
for Food Science an Animal, 35(6), 831–840.
Peter, K. (2011). Bagaimana Menggunakan Obat – Obat Kardiovaskular Secara
Rasional. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Picauly, P., Talahatu, J., & Mailoa, M. (2015). Pengaruh Penambahan Air Pada
Pengolahan Susu Kedelai. Jurnal Teknologi Pertanian, 4(1), 7–13.
Poedjiadi, A., & Supriyanti, T. (2006). Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.
51
Purnomo & Purnamawati, H. (2007). Budidaya dan Jenis Tanaman Pangan
Unggul. Jakarta: Penebar Swadaya.
Ranamukhaarachchi, S. (2012). Production and Fractionation of Antioxidant
Peptides from Soy Protein Isolate using Sequential Membrane
Ultrafiltration and Nanofiltration [Thesis]. University of Waterloo: Canada.
Redjeki, S. (2011). Proses Desalinasi dengan Membran. Direktorat Penelitian dan
Pengabdian Masyarakat (DP2M).
Restiani, R. (2016). Hidrolisis Secara Enzimatis Protein Bungkil Biji Nyamplung
(Calophyllum inophyllum) Menggunakan Bromelain. Biota. 1(3), 103−110.
Rho, S. J., Lee, J. S., Chung, Y. I., Kim, Y. W., & Lee, H. G. (2009). Purification
and Identification of an Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory
Peptide From Fermented Soybean Extract. Process Biochemistry. 44(4):
490–493.
Riyadi, P. H. (2018). Peptida Bioaktif Untuk Penurunan Tekanan Darah dari
Hidrolisa Limbah Perikanan : Kajian Pustaka. Jurnal Pengolahan &
Bioteknologi Hasil Perikanan., 7(1), 1–6.
Rohmawati, D., Djunaidi, I. H., & Widodo, E. (2015). Nilai Nutrisi Tepung Kulit
Ari Kedelai dengan Level Inokulum Ragi Tape dan Waktu Inkubasi
Berbeda. Jurnal Ternak Tropika, 16(1), 30-33.
Rossi, E., Hamzah, F., & Febriyani. (2016). Perbandingan Susu Kambing dan
Susu Kedelai dalam Pembuatan Kefir. Jurnal Peternakan Indonesia, 18(1),
13-20.
Rutherfurd, S. M. (2010). Methodology For Determining Degree Of Hydrolysis
Of Protein Hydrolysates: A Review. Journal AOAC International, 93(5),
1515–1522.
Santoso, B. (1994). Susu dan Yogurt Kedelai. Yogyakarta: Kanisius.
Shakeel, A., Saeed, M., Aslam, H. K. W., Naheed, N., Shoaib, M., Raza, M. S., &
Noor, A. (2015). Extraction of Soya Milk From Different Varieties of Soya
Beans and Comparative Study For Better Nutrition With Buffalo Milk.
Journal of Global Innovations in Agricultural and Social Sciences, 3(4):
146-151.
Shimakage, A., Shinbo, M., & Yamada, S. (2012). ACE Inhibitory Substances
Derived From Soy Foods. Journal Biology Macromolecule, 12(3), 72–80.
52
Siswandono & Soekardjo, B. (2008). Kimia Medisinal (2nd ed.). Surabaya:
Erlangga.
Smith, A. K & Circle, S. J. (1972). Soybeans Chemistry and Technology (1st ed.).
The AVI publishing Co. Inc.
Sudarmadji, S., Suhardi, & Haryono, B. (1996). Analisis Bahan Makanan dan
Pertanian. Yogyakarta: Liberty.
Suhartono, M. T. (1989). Enzim dan Bioteknologi. Bogor: Institut Pertanian
Bogor.
Susanti, R. & Hidayat, E. (2016). Profil Protein Susu dan Produk Olahannya.
Jurnal MIPA. 39(2), 98-106.
Thiquynhhoa, N., Minh, N. P., & Dao, D. T. (2014). Performance Enhancing Soy
Milk Extraction by Flavourzyme. International Journal Of Scientific &
Technology Research, 3(8), 101–106.
Triyono, A. (2010). Mempelajari Pengaruh Penambahan Beberapa Asam pada
Proses Isolasi Protein Terhadap Tepung Protein Isolat Kacang Hijau
(Phaseolus radiatus L.). In Seminar Rekayasa Kimia Dan Proses. Semarang.
Vallabha, V. S., & Kaul, P. (2013). Antihypertensive Peptides Derived from Soy
Protein by Fermentation. International Journal of Peptida Research and
Therapeutics, 20(2), 161-168.
Wang, W., Dia, V. P., Vasconez, M., de Mejia, E. G., & Nelson, R. L. (2008).
Analysis of Soybean Protein-Derived Peptides and The Effect of Cultivar,
Environmental Conditions, and Processing on Lunasin Concentration In
Soybean and Soy Products. Journal AOAC International, 91, 936–946.
Wang, X., Wu, S., Xu, D., Xie, D., & Guo, H. (2011). Inhibitor and Substrate
Binding by Angiotensin-converting Enzyme: Quantum Mechanical/
Molecular Mechanical Molecular Dynamics Studies. Journal of Chemical
Information and Modeling, 51(5): 1074–1082.
Wells, B. G., Dipiro, J. T., Schwinghammer, T. L., & Hamilton, C. W. (2000).
Pharmacotherapy Handbook (2nd ed.). Appleton and Lange, Stanford
Connecticut.
Westermeier. (2004). Electrohoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice.
New Jersey: John Wiley & Sons inc.
WHO. (2011). Data Global Status Report on Communicable Diseases.
53
Wibowo, M. S. (2010). Elektroforesis. Bandung: Sekolah Farmasi Institut
Teknologi Bandung.
Wijaya, S., & Rohman, L. (2001). Fraksinasi dan Karakterisasi Protein Utama Biji
Kedelai. Jurnal Ilmu Dasar. 2(1), 49–54.
Winarno, F. G. (1986). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka
Utama.
Winarno, F. G. (1995). Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Winarsi, H. (2010). Protein Kedelai dan Kecambah Manfaatnya Bagi Kesehatan.
Yogyakarta: Kanisius.
Wulandani, B. R. D., Rahayu, E. S., Marsono, Y., & Utami, T. (2017). Aktivitas
Antioksidan dan Angiotensin-I Converting Enzyme Inhibitor oleh Yogurt
dengan Ekstrak Daun Ficus glomerata. AGRITECH, 37(3), 246–255.
Yoshikawa, M. (2015). Bioactive Peptides Derived From Natural Proteins With
Respect To Diversity Of Their Receptors And Physiological Effects.
Elsevier Inc 72, 208-225. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.07.013
Yuniati, R., Nugroho, T. T., & Pusfita, F. (2015). Uji Aktivitas Enzim Protease
dari Isolat Bacillus Sp. Galur Lokal Riau. Jurnal Online Mahasiswa
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, 1(2), 116-122.
54
LAMPIRAN
Lampiran 1. Kadar Air
Sampel Ulangan Bobot (g) Kadar Air
(%)
Rata-rata
(%) SD
A B
Kacang
Kedelai
1,000 2,055 1,963 4,501 4,530 0,040
2,000 2,018 1,926 4,558
Susu
Kedelai
1,000 5,028 0,105 97,904 98,044 0,198
2,000 5,016 0,091 98,184
*Standar deviasi (SD): besar perbedaan dari nilai sampel terhadap rata-rata
A = Sampel awal
B = Sampel Akhir
Contoh perhitungan kadar air susu kedelai (Ulangan 1) :
Kadar air (%) =
=
= 4,501%
55
Lampiran 2. Kadar Abu
Sampel Ulangan Bobot (g) Kadar
Abu (%)
Rata-
rata (%) SD
A B C
Kacang
Kedelai
1,000 23,501 23,353 2,009 7,327 7,544 0,308
2,000 23,532 23,375 2,014 7,762
Susu
Kedelai
1,000 12,574 12,562 5,051 0,228 0,248 0,028
2,000 12,090 12,077 5,012 0,267
*Standar deviasi (SD): besar perbedaan dari nilai sampel terhadap rata-rata
A = Cawan + abu
B = Cawan kosong
C = Sampel awal
Contoh perhitungan kadar abu kacang kedelai (ulangan 1):
Kadar abu (%) =
=
= 7,327%
56
Lampiran 3. Kadar Protein
Sampel Ulangan Hasil Titrasi
(mL) %N
Kadar Protein
(%)
Rata-rata
(%) SD
Kacang
Kedelai
1 37,400 6,144 35,327 35,286 0,059
2 37,100 6,129 35,244
Susu
Kedelai
1 7,300 1,012 6,793 5,667 1,593
2 5,200 0,783 4,541
*Standar deviasi (SD): besar perbedaan dari nilai sampel terhadap rata-rata
Contoh Perhitungan Kadar Protein Kacang Ulangan 1:
Dik: Volume blanko : 0,2 ml
N HCl : 0,06 N
Faktor konversi (FK) Nitrogen : 5,75 (kedelai)
BM Nitrogen: 14
Kadar Protein (%) = ( – )
= –
x 100%
= 35,327 %
57
Lampiran 4. Kadar Protein Total
Sampel 0 jam
Konsentrasi
BSA Absorbansi
0 0,078
100 0,255
200 0,467
300 0,532
400 0,699
500 0,806
Sampel ulangan absorbansi Kadar Protein
(mg/L) Rata-Rata FP 5X
Standar
Deviasi
0 jam 1 0,432 227,714 232,714 1163,571 0,010
2 0,446 237,714
Contoh Perhitungan Kadar Protein Total Sampel 0 jam (Ulangan 1):
Y = 0,0014x + 0,1137
0,432 = 0,0014x + 0,1137
0,432 – 0,1137 = 0,0014 x
0,318/0,0014 = x
X = 227,714 mg/L * FP
X = 227,714 mg/L *5
X = 1163,571 mg/L
y = 0,0014x + 0,1137 R² = 0,9821
0
0,5
1
0 200 400 600
Ab
sorb
ansi
Konsentrasi BSA (mg/L)
Kurva Standar BSA
Series1
Linear (Series1)
58
Lampiran 5. Derajat Hidrolisis
Hidrolisat 0,1%
Sampel Ulangan Absorbansi
Kadar
Protein TCA
(mg/L)
Rata - Rata % DH SD
2 jam 1 0,239 84,294 84,882 7,295 0,001
2 0,241 85,471
4 jam 1 0,255 93,235 93,412 8,028 0,001
2 0,255 93,588
8 jam 1 0,260 96,647 97,529 8,382 0,002
2 0,263 98,412
16 jam 1 0,230 79,000 78,118 6,714 0,002
2 0,227 77,235
24 jam 1 0,186 53,118 53,118 4,565 0,000
2 0,186 53,118
Hidrolisat 0,2%
Sampel Ulangan Absorbansi
Kadar
Protein TCA
(mg/L)
Rata - Rata % DH SD
2 jam 1 0,282 119,111 116,611 10,022 0,006
2 0,273 114,111
4 jam 1 0,285 120,778 119,667 10,284 0,003
2 0,281 118,556
8 jam 1 0,298 128,000 128,000 11,001 0,000
2 0,298 128,000
16 jam 1 0,282 119,111 118,833 10,213 0,001
2 0,281 118,556
24 jam 1 0,249 100,778 100,500 8,637 0,001
2 0,248 100,222
59
Hidrolisat 0,5%
Sampel Ulangan Absorbansi
Kadar
Protein TCA
(mg/L)
Rata-rata %DH Standar
Deviasi
2 jam 1 0,241 96,333 91,611 7,873 0,012
2 0,224 86,889
4 jam 1 0,238 94,667 93,556 8,040 0,003
2 0,234 92,444
8 jam 1 0,241 96,333 101,889 8,757 0,014
2 0,261 107,444
16 jam 1 0,211 79,667 80,778 6,942 0,003
2 0,215 81,889
24 jam 1 0,196 71,333 74,389 6,393 0,008
2 0,207 77,444
Contoh Perhitungan Kadar Protein TCA Sampel 0,5% 2 jam (Ulangan 1):
Y = 0,0018x + 0,0676
0,241 = 0,0018x + 0,0676
0,241 – 0,0676 = 0,0018x
0,173/0,0018 = x
X = 96,333 mg/L
Contoh Perhitungan DH Sampel 0,5% 2 jam (rata – rata):
% DH =
% DH =
% DH = 7,873%
60
Lampiran 6. Analisis Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Inhibitor
Sampel Ulangan Absorbansi % Inhibisi Rata - Rata SD
0,1%
2 jam 1 0,167 -50,000
-48,684 0,001 2 0,165 -47,368
4 jam 1 0,102 35,526
32,895 0,003 2 0,106 30,263
8 jam 1 0,103 34,210
34,211 0,000 2 0,103 34,210
16 jam 1 0,095 44,737
39,474 0,006 2 0,103 34,210
24 jam 1 0,114 19,737
18,421 0,001 2 0,116 17,105
0,2%
2 jam 1 0,114 19,737
17,105 0,003 2 0,118 14,474
4 jam 1 0,094 46,053
40,789 0,006 2 0,102 35,527
8 jam 1 0,082 61,842
59,211 0,003 2 0,086 56,579
16 jam 1 0,101 36,842
35,526 0,001 2 0,103 34,210
24 jam 1 0,087 55,263
50,000 0,006 2 0,095 44,737
0,50%
2 jam 1 0,13 -6,579 -9,210 0,003
2 0,138 -11,842
4 jam 1 0,189 -78,947 -73,026 0,007
2 0,180 -67,105
8 jam 1 0,113 21,053 19,737 0,001
2 0,115 18,421
16 jam 1 0,090 51,316 51,316 0,000
2 0,090 51,316
24 jam 1 0,114 19,737 17,105 0,003
2 0,118 14,474
Blanko 1 0,052
0,001 2 0,054
Kontrol 1 0,129
0,000 2 0,129
61
Sampel Ulangan Absorbansi % Inhibisi Rata - Rata SD
0 jam 1 0,231 21,586 21,145 0,001
2 0,233 20,705
0,1% 2 jam 1 0,213 29,515 30,617 0,003
2 0,208 31,718
0,5% 2 jam 1 0,241 17,181 16,300 0,003
2 0,245 15,418
0,5% 4 jam 1 0,235 19,824 18,943 0,003
2 0,239 18,062
filtrat 1 0,278 0,881 2,203 0,004
2 0,272 3,524
retentat 1 0,232 21,145 20,264 0,003
2 0,236 19,383
kaptorpil 1 0,077 89,427 89,868 0,001
2 0,075 90,308
blanko 1 0,051 0,053 0,003
2 0,055
kontrol 1 0,281
0,280 0,001
2 0,279
Contoh Perhitungan % inhibisi Sampel 0 jam (ulangan 1):
% Inhibisi =
x 100
x 100
% inhibisi = 21,586%
62
Lampiran 7. IC50 Hidrolisat Susu Kedelai (Papain 0,2%, hidrolisis 8 jam)
Konsentrasi
(mg/L)
%
Inhibisi
99,686 51,101
49,843 44,053
24,921 38,106
12,461 35,242
6,230 33,260
IC50 = 89,640 mg/L
y = 0,1891x + 33,049
50 = 0,1891x + 33,049
50 – 33,049 = 0,1891x
16,951/0,1891 = x
X = 89,640 mg/L
y = 0,1891x + 33,049 R² = 0,98
0,000
10,000
20,000
30,000
40,000
50,000
60,000
0,000 50,000 100,000 150,000
% In
hib
isi
Konsentrasi (ppm)
IC50 Hidrolisat 0,2% 8jam
Series1
Linear (Series1)
63
Lampiran 8. Kadar Protein Hasil Fraksinasi
Konsentrasi
BSA
(mg/L)
Absorbansi
0 0,000
20 0,029
40 0,051
80 0,088
100 0,089
200 0,206
400 0,349
800 0,613
Sampel 0,2% Ulangan Absorbansi Kadar Protein (mg/L) Rata-rata SD
8 jam 1 0,480 572,500 578,750 0,007
2 0,490 585,000
Filtrat 1 0,168 182,500 181,250 0,001
2 0,166 180,000
Retentat 1 0,384 452,500 451,875 0,001
2 0,383 451,250
Contoh Perhitungan Kadar Protein Filtrat (Ulangan 1):
y = 0,0008x + 0,022
0,168 = 0,0008x + 0,022
0,168 – 0,022 = 0,0008x
0,146/0,0008 = x
X = 182,500 mg/L
y = 0,0008x + 0,022 R² = 0,9918
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 500 1000A
bso
rban
si
Konsentrasi BSA (mg/L)
Kurva Standar BSA
Series1
Linear (Series1)
64
Lampiran 9. Analisis Elektroforesis SDS PAGE
a. Marker
Jarak Pita Marker rf Marker BM Marker log BM
1,000 1,700 0,233 40,000 1,602
2,000 2,800 0,384 25,000 1,398
3,000 4,300 0,589 15,000 1,176
4,000 5,400 0,740 10,000 1,000
5,000 6,500 0,890 4,800 0,681
b. Sampel 0 jam
Jarak Pita rf sampel log BM BM
0,510 0,070 1,834 68,225
2,210 0,303 1,524 33,400
3,300 0,452 1,325 21,128
4,800 0,658 1,051 11,250
5,400 0,740 0,942 8,743
c. Sampel 2-16 jam
Jarak Pita rf sampel log BM BM
0,500 0,068 1,836 68,512
0,800 0,110 1,781 60,399
1,200 0,164 1,708 51,055
1,500 0,205 1,653 45,009
1,700 0,233 1,617 41,382
2,000 0,274 1,562 36,481
2,200 0,301 1,526 33,541
2,600 0,356 1,453 28,352
2,900 0,397 1,398 24,995
3,700 0,507 1,252 17,860
4,300 0,589 1,142 13,880
y = -1,3329x + 1,9274 …
0,00
2,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00Log
BM
Rf Marker
Kurva Standar Marker
Series1
Linear (Series1)
65
d. Sampel 24 jam
Jarak Pita rf sampel log BM BM
0,000 0,000 0,000 0,000
0,800 0,110 1,781 60,399
1,200 0,164 1,708 51,055
1,500 0,205 1,653 45,009
0,000 0,000 0,000 0,000
2,000 0,274 1,562 36,481
2,200 0,301 1,526 33,541
2,600 0,356 1,453 28,352
2,900 0,397 1,398 24,995
e. Sampel Filtrat
Jarak Pita rf sampel log BM BM
0,000 0,000 0,000 0,000
f. Sampel Retentat
Jarak Pita rf sampel log BM BM
0,500 0,068 1,836 68,512
66
Lampiran 10. Pembuatan Larutan Kerja SDS-PAGE (Laemmli,1971)
Larutan A (akrilamida dan N,N’ –metilen-bisakrilamid)
Sebanyak 30 g akrilamid dan 0.8 g N,N’ –metilen-bisakrilamid dilarutkan dengan
akuades dalam labu ukur 100 ml, kemudian ditambahkan akuades hingga tanda
tera. Larutan akrilamid dapat disimpan selama beberapa bulan dalam lemari
pendingin bersuhu 4 0C.
Larutan B (tris base dan SDS pH 8,8)
Sebanyak 18.17 g Tris base dan 4 mL SDS 10% dilarutkan dengan akuades.
Larutan ditepatkan pada pH 8.8 dengan HCl 1 N, kemudian dimasukkan ke dalam
labu ukur 100 ml dan ditambahkan akuades hingga tanda tera. Larutan dapat
disimpan selama beberapa bulan dalam lemari pendingin bersuhu 4 °C.
Larutan C (tris base dan SDS pH 6,8)
Sebanyak 6.05 g Tris base dan 4 mL SDS 10% dilarutkan dengan akuades dan
ditepatkan pada pH 6.8 dengan HCl 1 N. Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur
100 mL, kemudian ditambahkan akuades hingga tanda tera.
Ammonium Proksodisulfat (APS)
Dibuat baru setiap kali akan melakukan eletroforesis dengan cara melarutkan
0.025 g ammonium persulfat dalam 0.25 mL akuades kemudian di vortex.
Buffer Sampel
Sebanyak 12,5 mL larutan C, 30 mL SDS 10%, 10 mL gliserol, 5 mL 2-
mercaptoetanol, dan 10 mg bromophenol blue dilarutakan menggunakan akuades.
Larutan tersebut dimasukkan kedalam labu ukur 100 mL, kemudian ditamabahkan
akuades hingga tanda tera.
67
Buffer Elektroforesis
Sebanyak 3 g Tris base, 14.4 g glisin, dan 1 g SDS dilarutkan dengan akudes.
Ketiga larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 mL, kemudian
ditambahkan akuades hingga tanda tera.
Larutan Pewarna (staining)
Sebanyak 1 g coomasie brilliant blue R-250, 450 mL metanol, dan 100 mL asam
asetat glasial dilarutkan dalam 450 mL akuades. Apabila pita-pita belum terlihat
jelas, dapat dilakukan pewarnaan perak (silver staining).
Proses Pewarnaan Perak (Silver Staining)
a) Fiksasi
Reagen yang digunakan dalam tahap ini, dibuat dengan cara mencampurkan
25 ml etanol, 6 ml asam asetat, 25 μl formaldehid 37%, dan ditera hingga
mencapai volume 50 ml. Gel direndam dalam larutan tersebut selama 1 jam.
b) Wash
Reagen yang digunakan dalam tahap ini yaitu etanol 50%. Larutan ini dibuat
dengan cara mencampur 75 ml etanol dengan akuades sampai mencapai
volume 150 ml. Gel direndam selama 20 menit, dan dilakukan sebanyak tiga
kali perendaman. Setiap perendaman menggunakan 50 ml etanol 50%.
c) Pretreatment
Reagen yang digunakan dalam tahap ini, dibuat dengan cara melarutkan
0,016 gram sodium tiosulfat pentahidrat dalam akuades hingga volume akhir
mencapai 50 ml. Gel direndam selama satu menit.
68
d) Rinse
Pada tahap ini, gel direndam dalam akuades selama 20 detik dan dilakukan
sebanyak 3 kali perendaman.
e) Impregnated
Reagen yang digunakan dalam tahap ini, dibuat dengan cara melarutkan 0,1
gram perak nitrat (AgNO3) dan 37,5 μl formaldehid 37% dalam akuades
sampai volume mencapai 50 ml. Gel direndam dalam reagen ini selama 20
menit.
Larutan Penghilang Warna (distaning)
Sebanyak 100 mL metanol dan 100 mL asam asetat glasial dilarutkan dalam 800
mL akuades.
69
Lampiran 11. Pembuatan Larutan Kerja Uji ACE inhibitor
1. Buffer borat pH 8,3 takaran 100 ml (50 mM natrium borat dan 200 mM asam
borat)
Na-borat 50 mM = 0,05 M
M =
0,05 M =
g Na-Borat = 1,91 g
Asam Borat 200 mM = 0,2 M
M =
0,2 M =
g asam borat = 1,24 g
1,91 g Na-borat + 50 mL aquadest diaduk lalu ditambah 1,24 g asam borat
lalu ditambahkan aquadest sampai volume tepat 100 mL.
2. Substrat (HHL dan NaCl dalam Buffer Borat 10 ml)
HHL 7,6 mM dalam 5 mL buffer borat
M =
0,0076 M =
g HHL = 0,03263 g = 32,639 mg
70
NaCl 608 mM dalam 5 ml buffer borat
M =
0,608 =
g NaCl = 0,3556 g = 355,68 mg
32,639 mg HHl + 355,68 mg NaCl dilarutkan dalam 10 mL buffer borat
dingin lalu distirer
71
Lampiran 12. Pembuatan Larutan Kerja Lowry
1. Larutan A
NaOH 0,1 N 100 mL
M =
0,1 =
g = 0,4 g NaOH dilarutkan dalam 100 mL aquades
Larutan A dibuat dengan melarutkan 2 gram Na2CO3 ke dalam 100 mL
NaOH 0,1 N.
2. Larutan B
Na.K-tartrat 1% 10 mL
0,1 mL Na.K-tartrat ditambahkan dengan akuades hingga tepat 10 mL.
Larutan B dibuat dengan melarutkan 0,5 gram CuSO4.5H2O ke dalam 10 mL
NA.K-tartrat 1%.
3. Larutan C
Larutan C dibuat dengan mencampurkan 50 mL larutan A dengan 1 mL
larutan B.
72
Lampiran 13. Pembuatan Larutan Standar BSA
Larutan induk BSA dibuat dengan cara, ditimbang 0,01 g BSA dilarutkan
dalam 10 mL akuades. Larutan ini merupakan larutan induk BSA 1000 ppm.
Deret larutan standar BSA dibuat dengan menggunakan larutan induk BSA ke
dalam tabung reaksi gelap sehingga konsentrasinya 100-500 mg/L kemudian
ditambahkan 5 mL Larutan C lowry. Larutan divorteks dan didiamkan 5 menit,
kemudian ditambahkan 0,5 mL folin dan diukur secara spektrofotometri pada λ =
750 nm setelah 30 menit. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk
mengukur konsentrasi sampel.
73
Lampiran 14. Pembuatan Buffer Fosfat 0,02 M pH 7,5
NaH2PO4 0,02 M 100 mL
M =
0,02 =
g = 0,3120 gram NaH2PO4 dilarukan dalam 100 mL akuades
Na2HPO4 0,02 M 100 mL
M =
0,02 =
g = 0,3559 gram Na2HPO4 dilarutkan dalam 100 mL akuades
Buffer fosfat 0,02 M pH 7,5 dibuat dengan menambahkan 16 mL NaH2PO4 +
84 mL Na2HPO4 kemudian ditambahkan akuades 100 mL.
74
Lampiran 15. Pembuatan Larutan Trichloroacetic Acid (TCA) 10%
TCA 10% 100 mL
Massa =
Massa = 10 gram
Larutan TCA 10% dibuat dengan melarutkan 10 gram TCA ke dalam akuades
100 mL.
Lampiran 16. Perhitungan Konsentrasi Enzim : Substrat untuk Hidrolisis
1. Konsentrasi enzim papain 0,1%
Substrat protein yang dibutuhkan= 1.163,571 mg/L × 0,5 L= 581,788 mg
Enzim papain yang dibutuhkan = 0,1/100 × 581,788 mg= 0,582 mg
2. Konsentrasi enzim papain 0,2%
Substrat protein yang dibutuhkan = 1.163,571 mg/L × 0,5 L= 581,788 mg
Enzim papain yang dibutuhkan = 0,2/100 × 581,788 mg= 1,163 mg
3. Konsentrasi enzim papain 0,5%
Substrat protein yang dibutuhkan = 1.163,571 mg/L × 0,5 L= 581,788 mg
Enzim papain yang dibutuhkan = 0,5/100 × 581,788 mg= 2,908 mg
75
Lampiran 17. Sertifikat Analisis Papain
