I. PENDAHULUAN

A. Judul

Penentuan Konsentrasi Mematikan dan Analisis Organ terhadap Toksisitas

Methanol

B. Tujuan

1. Mahasiswa dapat menghitung LC50 (Lethal Concentration 50%) dari

pemberian methanol secara oral terhadap mencit (Mus musculus) pada

pengamatan 1 jam dan 24 jam.

2. Mahasiswa dapat melihat pengaruh LC50 (Lethal Concentration 50%) dari

konsentrasi pemberian methanol 100%, 80%, 60%, 40%, 20%, 10%, dan

5% terhadap mencit (Mus musculus) pada pengamatan 1 jam dan 24 jam.

3. Mengetahui efek toksisitas dari methanol terhadap organ mencit (Mus

Musculus).

II. METODE

A. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah botol, gavage

needle, gunting bedah, jarum pentul, kandang mencit, masker, papan

bedah mencit, penjapit (pinset), sarung tangan, spidol, dan syringe. Bahan

yang digunakan pada percobaan adalah mencit (Mus musculus) 10 ekor,

larutan methanol 0,5 ml dengan konsentrasi 100%, 80%, 60%, 40%, 20%,

10%, dan 5%, serbuk kayu, dan tissue.

B. Cara Kerja

1. Penentuan konsentrasi mematikan

Mencit disiapkan sebanyak 10 ekor, kemudian masing-masing

mencit dipegang dengan benar. Handling yang benar dilakukan dengan

memegang ekor mencit kemudian tubuh mencit dielus-dielus terlebih

dahulu. Bagian tengkuk (di belakang telinga) dicubit menggunakan

tangan kiri dan tubuh mencit dibalikkan dan diusahakan agar kepala

mencit tidak bisa bergerak-gerak lagi dan ekor mencit ditahan dengan

jari kelingking.

Pada saat mencit sudah dalam posisi yang tepat, larutan

methanol dengan konsentrasi 100%, 80%, 60%, 40%, 20%, 10%, dan

5% dimana masing-masing konsentrasi diambil sebanyak 0,5 ml dan

dimasukkan ke dalam mulut mencit menggunakan syringe dan gavage

needle. Pada saat larutan methanol dimasukkan ke dalam mulut mencit,

gavage needle dipastikan telah masuk hingga esofagus mencit,

kemudian larutan methanol dimasukkan secara perlahan (jangan sampai

mencit tersedak atau mati). Mencit yang telah dicekok dengan larutan

methanol kemudian ditandai (tagging) dengan spidol. Pengamatan

dilakukan selama 1 jam dan 24 jam, kemudian diamati dan dihitung

jumlah mencit yang mati. Data yang diperoleh dianalisis dengan

analisis probit SPSS.

Analisis probit dengan SPP dilakukan dengan input data,

kemudian dipilih analyze dan regression. Analisis probit pada bagian

covariate dimasukkan konsentrasi, response frequency dimasukkan

jumlah mencit yang mati, total observed dimasukkan jumlah mencit,

dan transporm dipilih log base 10.

2. Analisa Fisik Organ

Mencit yang mati diambil dan diletakan di atas papan bedah,

kemudian mencit diposisikan terlentang dan ditusuk keempat bagian

kaki mencit serta ekornya dengan jarum pentul. Mencit dibedah secara

vertikal dari bawah perut mencit hingga leher mencit, selanjutnya kulit

mencit dibuka dan ditusuk jarum pentul dibagian kanan dan kiri kulit.

Selaput yang menutup organ mencit dibuka dengan gunting bedah,

kemudian diamati perubahan organ yang terjadi setelah diberi perlakuan

methanol.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji toksisitas merupakan uji hayati yang berguna untuk menentukan tingkat

toksisitas dari suatu zat atau bahan pencemar. Senyawa kimia dikatakan bersifat

racun akut apabila senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka

waktu singkat (dalam hal ini 24 jam), sedangkan senyawa kimia dikatanya racun

kronis jika senyawa tersebut baru menimbulkan efek dalam jangka waktu yang

panjang karena kontak yang berulang-ulang walaupun dalam jumlah yang sedikit

(Harmita, 2009).

Uji toksisitas akut dapat menyediakan informasi tentang bahaya kesehatan

manusia yang berasal dari bahan kimia yang terpapar dalam tubuh pada waktu

pendek melalui jalur oral. Data uji akut juga dapat menjadi dasar klasifikasi dan

pelabelan suatu bahan kimia. Uji toksisitas akut berguna untuk mendapatkan

informasi tentang gejala keracunan, penyebab kematian, urutan proses kematian,

dan rentang dosis yang mematikan hewan uji (Lethal Dose 50% atau disingkat

LD50) suatu bahan. Nilai LC (Lethal Concentration) ditentukan untuk tujuan

penelitian nilai ambang batas yang layak di suatu lingkungan penelitian (Ibrahim

dkk., 2012).

Pengujian toksisitas suatu senyawa dibagi menjadi dua golongan, yaitu uji

toksisitas umum dan uji toksisitas khusus. Pengujian toksisitas umum meliputi

berbagai pengujian yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan efek umum

suatu senyawa pada hewan uji yang meliputi pengujian toksisitas akut, subkronik,

dan kronik. Pengujian toksisitas khusus meliputi uji potensiasi, karsinogenik,

mutagenik, teratogenik, reproduksi, kulit, mata, dan tingkah laku. Pengujian

toksisitas akut dapat menghasilkan nilai LD50 dan memberikan gambaran tentang

gejala-gejala ketoksikan terhadap fungsi penting, seperti gerak, tingkah laku, dan

pernapasan yang dapat menyebabkan kematian. Uji toksisitas subkronik dapat

memberikan efek yang berbaya yang timbul pada penggunaan obat secara

berulang dalam jangka waktu tertentu (Manggung, 2008).

Toksisitas akut didefinisikan sebagai efek yang ditimbulkan oleh senyawa

kimia atau obat terhadap organisme target. Efek toksik dari sediaan yang sama

dapat memberikan efek yang berbeda pada organ di dalam tubuh. Pengujian

toksisitas akut dilakukan dengan memberikan obat atau zat kimia yang sedang

diuji sebanyak satu kali atau beberapa kali dalam jangka waktu 48 jam. Kebanyak

toksisitas akut diarahkan pada penentuan LD50 dari suatu bahan kimia tertentu

yang dirancang untuk menentukan efek toksik suatu senyawa yang akan terjadi

dalam waktu yang singkat setelah pemberiannya dengan takaran tertentu

(Manggung, 2008). Menurut Angelina dkk. (2008), tujuan toksisitas akut adalah

untuk mendeteksi adanya toksisitas suatu zat, menentukan organ sasaran dan

kepekaannya, memperoleh data bahayanya setelah pemberian suatu senyawa

secara akut dan untuk meperoleh informasi awal yang dapat diunakan untuk

menetapkan tingkat dosis yang diperlihatkan untuk uji toksisitas selanjutnya.

Letal dosis 50% (LD50) merupakan kalkulasi dosis suatu substansi yang

dapat menyebabkan kematian 50% populasi hewan percobaan dalam satuan

mg/kg berat badan. Pemberian secara per oral dilakukan dalam tes dikarenakan

pemberian secara per oral ini merupakan cara yang paling umum dilakukan untuk

memasukkan makanan ke dalam tubuh, sehingga menjadi indikator penting untuk

mendeteksi adanya keracunan (Bhhatarai dan Gramatica, 2011).

Takaran dosis yang dianjurkan paling tidak empat peringkat dosis, berkisar

dari dosis terendah yang tidak atau hampir tidak mematikan seluruh hewan uji

sampai dengan dosis tertinggi yang dapat mematikan seluruh atau hampir seluruh

hewan uji. Pada umumnya pengamatan dilakukan selama 48 jam, kecuali pada

kasus tertentu selama 7 sampai 24 hari. Pengamatan tersebut meliputi gejala-

gejala klinis seperti nafsu makan, bobot badan, keadaan mata dan bulu, serta

tingkah laku, jumlah hewan yang diamati, dan histopatologi organ. Pengujian

toksisitas ini bertujuan untuk mencegah kerugian terhadap kesehatan manusia dan

lingkungan (Manggung, 2008).

Menurut Manggung (2008), faktor-faktor yang berpengaruh terhadap LD50

sangat bervariasi antara individu satu dengan individu yang lain. Faktor-faktor

tersebut adalah sebagai berikut:

1. Spesies, strain, dan keragaman individu

Perbedaaan sistem detoksikasi spesies menyebabkan perbedaan nilai

LD50. Strain hewan percobaan menunjukkan perbedaan yang nyata dalam

pengujian toksisitas akut.

2. Jenis kelamin

Perbedaan jenis kelamin mempengaruhi toksisitas akut yang disebabkan

oleh pengaruh langsung dari kelenjar endokrin. Hewan jantan dan betina yang

sama dari strain dan spesies yang sama biasanya bereaksi terhadap toksikan

dengan cara yang sama, tetapi ada perbedaan kuantitatif yang menonjol dalam

kerentanan terutama pada tikus.

3. Umur

Hewan-hewan yang lebih muda memiliki kepekaan yang lebih tinggi

terhadap obat karena enzim untuk biotransformasi masih kurang dan fungsi

ginjal belum sempurna, sedangkan pada hewan yang sudah tua, kepekaannya

akan meningkat karena fungsi biotransformasi dan ekskresi sudah meningkat.

4. Berat badan

Penentuan dosis dalam pengujian toksisitas akut dapat didasarkan pada

berat badan. Pada spesies yang sama, berat badan yang berbeda dapat

memberikan nilai LD50 yang berbeda pula. Semakin besar berat badan maka

jumlah dosis yang diberikan semakin besar pula.

5. Cara pemberian

Letal dosis dipengaruhi juga oleh cara pemberian. Nilai terkecil diperoleh

dengan cara pemberian intravena dan berturut-turut meningkat dengan cara

pemberian intraperitonial, subkutaneus, dan peroral. Cara pemberian tertentu

mungkin diperlukan oleh suatu senyawa, berdasarkan pertimbangan agar

senyawa dapat mencapai suatu tingkat kadar awal yang tinggi di dalam daerah

yangdilokalisasikan, dan untuk menghindari terjadinya berbagai efek senyawa

itu pada suatu organ. Cara yang digunakan untuk pemberian suatu senyawa

dapat mengubah toksisitas senyawa itu.

6. Faktor lingkungan

Beberapa faktor lingkungan yang mempengaruhi toksisitas akut antara

lain adalah perkandangan hewan, temperatur, kelembaban nisbi, udara, iklim,

serta perbedaan siang dan malam. Meskipun demikian, nilai LD50 untuk

kebanyakan bahan kimia hanya sedikit dipengaruhi oleh faktor lingkungan ini.

7. Kesehatan hewan percobaan

Status hewan percobaan dapat memberikan respon yang berbeda

terhadap suatu toksikan. Kesehatan hewan percobaan sangat dipengaruhi oleh

kondisi hewan dan lingkungan. Malnutrisi dan infestasi parasit juga dapat

mempengaruhi nilai LD50. Hewan yang tidak sehat dapat memberikan nilai

LD50 yang berbeda dibandingkan dengan nilai LD50 yang didapatkan dari

hewan percobaan yang sehat.

8. Diet

Komposisi makanan hewan percobaan dapat mempengaruhi nilai LD50.

Komposisi makanan akan mempengaruhi status kesehatan hewan percobaan.

Defisiensi zat makanan tertentu dapat mempengaruhi nilai LD50.

Dosis respons dinyatakan dengan suatu indek Lethal Dose (LD50) dan Lethal

Concentration (LC50). LD50 adalah dosis tunggal dari suatu zat yang secara

statistik diharapkan dapat menyebabkan kematian sebanyak 50% dari binatang

percobaan selama 14 hari paparan. Contoh LD50 dari Acrylamid adalah 124 ppm,

artinya pada konsentrasi 124 ppm 50% dari binatang percobaan mati selama masa

percobaan 14 hari. OSHA (Occupational Safety and Health Administration)

secara lebih spesifik mendefiniskan LD50 dan LC50 sebagai berikut LD50

merupakan dosis mematikan yang diekspresikan dalam mg/kg massa, yang dapat

menyebabkan kematian hewan uji sebanyak 50%, sedangkan LC50 merupakan

konsentrasi mematikan yang ditunjukkan dalam mg/L atau ml/m3 yang dapat

meneyabbkan kematian sebanyak 50% hewan uji selama 14 hari (Ariens, 1986).

Penentuan LC50 dengan derajat kepercayaan 95% dilakukan dengan

pengolahan data mortalitas menggunakan analisis probit. Nilai LC50 diperoleh

dengan cara terlebih dahulu dilakukan penghitungan mortalitas dengan cara

menghitung akumulasi mati dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati (total) dikali

100%. Grafik dibuat dengan log konsentrasi sebagai sumbu x terhadap mortalitas

sebagai sumbu y. Nilai LC50 merupakan konsentrasi dimana zat menyebabkan

kematian 50% yang diperoleh dengan memakai persamaan regresi linier y = a +

bx. Suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 µg/ml untuk ektrak

dan < 30 µg/ml untuk suatu senyawa (Juniarti dkk., 2009).

Menurut Meyer dkk. (1982), senyawa uji dikatakan toksik jika harga LC50

lebih kecil dari 1000 μg/mL. Penentuan potensi bioaktif dilakukan dengan

membandingkan nilai LC50 masing-masing ekstrak dengan ketentuan LC50 < 30

ppm ekstrak berpotensi sebagai antikanker (sitotoksik), LC50 : 30-200 ppm ekstrak

berpotensi sebagai antimikroba, LC50 : 200-1000 ppm ekstrak berpotensi sebagai

pestisida.

Menurut Akbar (2010), mencit (Mus musculus L.) termasuk mamalia

pengerat (rodensia) yang cepat berkembang biak, mudah dipelihara dalam jumlah

banyak, variasi genetiknya cukup besar serta sifat anatomisnya dan fisiologisnya

terkarakteristik dengan baik. Mencit yang sering digunakan dalam penelitian di

laboratorium merupakan hasil perkawinan tikus putih “inbreed” maupun

“outbreed”. Berdasarkan hasil perkawinan sampai generasi 20 akan dihasilkan

strain-strain murni dari mencit. Klasifikasinya adalah sebagai berikut :

Kingdom : AnimaliaPhylum : Chordata Sub phylum : Vertebrata Class : Mammalia Ordo : RodentiaSub ordo : Myoimorphia Family : Muridae Genus : Mus Species : Mus musculusMencit (Mus musculus L.) memiliki ciri-ciri berupa bentuk tubuh kecil,

berwarna putih serta memiliki siklus estrus teratur yaitu 4-5 hari. Kondisi ruang

untuk pemeliharaan mencit (Mus musculus L.) harus senantiasa bersih, kering,

dan jauh dari kebisingan. Suhu ruang pemeliharaan juga harus dijaga kisarannya

antara 18-19ºC serta kelembaban udara antara 30-70% (Akbar, 2010).

Mencit betina dewasa dengan umur 35-60 hari memiliki berat badan 18-35

gram. Lama hidupnya 1-2 tahun atau dapat mencapai 3 tahun. Masa reproduksi

mencit betina berlangsung 1,5 tahun. Mencit betina ataupun jantan dapat

dikawinkan pada umur 8 minggu. Lama kebuntingan 19-20 hari dengan jumlah

anak mencit rata-rata 6-15 ekor dengan berat lahir antara 0,5-1,5 gram (Akbar,

2010).

Mencit sering digunakan dalam penelitian dengan pertimbangan hewan

tersebut memiliki beberapa keuntungan yaitu siklus hidupnya relatif pendek, daur

estrusnya teratur dan dapat dideteksi, periode kebuntingannya relatif singkat,

variasi sifat-sifatnya tinggi, mudah dipelihara di laboratorium, dan mempunyai

anak yang banyak serta terdapat keselarasan pertumbuhan dengan kondisi

manusia (Akbar, 2010). Mencit secara khusus juga dipilih sebagai hewan uji

dalam pengujian toksisitas akut karena ukurannya kecil sehingga mudah

dilakukan handling, pemberian materi mudah dilakukan dengan berbagai rute, dan

menunjukkan waktu paruh metabolisme berbagai bahan aktif yang tidak terlalu

lama untuk dapat diamati. Keuntungan lainnya adalah sebagai sesama mamalia,

fisiologi mencit diperkirakan sesuai atau identik dengan manusia (Kusumawati,

2004).

Pengelolaan hewan percobaan secara keseluruhan dapat dilakukan melalui

cara memegang hewan serta cara penentuan jenis kelaminnya yang juga perlu

diketahui. Cara memegang hewan dari masing-masing jenis hewan berbeda-beda

yang ditentukan oleh sifat hewan, keadaan fisik (besar atau kecil), serta tujuannya.

Kesalahan dalam cara memegangnya akan dapat menyebabkan kecelakaan atau

hips ataupun rasa sakit bagi hewan dan juga kesulitan bagi orang yang

memegangnya (Sulaksono, 1992).

Pemberian obat oral

Kerugian

Kelebihan

Methanol adalah cairan tidak berwarna. Alkohol primer ini biasanya

digunakan sebagai pelarut industri dan pembersih (Parthasarathy dkk., 2006).

Aspartame merupakan senyawa yang digunakan sebagai pemanis buatan yang

dapat membentuk methanol ketika kelompok metil dari aspartame bereaksi

dengan enzim chymotrypsin dalam usus halus. Menelan methanol dengan sengaja

ataupun tidak dapat menyebabkan metabolisme asidosis yang parah dan gangguan

klinis seperti kebutaan (methanol tersekresi melalui kelenjar air mata), gangguan

syaraf serius, dan kematian. Methanol menjadi semakin diakui sebagai zat yang

merusak sel-sel hati dimana ia teroksidasi menjadi formaldehida dan kemudian

menjadi format. Proses ini disertasi dengan elevasi tingkat NADH dan

pembentukan anion superoksida, yang mungkin terlibat dalam peroksidasi lemak

(Parthasarathy dkk., 2006).

Menurut Ridwan (2013), pembedahan hewan uji merupakan salah satu

rangkaian dari penelitian in vivo yang menggunakan hewan seperti tikus, mencit,

kelinci maupun jenis hewan lain. Pada pelaksanaanya, perlu persiapan agar

pekerjaan lebih lancar dan perlakuan yang dilakukan tidak mempengaruhi hasil

penelitian. Peralatan yang digunakan jangan sampai terkontaminasi selain bahan

uji. Peralatan bedah yang perlu disiapkan sebelum pembedahan antara lain:

1. Gunting bedah dapat berbentuk lurus panjang, lurus pendek, dan bengkok.

2. Pinset, yang digunakan untuk memudahkan membedah dan memegang mencit.

3. Papan bedah, merupakan tempat fiksasi mencit yang akan dibedah.

4. Pins, berguna untuk memfiksasi mencit yang akan dibedah.

5. Perlatan pendukung seperti kamera, logbook, jas lab, glove, dan masker

Teknik yang perlu diperhatikan dalam pembedahan adalah mencit harus

dalam keadaan mati. Mencit selanjutnya diposisikan pada papan bedah dengan

menggunakan pins. Pembedahan dimulai dari bagian perut ataupun uterus

menggunakan gunting bengkok. Organ dalam diamati. Agar lebih akurat, organ

juga dapat dikeluarkan dan dipisahkan (Ridwan, 2013).

Hewan uji yang digunakan yaitu mencit yang berbadan sehat. Perlakuan

yang pada umumnya dilakukan sebelum pemberian materi uji adalah hewan

dipuasakan selama 3-4 jam dengan tujuan menyeragamkan bobot mencit. Mencit

harus dibedah agar dapat dilihat kondisi organ dalamnya (Rasyid dkk., 2012).

Hasil yang diperoleh dari percobaan LC50 dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil Jumlah Mencit yang MatiKonsentrasi Methanol Pengamatan 1 jam Pengamatan 24 jam Jumlah

100% 9 1 1080% 5 4 960% 2 4 640% 2 3 520% 3 0 3

10% 0 0 05% 0 4 4

Berdasarkan hasil pengamatan, diketahui bahwa pemberian methanol

dengan konsentrasi 100%, 80%, 60%, dan 40% terjadi kematian baik pada

pengamatan 1 jam maupun pada pengamatan 24 jam dengan jumlah kematian

mencit secara berturut-turut (dari konsentrasi 100%, 80%, 60%, dan 40%) adalah

10, 9, 6, dan 5 ekor. Pada pemberian methanol dengan konsentrasi 20%

ditemukan adanya kematian 3 ekor mencit pasca pengamatan 1 jam dan tidak lagi

terjadi kematian mencit pada pengamatan 24 jam sehingga jumlah total mencit

yang mati adalah 3 ekor. Pada pemberian methanol dengan konsentrasi 10% tidak

terjadi kematian pada mencit baik pada pengamatan 1 jam dan 24 jam, sedangkan

pada pemberian methanol dengan konsentrasi 5% tidak diperoleh kematian mencit

pada pengamatan 1 jam tetapi pada pengamatan 24 jam terjadi kematian mencit

sebanyak 4 ekor sehingga jumlah total mencit yang mati adalah 4 ekor.

Hasil tersebut SESUAI/TIDAK SESUAI DENGAN TEORI

Data mortalitas tersebut selanjutnya dianalisis dengan menggunakan

software SPSS PASW Statistics 18 melalui input tiga jenis variabel berupa data

konsentrasi sebagai covariates, jumlah mencit yang mati sebagai response

frequency dan jumlah mencit sebagai total observed, serta dilakukan analisis

statistik berupa regresi probit menggunakan transformasi log base 10 sehingga

diperoleh output berupa tabel confidence limit yang dapat digunakan untuk

menentukan nilai LC50. Berdasarkan tabel tersebut, dapat diamati bahwa

kemungkinan kematian 50% hewan coba terjadi melalui ………………..

Berdasarkan hasil pembedahan, diketahui bahwa pada mencit yang dicekok

dengan methanol konsentrasi 100% mengalami pembengkakan pada bagian hati

dengan perubahan warna menjadi hitam, pembengkakan lambung, serta bagian

usus mengalami lisis dan perubahan warna menjadi hitam. Perubahan yang terjadi

dapat diamati pada Gambar 1.

Gambar 1. Perbedaan Kondisi Organ Hati, Lambung, dan Usus Antara Mencit yang Tidak Diberi Perlakuan (Kiri) dan Mencit yang Diberi Perlakuan (Kanan) (Sumber : dokumen pribadi, 2015)

IV. KESIMPULAN

DAFTAR PUSTAKA

Akbar, B. 2010. Tumbuhan dengan Kandungan Senyawa Aktif yang Berpotensi sebagai Bahan Antifertilitas. Adabia Press, Jakarta.

Ariens, E. J. 1986. Toksikologi Umum Pengantar. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Bhhatarai, B. dan Gramatica. 2011. Oral LD50 Toxicity Modeling and Prediction of Per- and Polyfluorinated Chemicals on Rat and Mouse. Mol Divers 15(1): 467-476.

Harmita. 2009. Analisis Uji Hayati Toksisitas secara Mikrobiologi. Bahan Kuliah Toksikologi, IPB.

Ibrahim, M., Anwar, A., dan Ihsani, N. Y. 2012. Uji Lethal Dose 50% (LD-50) Poliherbal (Curcuma Xanthorriza, Kleinhovia Hospita, Nigella Sativa, Arcangelisia Flava dan Ophiocephalus Striatus) Pada Heparmin Terhadap Mencit (Mus Musculus). Research and Development Pt Royal Medicalink Pharmalab, Bogor.

Juniarti, Osmeli, D., dan Yuhernita. 2009. Kandungan Senyawa Kimia, Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) dan Antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazyl) dari Ekstrak Daun Saga. Makara Sains, 13(1): 50-54.

Kusumawati, D. 2004. Bersahabat dengan Hewan Coba. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Manggung, R. E. R. 2008. Pengujian Toksisitas Akut Lethal Dose (LD50) Ekstrak Etanol Buah Belimbing (Averrhoa bilimbi L.) pada Mencit (Mus musculus albinus). Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Bogor.

Meyer, B. N., Ferrigni, N. R., Putman, J. E., Jacsben, L. B., Nicols, D. E., dan McLaughlin, J. L. 1982. Brine Shrimp : a Convinient General Bioassay for Active Plant Constituent. Plant Medica, New York.

Parthasarathy, N. J., Kumar, R. S., Manikandan, S., dan Devi, R. S. 2006. Methanol-induced Oxidative Stress in Rat Lymphoid Organs. J Occup Health 48(1): 20-27.

Rasyid, M., Usmar, dan Subehan. 2012. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Atanol Lempuyang Wangi (Zingiber aromaticum Val.) pada Mencit. Majalah Farmasi dan Farmakologi 16(1):13-20.

Ridwan, E. 2013. Etika Pemanfaatan Hewan Perobaan dalam Penelitian Kesehatan. Jurnal Indon Med Assoc 63(3):112-116.

Sulaksono, M. E. 1992. Faktor Keturunan dan Lingkungan Menentukan Karakteristik Hewan Percobaan dan Hasil Suatu Percobaan. Biomedis, Jakarta.

LAMPIRAN

Gambar 2. Mencit (Mus musculus) yang digunakan sebagai kontrol (Sumber : dokumen pribadi, 2015)

Gambar 3. Sebelum pembedahan, setelah di beri perlakuan methanol 0,5 ml denagn konsentrasi 100 % (Sumber : dokumen pribadi, 2015)

Gambar 4. Mencit (Mus musculus) yang sudah diberi perlakuan methanol 0,5 ml dengan konsentrasi 100 % (Sumber : dokumen pribadi, 2015)