3. Replikasi Dna

Oleh :Maman SF., S.Si, M.Biomed.

Departemen Biologi Molekuler Fakultas KedokteranUniversitasPembangunan Nasional

• Sebelum pembelahan sel seluruh molekul DNA harus diduplikasi

• Duplikasi suatu molekul DNA menjadi 2 molekul DNA disebut replikasi

• Terdapat 3 model replikasi DNA:

1.Semikonservatif

2.Konservatif

3.Dispersif

REPLIKASI DNA

Replikasi DNA :

• M.S. Meselson & F.W. Stahl (1958)E. coli medium yang mengandung isotop 15N

(isotop berat) beberapa generasi

medium yang mengandung isotop 14N (isotop ringan)

sentrifugasi gradien densitas

DNA hibrid

DNA berat (15N)DNA ringan (14N)

Replikasi DNA :

Meselson & Stahl – 1958

Denaturasi & Renaturasi DNA :

• DNA dupleks dipanaskan pemisahan dan perubahan sifat fisik DNA

• Denaturasi peningkatan absorbans UV DNA efek hiperkromik

• Titik leleh (melting temperature = Tm) suhu pada saat setengah dari hiperkromasitas maksimum tercapai


Rel

ati

ve

ab

sorb

ance

at

260

nm

Per

cen

t h

yp

erch

rom

icit

y

• Kondisi yang dapat menyebabkan denaturasi: suhu yang tinggi, konsentrasi garam yang rendah, pH tinggi

• Apabila suhu larutan DNA, yang terdenaturasi oleh suhu tinggi, diturunkan sekitar 25 oC di bawah Tm terjadi renaturasi dupleks DNA annealing


• Mekanisme replikasi pada umumnya:– Kompleks duplikasi DNA berjalan

simultan dupleks DNA harus terpisah dan mengalami unwinding

– Berjalan dengan cepat – Akurat untuk menjamin integritas alur

penyampaian informasi genetik

Replikasi DNA :

Replikasi DNA :

• Replikasi DNA sirkular pada prokariota disebut sebagai replikasi (membentuk struktur seperti )

• Struktur menunjukkan adanya pemisahan untai DNA asal yang disertai sintesis DNA komplementer membentuk DNA baru

Replikasi DNA :

• Replikasi DNA dimulai dari suatu tempat khusus yang disebut origin of replications replikasi berjalan ke dua arah menjauhi tempat inisiasi gelembung replikasi

• Replication origins:

– Pada eukaryota: ratusan hingga ribuan banyak gelembung replikasi

– Pada prokariota: hanya satu satu gelembung replikasi

Replikasi DNA :

• Percabangan pada gelembung replikasi disebut garpu replikasi

• Garpu replikasi tempat “tumbuhnya” DNA baru

Replikasi DNA :

Tahap Elongasi

• Arah replikasi: 5’ 3’

• DNA polimerase hanya dapat menambahkan nukleotida pada ujung 3’ untai DNA yang baru perlu primer RNA

Replikasi DNA :

Replikasi DNA :

• Primer RNA– Mengawali sintesis DNA karena DNA

polimerase memerlukan ujung 3’-OH bebas untuk penambahan nukleotida

– Panjang primer tergantung spesies berkisar 1-60 nukleotida

– Sintesis primer RNA dikatalisis oleh primase dan RNA polimerase

Replikasi DNA :

Primer RNA :– Primase sintesis primer RNA pada lagging

strand– Primase & RNA polimerase bekerja sinergistik

sintesis primer RNA pada leading strand– Setelah sintesis DNA berjalan primer RNA

disingkirkan dan diganti dengan basa DNA oleh DNA polimerase

Replikasi DNA :

Mengawali sintesis DNA dengan RNAMengawali sintesis DNA dengan RNA

• Arah replikasi kedua untai DNA adalah searah kedua untai DNA disintesis dengan cara yang berbeda (semidiskontinu):– Leading strand: sintesis berjalan dari 5’ 3’

secara kontinu sesuai arah garpu replikasi– Lagging strand: sintesis berjalan dari 5’ 3’

secara diskontinu dengan cara “back & fill” disebut fragmen Okazaki

Replikasi DNA :

21

REPLIKASI DNA

Replikasi DNA :

• Fragmen Okazaki:– Pada E.coli: ± 1000-2000 nukleotida

– Pada eukaryota: 100-200 nukleotida

– Disambung oleh DNA ligase

Replikasi DNA :

• DNA ligase– Menyambung fragmen Okazaki– Mengkatalisis pembentukan ikatan

fosfodiester antara ujung 3’-OH pada DNA yang satu dengan ujung 5’-P pada DNA yang lain

– Perlu energi dari hidrolisis:• NAD+ NMN+ + AMP (pada E. coli)• ATP PPi + AMP (pada eukariota)

Replikasi DNA :

Replikasi DNA :

• DNA polimerase mengkatalisis sintesis untai DNA yang baru

• Komponen yang diperlukan untuk reaksi polimerisasi:

– dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

– Mg2+

– Primer RNA (ujung 3’-OH bebas)

– Cetakan (template) DNA

Replikasi DNA :

• Reaksi polimerisasi terjadi melalui serangan nukleofilik ujung 3’ terhadap atom P pada nukleotida trifosfat

• Pada saat nukleotida trifosfat ditambahkan terlepas 2 molekul fosfat yang disertai energi eksorgenik mendorong energi endorgenik untuk pembentukan ikatan antar nukleotida

DNAn + dNTP DNAn+1 + PPi

Replikasi DNA :

Replikasi DNA :

Replikasi DNA Prokariota

Tahap Inisiasi

• Replikasi dimulai pada daerah OriC

• Beberapa protein terlibat pada tahap inisiasi replikasi

Replikasi DNA Prokariota :

DnaA terikat pada situs 9 nt

OriC terbuka pada daerah AT-rich

pengikatan kompleks DnaB (helikase)-DnaC DnaC-DnaC

unwinding DNA

(dipertahankan oleh SSBP)

pembentukan primer RNA

Replikasi DNA


Tahap Inisiasi


Tahap Inisiasi• Protein yang diperlukan pada inisiasi

replikasi DNA:– DnaA membuka heliks DNA pada OriC– DnaB (helikase) unwinding DNA

• memerlukan ATP

Tahap Inisiasi– DnaB (helikase)

• pd prokariota ada 2: helikase II (utk lagging strand) & prot Rep (utk leading strand)

Helikase IIProtein Rep

Leading strand

Lagging strand

3’

5’

5’

3’


Tahap Inisiasi– SSBP (single stranded binding protein)

mempertahankan DNA tetap dalam bentuk untai tunggal• Tidak perlu ATP

Helikase IIProtein Rep

3’

5’

5’

3’

SSBP


– DnaC diperlukan untuk pengikatan DnaB pada OriC

– DnaG (primase) sintesis primer RNA

– DNA girase (DNA topoisomerase II) membentuk negative supercoiled DNA untuk membebaskan tegangan torsional yang disebabkan oleh aktivitas helikase membantu proses unwinding berikutnya



Tahap Elongasi

• Sintesis DNA dikatalisis oleh enzim DNA Polimerase

• Pada prokariota ditemukan 3 tipe DNA polimerasi: DNA polimerase I, II dan III

• Fragmen Okazaki disambung oleh DNA ligase


• DNA Polimerase I– Diisolasi dari E.coli oleh Arthur Kornberg

(1957)

– Merupakan rantai polipeptida tunggal

– BM 103 kD

N C

fragmen kecil fragmen besar (fragmen Klenow)

Eksonuklease 5’3’

Eksonuklease 3’5’

Polimerase


DNA Polimerase I :

– Aktivitas:

• Polimerase 5’ 3’:

–Penambahan basa yang komplementer dengan cetakan

–Mensintesis DNA ± 20 nukleotida

–Kecepatan: 10 nukleotida/detik

–Tingkat kesalahan 1 x 10-4


DNA Polimerase I :

– Aktivitas:

• Proof reading: eksonuklease 3’ 5’

–Diaktifkan oleh nukleotida ujung 3’ yang tidak berpasangan

Hidrolisis oleh eksonuklease 3’ 5’


DNA Polimerase I :

– Aktivitas:

• Proof reading: eksonuklease 3’ 5’

–Mencegah kesalahan selama proses replikasi

–Tingkat kesalahan 1 x 10-4


DNA Polimerase I :

– Aktivitas:

• Koreksi kesalahan: eksonuklease 5’3’

–Memotong hingga 10 nukleotida dari ujung 5’

–Berperan pada:

»Sistem perbaikan DNA pada mutasi akibat UV dan mutagen kimia

»Pemotongan primer RNA


Hidrolisis oleh eksonuklease 5’ 3’


• DNA Polimerase II– BM 90 kD

– Aktivitas:

• Polimerase

• Eksonuklease 3’5’

– Lebih berperan pada perbaikan DNA

– Kecepatan: 5-10 nukleotida/detik


• DNA Polimerase III– Merupakan enzim untuk replikasi DNA

kromosomal

– BM ± 900 kD

– Merupakan suatu holoenzim, terdiri atas >10 subunit protein subunit , , sebagai core enzyme


• DNA Polimerase III


• DNA Polimerase III– Aktivitas utama:

• Polimerisasi –Subunit –Sintesis DNA hingga ribuan nukleotida–Kecepatan: 1000 nukleotida/detik

• Eksonuklease 3’5’–Subunit –Editor utama replikasi DNA ketelitian

replikasi meningkat hingga 200 kali


• DNA Polimerase III– Aktivitas subunit lain:

• Subunit partisipasi pd inisiasi replikasi

• Subunit 2 molekul subunit ini m’cengkram DNA cetakan (sliding clamp)


• DNA Polimerase III– Aktivitas subunit lain:

• Subunit , , , ’, , loader clamp

• Subunit berperan pada interaksi subunit dengan subunit lain


• Koordinasi sintesis leading & lagging strand


• Koordinasi sintesis leading & lagging strand– 2 molekul DNA polimerase III didekatkan

oleh subunit – Besar lengkung DNA bertambah saat

sintesis lagging strand– Setelah fragmen Okazaki selesai

disintesis DNA polimerase lagging strand dipindahkan untuk mensintesis fragmen berikut


• Koordinasi sintesis leading & lagging strand

Lodish et al., Molecular Cell Biology, 4th edition


Tahap Terminasi• Pada lokus Ter (T) berseberangan

dengan OriC (Promotor)• Lokus Ter terdiri atas sekuens

GTGTGTTGT berikatan dengan protein Tus terminasi sintesis DNA

• Ikatan protein Tus Ter berinteraksi dengan DnaB menghambat aktivitas helikase DnaB


Tahap Terminasi• Replikasi searah jarum jam: melalui Ter E,

Ter D, Ter A dan berhenti pada Ter C atau Ter B atau Ter F

• Replikasi berlawanan arah jarum jam: melalui Ter F, Ter B, Ter C dan berhenti pada Ter A atau Ter D atau Ter E


Tahap Terminasi

Replikasi DNA Eukariota

• Siklus sel terbagi menjadi 4 fase: fase M, fase G1, fase S, fase G2

• Replikasi DNA eukariota berlangsung pada fase S siklus sel sebelum pembelahan sel pada fase M

Replikasi DNA Eukariota :

Tahap Inisiasi

• Replication origin pada eukariota: ARS (autonomously replicating sequence) terdiri atas 100-200 bp mengandung sekuens kaya-AT

• Protein Origin Recognition Complex (ORC) analog DnaA pada E. coli berikatan dengan ARS

Tahap Elongasi

• Ada 5 tipe DNA polimerase pada eukariota: DNA polimerase , β, , dan

• Sintesis leading dan lagging strand dilakukan oleh enzim polimerase yang berbeda


• DNA polimerase – Terdapat di nukleus; > 250 kD

– Aktivitas:

• Replikasi DNA 5’3’

–Sintesis 100-200 nukleotida lagging strand

–Kecepatan: 50 nukleotida/detik

• Primase

–Sintesis primer RNA: 5-15 nukleotida


• DNA polimerase – Terdapat di nukleus; 170 kD

– Aktivitas:


–Replikasi seluruh cetakan DNA sintesis leading strand


–Aktivitas proofread


• DNA polimerase – Terdapat di nukleus; 256 kD

– Aktivitas:


–Tidak membentuk kompleks dengan PCNA

–Berperan pada perbaikan DNA dan sintesis DNA pada celah antar fragmen Okazaki


• DNA polimerase – Aktivitas:


–Aktivitas proofread utama


–Berperan pada perbaikan kerusakan DNA akibat radiasi UV


• DNA polimerase – Polimerase yang paling kecil (36-38 kD)

– Fungsi: untuk perbaikan DNA

• DNA polimerase – Terdapat di mitokondria; 160-200 kD

– Fungsi: replikasi DNA mitokondria


• DNA polimerase – Sintesis leading strand mendahului sintesis

lagging strand setelah sintesis leading strand mencapai 2/3 dari kromosom mitokondria cetakan lagging strand terpapar mulai bereplikasi dengan arah yang berlawanan

– Leading strand menggantikan cetakan untuk lagging strand D-loop


• Replikasi DNA mitokondria


• PCNA– Merupakan protein trimerik– Hanya terdapat pada nukleus sel yang

berproliferasi– Berperan sebagai clamp kompleks DNA

polimerase - PCNA sintesis leading strand

– Analog subunit DNA polimerase III pada E.coli


• RNase H1 & FEN (Flap Endonuclease-1) – RNase H1 memotong primer RNA

meninggalkan ribonukleotida pada ujung 5’ di dekat DNA disingkirkan oleh FEN

– Celah yang terbentuk akan diisi oleh DNA polimerase


• Replication factor C (RFC)

– Berikatan dengan DNA polimerase – Membantu asosiasi DNA dengan PCNA

• Replication factor A (RFA) = Replication protein A (RPA)

– Analog SSBP pada replikasi DNA prokariota


• Kromosom linier menimbulkan masalah pada akhir replikasi (end replication problem):– lagging strand tidak dapat lengkap

disintesis– kromosom menjadi semakin pendek

setelah setiap kali replikasi

Dapat diatasi dengan telomer


• Pada akhir replikasi terdapat celah (gap) pada ujung lagging strand setelah primer RNA disingkirkan

• Untuk mengatasi masalah ini sel eukariota mereplikasi ujung kromosomnya disebut telomer


Telomer

• Mengandung sekuens berulang pada manusia: 5’-TTAGGG-3’

• Disintesis oleh telomerase


• Telomerase– Merupakan reverse transcriptase

– Mengandung komponen protein dan RNA

– RNA berfungsi sebagai cetakan

– Penambahan telomer mengimbangi pemendekan kromosom akibat replikasi

– Telomere binding protein melindungi ujung kromosom dari nuklease


3. Replikasi Dna

Documents

Transcript of 3. Replikasi Dna